專利名稱：一種間充質干細胞凍存液及其制備方法
一種間充質干細胞凍存液及其制備方法
技術領域本申請涉及一種間充質干細胞凍存液及其制備方法，屬于生物醫(yī)藥領域。
背景技術：
間充質干細胞mesenchymal stem cells, MSC是干細胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層。MSC最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調控和自我復制等特點而日益受到人們的關注。如間充質干細胞在體內或體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌、 內皮等多種組織細胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復。
間充質干細胞具有可以大量擴增的特點，擴增后的干細胞有時需要被凍存起來， 以備于科研及臨床隨時復蘇使用。在間充質干細胞的凍存中主要使用有毒性的二甲基亞砜 (DMSO)和動物血清等，DMSO具有毒性不可避免的會對細胞有一定的損傷，而動物血清則有動物病原污染的可能性，這都為細胞的制增加了操作步驟和不確定因素。因此，尋找一種可替代DMSO凍存細胞，并可以直接用于臨床的產品具有非常重要的意義。
海藻糖(Trehalose)是由兩個葡萄糖分子以1，1_糖苷鍵構成非還原性糖，自身性質非常穩(wěn)定，海藻糖對生物體具有神奇的保護作用，是因為海藻糖在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等惡劣環(huán)境條件下在細胞表面能形成獨特的保護膜，有效地保護蛋白質分子不變性失活，從而維持生命體的生命過程和生物特征。許多對外界惡劣環(huán)境，表現(xiàn)出非凡抗逆耐受力的物種，都與它們體內存在大量的海藻糖有直接的關系。和自然界中如蔗糖、葡萄糖等其它糖類，均不具備這一功能。這一獨特的功能特性，使得海藻糖除了可以作為蛋白質藥物、酶、疫苗和其他生物制品的優(yōu)良活性保護劑。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種不含有動物源蛋白和DMSO的間充質干細胞凍存液。
本發(fā)明的上述目的是通過如下技術方案實現(xiàn)的一種間充質干細胞凍存液，其由海藻糖、混合糖電解質注射液、ATP和人血清白蛋白組成。
在本發(fā)明中的間充質干細胞凍存液中，每IOOml混合糖電解質溶液中加入海藻糖的質量為2g 15g，優(yōu)選7. 5g ；加入ATP的質量為0. 05 0. 3g，優(yōu)選0. 15g ；加入人血清白蛋白的質量為0. 0Γ0. lg，優(yōu)選0. 025g。
本發(fā)明的另一目的是提供一種上述間充質干細胞凍存液的制備方法，包括如下步驟1)稱取海藻糖，溶解于混合糖電解質注射液。
2 )添加ATP和人血清白蛋白。
3)將混合液用細菌濾器過濾除菌，即為配制的間充質干細胞凍存液。
作為優(yōu)選，步驟3中的細菌濾器為0. 22 μιη細菌濾器。3
本發(fā)明的另一目的是提供一種上述間充質干細胞凍存液的使用方法，包括如下步驟
1)取已經過鑒定的間充質干細胞，用低糖DMEM加10%FBS培養(yǎng)，擴增培養(yǎng)至IO7個細胞時備用。2)間充質干細胞的凍存用已配制好的細胞凍存液懸浮細胞，按照IO6個/ml量用程序降溫盒凍存至_76°C冰箱內。在本發(fā)明中，細胞活率分析4周后取凍存細胞，37°C水浴復蘇。取ΙΟΟμ 細胞懸
液和100 μ^·臺盼蘭染液混合染色分析活率，結果顯示凍存細胞活率均達到90%以上。本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明創(chuàng)造了一種新的間充質干細胞凍存液，可在細胞膜外瞬間形成一層保護膜，保護細胞不受細胞外冰晶的損害。具有以下特點不含有動物源蛋白和DMSO ；高復蘇率>90%， 不影響干細胞的特性，細胞增殖不改變、細胞分化不改變；容易使用、穩(wěn)定性好。
具體實施例方式實施例1
用混合糖電解質溶液配制含有200Mm海藻糖、3mM ATP和0. 025%人血清白蛋白的凍存液，然后分別取已培養(yǎng)鑒定的臍帶間充質干細胞、脂肪間充質干細胞和骨髓間充質干細胞進行凍存實驗，結果表明對于三種間充質干細胞在-76°C溫度下保存一個月細胞活率均可維持在90%以上。
實施例2 本發(fā)明凍存液與含DMSO凍存液效果對比凍存液1 海藻糖 200mM ； ATP3mM ；
人血清白蛋白 0.025%; 按照上述濃度，將上述三種物質加入到混合糖電解質溶液中，配制凍存液1。凍存液2 =DMSO體積比10% ；
胎牛血清體積比10%; DMEM培養(yǎng)基體積比80% ； 按照上述比例配制混合凍存液2。操作步驟
1)將海藻糖、ATP、人血清白蛋白、混合糖電解質溶液按上述比例配制出凍存液1；將 DMS0、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基按上述比例配制出凍存液2 ；
2)分別用凍存液1和凍存液2凍存脂肪間充質干細胞、臍帶間充質干細胞、牙髓間充質干細胞，裝入2ml凍存管中，其中干細胞數(shù)量為IX 106/ml ；各配制5管，程序降溫盒凍存至-76°C低溫冰箱中；
3)細胞復蘇將已凍存好的細胞迅速放至37°C水浴鍋內，使其在廣2分鐘內復蘇，用臺盼蘭染色進行細胞計數(shù)，計算活率。每組結果取平均值如表1所述。表1 間充質干細胞在凍存液1和凍存液2凍存細胞復蘇后細胞活率的檢測結果
權利要求
1.一種間充質干細胞凍存液，由海藻糖、混合糖電解質注射液、ATP和人血清白蛋白組成。
2.如權利要求1所述的間充質干細胞凍存液，其中每IOOml混合糖電解質溶液中加入海藻糖的質量為2g-15g，優(yōu)選7. 5g。
3.如權利要求1所述的間充質干細胞凍存液，其中每IOOml混合糖電解質溶液中加入 ATP 的質量為 0. 05-0. 3g，優(yōu)選 0. 15g。
4.如權利要求1所述的間充質干細胞凍存液，其中每IOOml混合糖電解質溶液中加入人血清白蛋白的質量為0. 01-0. lg，優(yōu)選0. 025g。
5.一種如權利要求1-4任一項所述的間充質干細胞凍存液的制備方法，包括如下步驟1)稱取海藻糖，溶解于混合糖電解質注射液；2)添加ATP和人血清白蛋白；3)將混合液用細菌濾器過濾除菌，即為配制的間充質干細胞凍存液。
6.如權利要求5所述的方法，其中步驟3中的細菌濾器為0.22 μηι細菌濾器。
7.—種如權利要求1-4任一項所述的間充質干細胞凍存液的使用方法，包括如下步驟1)取已經過鑒定的間充質干細胞，用低糖DMEM加10%FBS培養(yǎng)，擴增培養(yǎng)至IO7個細胞時備用；2)間充質干細胞的凍存用已配制好的細胞凍存液懸浮細胞，按照IO6個/ml量用程序降溫盒凍存至-76 °C冰箱內。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種不含有動物源蛋白和DMSO的間充質干細胞凍存液，由海藻糖、混合糖電解質注射液、ATP和人血清白蛋白組成。該凍存液具有高復蘇率(>90%)，不影響干細胞的特性，細胞增殖不改變、細胞分化不改變；容易使用、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。本發(fā)明還公開了上述凍存液的制備方法。
文檔編號A01N1/02GK102511471SQ20111041968
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月15日 優(yōu)先權日2011年12月15日
發(fā)明者海泉, 鄭榆坤 申請人:成都清科生物科技有限公司