專利名稱：一種粉用型荸薺綜合脫毒快繁的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種粉用型荸薺綜合脫毒快繁的方法，具體涉及一種荸薺通過高溫培養(yǎng)促進(jìn)莖尖快速誘導(dǎo)進(jìn)行脫毒快繁的方法，屬于蔬菜種苗脫毒生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
學(xué)莽(Elocharis tuberosa (Roxb. ) Roem. ex schult)(另Ij名馬蹄、地栗)是莎草科荸薺屬宿根性水生草本植物，原產(chǎn)我國南部和印度。是我國南方地區(qū)的傳統(tǒng)特色水生蔬菜，具有很好的營養(yǎng)保健功能，也是我國重要的出口創(chuàng)匯蔬菜之一。而粉用型荸薺不但有上述功效，且荸薺粉可以作為紡織品的潤滑劑，遠(yuǎn)銷東南亞。長久以來，荸薺產(chǎn)量高，同時可以改良土壤作用，效益高，備受廣大農(nóng)戶歡迎。但由于荸薺長期采用種薺無性繁種，導(dǎo)致種性嚴(yán)重退化、植株矮化、抗病性和抗逆性減退，甚至不產(chǎn)生球莖或出現(xiàn)“雄荸薺”，使得整個荸薺產(chǎn)業(yè)受到極大的沖擊，嚴(yán)重影響了其在國際國內(nèi)市場上的競爭力。迄今為止，植物脫除病毒的方法比較多，例如溫湯處理脫毒、愈傷組織培養(yǎng)脫毒、 莖尖微嫁接脫毒以及組合方法脫毒。目前，對荸薺的研究大多集中在采后保鮮方面，荸薺組培研究相對較少，主要集中在利用莖尖快繁和球莖的再生研究。而國內(nèi)利用荸薺的莖尖途徑獲得脫毒苗的專利僅見CN1258436。該方法是取荸薺莖尖為外植體，直接接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在室溫20士2°C下，光照20001UX培養(yǎng)條件下，誘導(dǎo)出試管苗后，再次經(jīng)誘導(dǎo)形成球莖后進(jìn)行栽培生產(chǎn)。但該方法亦有不理想之處室溫誘導(dǎo)莖尖萌發(fā)的速度較慢，且關(guān)鍵點在于，相對高溫快速催芽，該方法脫除病毒的效果不夠理想。綜上所述，鑒于荸薺脫毒苗是目前國際上荸薺提純復(fù)壯、培育優(yōu)良品種最為有效的途徑，因此，廣東省在荸薺尤其是粉用型荸薺的實際生產(chǎn)上，迫切需要一種更好更便捷的方法來解決這一技術(shù)問題。為了改善粉用型荸薺球莖的質(zhì)量和產(chǎn)量這一難題，我們于2003 年開始對淀粉性質(zhì)的荸薺品種進(jìn)行脫毒復(fù)壯的研究，培育的無病毒荸薺苗經(jīng)田間對比試驗和農(nóng)民種植，產(chǎn)量明顯增加，尤其是淀粉含量顯著提高，備受荸薺粉加工廠青睞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是針對目前廣東省淀粉專用型荸薺病害嚴(yán)重，從而提出一種經(jīng)過消毒的預(yù)處理后，采取荸薺頂芽和側(cè)芽的莖尖為外植體，先高溫快速催芽誘導(dǎo)其萌發(fā)，再分化形成完整植株的方法，以便更加快捷獲得大量的健康粉用型荸薺脫毒苗。為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是 一種粉用型荸薺綜合脫毒快繁的方法，包括如下步驟
(1)外植體預(yù)處理將從田間收獲的荸薺置于陰涼處自然風(fēng)干一天后，用3 5%新潔爾滅噴施球莖表面后，用干凈紗布擦干后備用；
(2)外植體采集將經(jīng)過消毒預(yù)處理的球莖進(jìn)行如下處理用接種刀片將球莖的頂芽和健壯側(cè)芽從芽基部切下來，剝?nèi)プ钔鈱影糜谘b有無菌水的250ml玻璃瓶中，在無菌條件下，用0. 1%的升汞處理remin，無菌水沖洗3飛次后，接種到莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；(3)快速誘導(dǎo)培養(yǎng)將步驟(2)接種好的的材料置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，在高溫條件下培養(yǎng) Γ3天，莖尖快速萌發(fā)后，轉(zhuǎn)移到常溫下培養(yǎng)；
(4)增殖培養(yǎng)將步驟(3)萌發(fā)的莖尖接種在分化培養(yǎng)基上，分化出大量的叢芽；
(5)壯苗培養(yǎng)將步驟(4)分化出的叢芽置于壯苗培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2(Γ30天，獲得健壯的叢芽；
(6)生根培養(yǎng)將步驟(5)經(jīng)過壯苗的叢芽切成單株接種在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培
養(yǎng)；
(7)移栽當(dāng)步驟(6)的生根苗長至3 5cm，根數(shù)3條以上時，移栽到室外；
(8)病毒檢測利用PCR擴增技術(shù)檢測。所述的莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基為
MS基本培養(yǎng)基、添加激動素KT 0. Γ0. 3mg/L和維生素C Vcl. (Γ2. Omg/L，PH值為 5. 2，誘導(dǎo)培養(yǎng)方式固體培養(yǎng)。所述的增殖培養(yǎng)基為
MS基本培養(yǎng)基、添加6-芐氨基嘌呤6-BA1. (Γ2. Omg/L、萘乙酸NAAO. Γθ. 2mg/L和蔗糖 4(T60g/L，PH值為5. 8飛.2，增殖培養(yǎng)方式液體培養(yǎng)。所述的壯苗培養(yǎng)基為
MS基本培養(yǎng)基、添加6-芐氨基嘌呤6-BA0. 5 1. Omg/L、萘乙酸NAAO. Γθ. 5mg/L和蔗糖 3(T50g/L，PH值為5. 8 6. 2，壯苗培養(yǎng)方式固體培養(yǎng)。所述的生根培養(yǎng)基為
基本培養(yǎng)基為1/2MS、添加萘乙酸NAA0. Γ0. 3mg/L、活性炭AcO. 4 0. 6g/L和蔗糖 15 25g/L，PH值為5. 8 6. 2，生根培養(yǎng)方式為液體培養(yǎng)。步驟(6)所述的移栽，其采用的基質(zhì)為沙床培養(yǎng)。所述的高溫條件為溫度30 32°C，光照100(Tl5001ux。所述的培養(yǎng)基進(jìn)一步可改進(jìn)為，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的各組分及其含量為
(1)基本培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基，PH值為5.8 6. 2 ；
(2)莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基+KTO. lmg/L+ Vcl. Omg/L+卡拉膠6. O g/L ；
(3)增殖培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基 +6-BA2. Omg/L+NAAO. 2mg/L+50g/L ；
(4)壯苗培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基 + 6-BA1. Omg/L+NAAO. 5mg/L+ 蔗糖 40g/L 卡拉膠 6. O g/L ；
(5)生根培養(yǎng)基1/2MS培養(yǎng)基+NAAO.2mg/L+活性炭0. 5g/L+蔗糖25g/L。所述的滅菌處理是在無菌條件下，用0. 1%的升汞處理remin，無菌水沖洗3飛次。所述的移栽所采用的基質(zhì)為假植采用沙培，成活率達(dá)95%以上。本發(fā)明的有益效果是
(1)本發(fā)明莖尖誘導(dǎo)萌發(fā)的成活率高。以經(jīng)過消毒預(yù)處理后荸薺頂芽和側(cè)芽的莖尖為外植體，接種操作容易，滅菌處理后培養(yǎng)的成活率高達(dá)97%以上；
(2)本發(fā)明脫除病毒效果徹底。利用較高的溫度(3(T32°C)快速催芽與莖尖培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合，徹底解決了粉用型荸薺的病毒問題。利用ELISA和PCR病毒檢測技術(shù)，證明該方法獲得的組培苗帶毒率為0，獲得了 100%的脫毒種苗；(3)本發(fā)明大大提高粉用型荸薺的淀粉含量。該途徑獲得的荸薺脫毒種苗在繼代培養(yǎng)和栽培過程中，地上全草生長健壯、地下球莖個大、粉用型荸薺球莖的產(chǎn)量提高10%以上，淀粉含量提高2(Γ30%。據(jù)目前的情況，采用該方法很好的解決了粉用型荸薺品種種性退化問題，完全適合粉用型荸薺優(yōu)良品種改良和實際生產(chǎn)應(yīng)用。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，這些實施例僅用來說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。實施例1
以荸薺頂芽和側(cè)芽的莖尖為外植體
(1)外植體的選取與滅菌將從田間收獲的荸薺置于陰涼處自然風(fēng)干一天后，再用5% 新潔爾滅噴施球莖表面后，用干凈紗布擦干，用接種刀片將球莖的頂芽和健壯側(cè)芽從芽基部切下來，剝?nèi)プ钔鈱影?，置于裝有無菌水的250ml玻璃瓶中；在無菌條件下，用0. 1%的升汞處理^iin，無菌水沖洗3次；
(2)基本培養(yǎng)基用MS培養(yǎng)基，PH值為5.8；
(3)快速誘導(dǎo)培養(yǎng)將步驟(1)處理后的莖尖在無菌條件下，小心去除葉鞘，接種在MS 培養(yǎng)基、激動素ΚΤ0. lmg/L、維生素C 1. Omg/L和卡拉膠6. Og/L，誘導(dǎo)萌發(fā)芽；
(4)增殖培養(yǎng)將步驟(3)誘導(dǎo)形成的芽移至增殖培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出叢芽，分化培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、6-芐氨基嘌呤6-BA2. Omg/L、萘乙酸NAAO. 2mg/L和蔗糖50g/L ；
(5)壯苗培養(yǎng)將步驟(4)分化形成的叢芽切成2 3株接種在壯苗培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，壯苗培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、6-芐氨基嘌呤6-BA1. Omg/L、萘乙酸NAAO. 5mg/L、蔗糖40g/L 和卡拉膠6. 0 g/L ；
(6)生根培養(yǎng)將步驟(5)形成的叢芽接種在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基為:1/2MS培養(yǎng)基、萘乙酸NAAO. lmg/L、活性炭Ac 0. 5g/L和蔗糖25g/L ；
(7)移栽待生根苗長至3 5cm，植株根數(shù)5條以上時，進(jìn)行假植。其中，假植采用沙培；
(8)病毒檢測利用PCR擴增技術(shù)檢測。實施例2
以荸薺頂芽和側(cè)芽的莖尖為外植體
(1)外植體的選取與滅菌將從田間收獲的荸薺置于陰涼處自然風(fēng)干一天后，再用4% 新潔爾滅噴施球莖表面后，用干凈紗布擦干，用接種刀片將球莖的頂芽和健壯側(cè)芽從芽基部切下來，剝?nèi)プ钔鈱影?，置于裝有無菌水的250ml玻璃瓶中；在無菌條件下，用0. 1%的升汞處理5min，無菌水沖洗4次；
(2)基本培養(yǎng)基用MS培養(yǎng)基，PH值為6.0 ；
(3)快速誘導(dǎo)培養(yǎng)將步驟(1)處理后的莖尖在無菌條件下，小心去除葉鞘，接種在MS 培養(yǎng)基、激動素KT O.ang/L、維生素C 1.5mg/L和卡拉膠6.0g/L，誘導(dǎo)萌發(fā)芽；
(4)增殖培養(yǎng)將步驟(3)誘導(dǎo)形成的芽移至增殖培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出叢芽，分化培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、6-芐氨基嘌呤6-BA 1. 5mg/L、萘乙酸NAA 0. 15mg/L和蔗糖40g/L ；
(5)壯苗培養(yǎng)將步驟(4)分化形成的叢芽切成2 3株接種在壯苗培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，壯苗培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、6-芐氨基嘌呤6-BA 0. 5mg/L、萘乙酸NAA 0. lmg/L、蔗糖30g/L和卡拉膠6. 0 g/L ；
(6)生根培養(yǎng)將步驟(5)形成的叢芽接種在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基為:1/2MS培養(yǎng)基、萘乙酸NAA 0. lmg/L、活性炭Ac 0. 4g/L和蔗糖15g/L ；
(7)移栽待生根苗長至3 5cm，植株根數(shù)5條以上時，進(jìn)行假植，其中，假植采用沙培； (8)病毒檢測利用PCR擴增技術(shù)檢測。實施例3
以荸薺頂芽和側(cè)芽的莖尖為外植體
(1)外植體的選取與滅菌將從田間收獲的荸薺置于陰涼處自然風(fēng)干一天后，再用4% 新潔爾滅噴施球莖表面后，用干凈紗布擦干，用接種刀片將球莖的頂芽和健壯側(cè)芽從芽基部切下來，剝?nèi)プ钔鈱影糜谘b有無菌水的250ml玻璃瓶中；在無菌條件下，用0. 1%的升汞處理5min，無菌水沖洗3次；
(2)基本培養(yǎng)基用MS培養(yǎng)基，PH值為6.2 ；
(3)快速誘導(dǎo)培養(yǎng)將步驟(1)處理后的莖尖在無菌條件下，小心去除葉鞘，接種在MS 培養(yǎng)基、激動素ΚΤ0. :3mg/L、維生素C 2. Omg/L和卡拉膠6. Og/L，誘導(dǎo)萌發(fā)芽；
(4)增殖培養(yǎng)將步驟(3)誘導(dǎo)形成的芽移至增殖培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出叢芽，分化培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、6-芐氨基嘌呤6-BA1. Omg/L、萘乙酸NAAO. lmg/L和蔗糖60g/L ；
(5)壯苗培養(yǎng)將步驟(4)分化形成的叢芽切成2 3株接種在壯苗培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，壯苗培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、6-芐氨基嘌呤6-BA 0. 5mg/L、萘乙酸NAAO. lmg/L、蔗糖50g/ L和卡拉膠6. 0 g/L ；
(6)生根培養(yǎng)將步驟(5)形成的叢芽接種在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基、萘乙酸NAAO. ang/L、活性炭AcO. 6g/L和蔗糖20g/L ；
(7)移栽待生根苗長至3 5cm，植株根數(shù)5條以上時，進(jìn)行假植。其中，假植采用細(xì)河沙培養(yǎng)；
(8)病毒檢測利用PCR擴增技術(shù)檢測。實施例4
病毒檢測
對照材料從田間采集的荸薺地上全草、球莖為材料。處理材料以實施例1獲得的組培苗為材料。檢測結(jié)果如下表所示
權(quán)利要求
1.一種粉用型荸薺綜合脫毒快繁的方法，其特征在于包括如下步驟(1)外植體預(yù)處理將從田間收獲的荸薺置于陰涼處自然風(fēng)干一天后，用3 5%新潔爾滅噴施球莖表面后，用干凈紗布擦干后備用；(2)外植體采集將經(jīng)過消毒預(yù)處理的球莖進(jìn)行如下處理用接種刀片將球莖的頂芽和健壯側(cè)芽從芽基部切下來，剝?nèi)プ钔鈱影糜谘b有無菌水的250ml玻璃瓶中，在無菌條件下，用0. 1%的升汞處理remin，無菌水沖洗3飛次后，接種到莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；(3)快速誘導(dǎo)培養(yǎng)將步驟(2)接種好的的材料置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，在高溫條件下培養(yǎng) Γ3天，莖尖快速萌發(fā)后，轉(zhuǎn)移到常溫下培養(yǎng)；(4)增殖培養(yǎng)將步驟(3)萌發(fā)的莖尖接種在分化培養(yǎng)基上，分化出大量的叢芽；(5)壯苗培養(yǎng)將步驟(4)分化出的叢芽置于壯苗培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2(Γ30天，獲得健壯的叢芽；(6)生根培養(yǎng)將步驟(5)經(jīng)過壯苗的叢芽切成單株接種在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)；(7)移栽當(dāng)經(jīng)過步驟(6)生根培養(yǎng)的生根苗長至;T5cm，根數(shù)3條以上時，移栽到室外。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種粉用型荸薺綜合脫毒快繁的方法，其特征在于所述的莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、添加激動素KT 0. Γ0. ;3mg/L、維生素C Vcl. (Γ2. Omg/L和卡拉膠6. Og/L, PH值為5. 8^6. 2，誘導(dǎo)培養(yǎng)方式為固體培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種粉用型荸薺綜合脫毒快繁的方法，其特征在于所述的增殖培養(yǎng)所用的分化培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、添加6-芐氨基嘌呤6-BA1. (Γ2. Omg/L、萘乙酸 ΝΑΑ0. Γ0. 2mg/L和蔗糖4(T60g/L，PH值為5. 8 6. 2，增殖培養(yǎng)方式為液體培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種粉用型荸薺綜合脫毒快繁的方法，其特征在于所述的壯苗培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、添加6-芐氨基嘌呤6-BA 0. 5^1. 0mg/L、萘乙酸NAA 0. Γ0. 5mg/L、蔗糖3(T50g/L和卡拉膠6. 0g/L，PH值為5. 8 6. 2，壯苗培養(yǎng)方式為固體培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種粉用型荸薺綜合脫毒快繁的方法，其特征在于所述的生根培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基、添加萘乙酸ΝΑΑ0. Γ0. :3mg/L、活性炭AcO. 4^0. 6g/L和蔗糖15 25g/L，PH值為5. 8 6. 2，生根培養(yǎng)方式為液體培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種粉用型荸薺綜合脫毒快繁的方法，其特征在于步驟(6) 所述的移栽，其采用的基質(zhì)為沙床培養(yǎng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1一種粉用型荸薺綜合脫毒快繁的方法，其特征在于所述的高溫條件為溫度30 32°C，光照100(Tl5001ux。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、任意一項所述的一種粉用型荸薺綜合脫毒快繁的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的各組分及其含量為(1)基本培養(yǎng)基為MS，PH值為5.8 6. 2;(2)莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基+激動素ΚΤ0.lmg/L+維生素CVcl. 0mg/L+卡拉膠 6. 0 g/L ；(3)分化培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤6-BA2.Omg/L+萘乙酸NAAO. 2mg/L+50g/L ；(4)壯苗培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤6-BA1. Omg/L+萘乙酸NAAO. 5mg/L+蔗糖 40g/L+ 卡拉膠 6. O g/L ；(5)生根培養(yǎng)基1/2MS培養(yǎng)基+萘乙酸NAA0. 2mg/L+活性炭0. 5g/L+蔗糖25g/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種粉用型荸薺綜合脫毒快繁的方法，屬于蔬菜種苗脫毒生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，包括如下步驟將淀粉型荸薺球莖經(jīng)過消毒預(yù)處理后，采取荸薺頂芽和側(cè)芽的莖尖組織，經(jīng)高溫快速催芽的啟動培養(yǎng)、叢芽分化培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、PCR病毒檢測后，獲得大量的無病毒植株；本方法啟動速度快、病毒脫除效果徹底，月繁殖系數(shù)達(dá)4~8；本方法利用較高的溫度快速催芽與莖尖培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合，徹底解決了粉用型荸薺的病毒問題；該方法獲得的粉用型荸薺脫毒種苗在栽培過程中，地上全草生長健壯、地下球莖個大、球莖的產(chǎn)量提高10%以上，淀粉含量提高20~30%，很好的解決了粉用型荸薺品種種性退化問題，完全適合粉用型荸薺優(yōu)良品種改良和實際生產(chǎn)應(yīng)用。
文檔編號A01H4/00GK102487829SQ20111042466
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月19日
發(fā)明者楊俊賢, 楊曉仙, 羅青文, 譚嘉娜, 陳月桂 申請人:廣州甘蔗糖業(yè)研究所湛江甘蔗研究中心