專利名稱：小桐子高頻再生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物組織培養(yǎng)育苗技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及小桐子高頻再生方法。
背景技術(shù)：
小桐子(/airoMa curcas L )，又叫麻瘋樹、麻風(fēng)樹、膏桐、黑皂樹、木花生、油蘆子、亮桐、臭梧桐等，屬大戟科(^Modiaceae)麻瘋樹屬Uatrophi )，落葉灌木或小喬木，是一種多年生木本油料植物。小桐子原產(chǎn)美洲，廣泛分布于熱帶亞熱帶地區(qū)。小桐子可全株開發(fā)，其果實、枝、葉均能利用。小桐子種子含油率高，經(jīng)過加工可制成生物柴油。小桐子種子、樹皮、葉、根和乳汁中含有多種成分的生物藥源，可提取制作生物醫(yī)藥和生物農(nóng)藥。小桐子種子加工后的油餅蛋白質(zhì)含量較高，脫毒后可制作生物飼料，未脫毒的可制作優(yōu)質(zhì)的有機生物肥。另外，小桐子莖葉有毒，牲畜不吃，病蟲較少，不易燃燒， 可作為田間地邊的生物籬和防風(fēng)防火屏障。培育小桐子能源林，利用其種子提煉生物柴油是小桐子產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要方向。我國現(xiàn)有栽培和半野生的小桐子，其繁殖主要靠種子繁殖和扦插繁殖，繁殖的周期長，成本高。又因其為木本植物，采用常規(guī)育種來改變其遺傳性狀相當(dāng)困難，因此采用現(xiàn)代生物技術(shù)如轉(zhuǎn)基因技術(shù)等成為首選。一些國家和地區(qū)已經(jīng)開始了對小桐子進行了分子水平的育種工作。選育的優(yōu)良品種大量繁殖，通過組培方式快速繁殖小桐子將在小桐子選育種生產(chǎn)上有重要的應(yīng)用價值。目前，關(guān)于小桐子的組織培養(yǎng)及快速繁殖的報道較多，例如陸偉達(dá)、魏琴、唐琳等人發(fā)表《麻瘋樹愈傷組織的誘導(dǎo)及快速繁殖》(《應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報》2003年第9卷第2 期，第127 130頁)；陳金洪、高敏、黃記生等人發(fā)表的《麻瘋樹莖段離體培養(yǎng)及快速繁殖研究》(《廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)》2006年第37卷第3期，第22廣223頁)等，然而這些現(xiàn)有繁殖方法存在以下不足之處1.均采用不同的激素濃度組合誘導(dǎo)愈傷組織和芽分化，未涉及采用高濃度單激素誘導(dǎo)愈傷組織實驗；2.所采用不同激素配比中，單個激素的濃度均在0. 0廣3mg/ 1 ；3.均采用不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率40、0%，但不定芽的分化率相差極大，為0 80%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實施例所要解決的技術(shù)問題在于，提供一種小桐子高頻再生方法，以提升高頻再生率。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案一種小桐子高頻再生方法，包括如下步驟
獲得無菌苗步驟，選取飽滿的野生小桐子種子，剝?nèi)ネ鈿?，消毒處理后再剝離胚乳，將完整的種子胚和子葉接種在萌發(fā)培養(yǎng)基上萌發(fā)培養(yǎng)，獲得無菌苗；
愈傷組織初次誘導(dǎo)步驟，剪取無菌苗長勢好的子葉再切成子葉小塊并接入愈傷組織初次誘導(dǎo)培養(yǎng)基黑暗培養(yǎng)7 11天，該愈傷組織初次誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分為MS培養(yǎng)基+0. 5 8. 0mg/L吲哚丁酸，PH值5.8 ；
愈傷組織再次誘導(dǎo)步驟，取出經(jīng)過初次誘導(dǎo)的愈傷組織，轉(zhuǎn)入愈傷組織再次誘導(dǎo)培養(yǎng)基黑暗培養(yǎng)12 14天，該愈傷組織再次誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分為MS培養(yǎng)基+0.廣2.0 mg/L 6-芐基嘌呤+0. 05 1. 0 mg/L吲哚丁酸；
再生芽誘導(dǎo)步驟，取出經(jīng)過再次誘導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基光照培養(yǎng)直至獲得分化出的不定芽，該不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分為MS培養(yǎng)基+0. 5^1.5 mg/L 6-芐基嘌呤 +0. 05 0. 1 mg/L吲哚丁酸+(Tl. 0 mg/L的赤霉素；
生根培養(yǎng)步驟，選取莖葉生長均勻的不定芽切下，并在0. Γ2. 0 mg/L的吲哚丁酸或生根粉中浸泡5 120min，接入生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)，該生根培養(yǎng)基成分為1/2MS培養(yǎng)基 +0 2 mg/L吲哚丁酸；
煉苗移栽步驟，選擇長出至少3條長度超過3cm的根的生根苗，煉苗移栽。進一步地，萌發(fā)培養(yǎng)基主要包括MS培養(yǎng)基，pH值5. 8，每瓶培養(yǎng)基接2_3顆，接好的材料在M_26°C下先在暗培養(yǎng)3飛天再光照培養(yǎng)，光照12-16h/天，光照強度1600-2000 lx，光照培養(yǎng)10-12天后獲得無菌苗。進一步地，所述萌發(fā)培養(yǎng)基中還加入有3. 0%蔗糖和0. 7%瓊脂。進一步地，愈傷組織初次誘導(dǎo)步驟中，切好的子葉塊是正面朝上地接入愈傷組織初次誘導(dǎo)培養(yǎng)基。進一步地，愈傷組織初次誘導(dǎo)步驟中，將無菌苗長勢好的子葉放入墊有無菌濾紙的滅菌的盤中，加入無菌水，將子葉切成0. 3^0. 5cm2大小的小塊，愈傷組織初次誘導(dǎo)培養(yǎng)時，溫度為24 26°C。進一步地，愈傷組織再次誘導(dǎo)步驟中，培養(yǎng)溫度為24l6°C。進一步地，再生芽誘導(dǎo)步驟中，培養(yǎng)條件為溫度M 26°C，光照時間12h/天，光照強度1600 2000 Ix,培養(yǎng)20 30天。進一步地，生根及移栽步驟中，不定芽的切法為芽在結(jié)下廣4mm處平切。進一步地，煉苗移栽步驟，將選中的生根苗在自然光條件下過渡廣3星期，期間逐漸開蓋煉苗并移栽至溫室。進一步地，所述獲得無菌苗步驟中選用的野生小桐子種子為中國云南元謀野生小桐子種子。通過采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有如下有益效果
1.本發(fā)明中高頻的再生體系的建立可使轉(zhuǎn)化工作順利進行，獲得較高的遺傳轉(zhuǎn)化效率及效果。通過對小桐子種子萌發(fā)無菌苗的不同部位作為外植體進行再生，篩選出子葉正面朝上的再生頻率最高可達(dá)90%以上，從種子材料的獲得到再生植株需65 80天，外植體不受季節(jié)限制，為小桐子的遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。2.本發(fā)明方法是在無菌操作中完成，不受時間和地域限制，可高效提供小桐子的再生苗方法，可為大規(guī)模生產(chǎn)及分子育種等生物技術(shù)手段提供技術(shù)支持。3本發(fā)明中在愈傷組織培養(yǎng)階段用到了黑暗培養(yǎng)，這對于愈傷組織的生長有利， 能有效的抑制愈傷組織的褐化，且黑暗條件培養(yǎng)有利于細(xì)胞的脫分化。4本發(fā)明中用到了高濃度的單激素培養(yǎng)這一目前尚未見報道的技術(shù)手段，獲得了很好的愈傷組織及再生芽分化效果。
5本發(fā)明中在愈傷誘導(dǎo)步驟中分子葉正反面的朝向做了區(qū)分實驗，發(fā)現(xiàn)兩者存在差異，相比之下，正面朝上效果更佳。
具體實施例方式本發(fā)明提供一種小桐子高頻再生方法，包括如下步驟
51)獲得無菌苗步驟；
52)愈傷組織初次誘導(dǎo)步驟；
53)愈傷組織再次誘導(dǎo)步驟；
54)再生芽誘導(dǎo)步驟；
55)生根培養(yǎng)步驟；
56)煉苗移栽步驟。以下對各步驟進行具體描述。Si)獲得無菌苗步驟，采集中國本土野生小桐子種子，在本發(fā)明的實施方式中，選用云南元謀野生小桐子種子為材料，選取飽滿的種子，剝?nèi)ネ鈿?，進行消毒處理，消毒處理的具體操作如下
(1)用體積百分比75%的乙醇溶液浸泡30秒；
(2)無菌水洗4 5次;
(3)0.1% (質(zhì)量百分比)升汞浸泡3-10分鐘；
(4)倒出升汞，用無菌水洗4-6次，每次5分鐘；
(5)加入無菌水，浸泡2-4小時。消毒處理后的種子再剝離胚乳，將完整的種子胚和子葉接種在萌發(fā)培養(yǎng)基上萌發(fā)培養(yǎng)，萌發(fā)培養(yǎng)基通常采用MS培養(yǎng)基即可，必要時還可以視情況進一步加入3. 0%蔗糖和 0. 7%瓊脂，調(diào)節(jié)pH值5. 8，每瓶培養(yǎng)基接2-3顆，接好的材料在M_26°C下先在暗培養(yǎng)3、 天再光照培養(yǎng)，光照12-16h/天，光照強度1600-2000 Ix,通常地，光照培養(yǎng)10-12天后可得到無菌苗?？梢岳斫獾?，獲得無菌苗步驟并非本發(fā)明創(chuàng)新的核心所在，現(xiàn)有的各種選種、消毒處理及萌發(fā)培養(yǎng)的方式均可應(yīng)用于本發(fā)明。S2)愈傷組織初次誘導(dǎo)步驟，其具體操作如下(1)取滅菌的盤，墊上兩層無菌濾紙；
(2)取出無菌苗，用剪刀剪下長勢較好的子葉，放入盤中；
(3)然后加入少量無菌水，用刀將其切成0.3^0. 5cm2大??；
(4)將切好的子葉塊接入愈傷組織初次誘導(dǎo)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基成分為MS培養(yǎng)基+0.5 8. 0 mg/L吲哚丁酸，并調(diào)PH值5. 8 ；
(5)接種好的材料在溫度M 26°C下黑暗培養(yǎng)7 11天。在愈傷組織初次誘導(dǎo)步驟中，采用的愈傷組織初次誘導(dǎo)培養(yǎng)基相當(dāng)關(guān)鍵，其中，吲哚丁酸的濃度達(dá)到0. 5^8. Omg/L這一現(xiàn)有技術(shù)中從未使用過的高濃度。此外，將子葉塊接入愈傷組織初次誘導(dǎo)培養(yǎng)基時，子葉塊正面朝上還是反面朝上對對愈傷組織誘導(dǎo)及芽分化率誘導(dǎo)會有所影響，為確定該影響，進行了三組實驗，實驗數(shù)據(jù)如下表1所示。表1 子葉正、反面朝向?qū)Ψ只康挠绊慖 I . ::11^ii Ii ； mn . |
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III H II ··￥I: 51: Ι ^ II| Sl | ？Il ￥> IS3)愈傷組織再次誘導(dǎo)步驟，其具體操作如下
(1)取出黑暗培養(yǎng)的材料，轉(zhuǎn)入愈傷組織再次誘導(dǎo)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基成分為MS培養(yǎng)基 +0. Γ2. 0 mg/L 6-芐基嘌呤 +0. 05 1. 0 mg/L 吲哚丁酸；
(2)接入培養(yǎng)基中的材料在溫度24l6°C，黑暗培養(yǎng)12 14天。S4)再生芽誘導(dǎo)步驟，其具體操作如下
(1)將暗培養(yǎng)的愈傷組織取出轉(zhuǎn)入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基成分為MS培養(yǎng)基 +0. 5 1. 5 mg/L 6-芐基嘌呤+0. 05 0. 1 mg/L吲哚丁酸+(Tl. 0 mg/L的赤霉素；
(2)培養(yǎng)條件為溫度2416°C，光照時間為12h/天，光照強度為160(Γ2000lx，培養(yǎng) 2(Γ30天即獲得分化出的不定芽。S5)生根培養(yǎng)步驟，其具體操作如下
(1)選取莖葉生長均勻的不定芽切下，切法為芽在結(jié)下廣4mm處平切；
(2)并在0.廣2.0mg/L的吲哚丁酸或生根粉中浸泡5 120 min，接入生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)，該生根培養(yǎng)基成分為1/2MS培養(yǎng)基+0.3 mg/L吲哚丁酸；
S6)煉苗移栽步驟，選擇長出至少3條長度超過3cm的根的生根苗，進行煉苗移栽。下面結(jié)合幾個實例詳述描述本發(fā)明的實施方案。需要說明的是，下述實例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實例來限定本發(fā)明的保護范圍。實例1
本實例各步驟具體如下
Sl)獲得無菌苗步驟采集云南元謀野生小桐子種子，挑取飽滿的種子，剝?nèi)ネ鈿?，在體積百分比75%的乙醇溶液中浸泡30秒，再用無菌水沖洗2-3次，然后在0. 1%氯化汞中消毒 3-lOmin，用無菌水沖洗5_7次，再用無菌水浸泡2_4小時，然后剝?nèi)ヅ呷椋⊥暾呐吆妥尤~接種于MS培養(yǎng)基中，每瓶接2-3顆，23-26°C下暗培養(yǎng)2_4天后再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)10-12天， 得到無菌苗。S2)愈傷組織初次誘導(dǎo)步驟選取生長健壯，葉面平整均勻的無菌苗子葉，取滅菌的盤，墊上無菌濾紙，加入少量無菌水，切成0. 5cm2大小，子葉片形態(tài)學(xué)正面朝上接入愈傷組織初次誘導(dǎo)培養(yǎng)基置于M_26°C暗培養(yǎng)7天，所述愈傷組織初次誘導(dǎo)培養(yǎng)基為C4固體培養(yǎng)基，其成分為MS培養(yǎng)基+4. Omg/L的吲哚丁酸+3. 0%蔗糖+0. 7%瓊脂，pH5. 8。S3)愈傷組織再次誘導(dǎo)步驟將培養(yǎng)后的材料轉(zhuǎn)入愈傷組織再次誘導(dǎo)培養(yǎng)基Cl，
6置于M-26°C光照培養(yǎng)14天，光照強度為160(Γ2000 lx，所述愈傷組織再次誘導(dǎo)培養(yǎng)基Cl 成分為MS培養(yǎng)基+1. 5 mg/L 6-芐基嘌呤+0. 05 mg/L 3-吲哚丁酸+3. 0%蔗糖+0. 7%瓊脂，pH5. 8。S4)再生芽誘導(dǎo)步驟將愈傷組織轉(zhuǎn)出，接入不定芽分化培養(yǎng)基SR13，溫度控制在 24l6°C，光照時間為12h/天光照強度為1600 2000 lx，培養(yǎng)20 30天即獲得分化出的不定芽，所述不定芽分化培養(yǎng)基SR13成分為MS培養(yǎng)基+1.0 mg/L 6-芐基嘌呤+0. 1 mg/L吲哚丁酸+0. 5mg/L的赤霉素，附加3. 0%蔗糖、0. 7%瓊脂，ρΗ5· 8。S5)生根培養(yǎng)步驟將不定芽切下，切口選擇在結(jié)下2mm處，用濃度為1. 0 mg/L吲哚丁酸浸泡切口 5min后，接入生根培養(yǎng)基，所述生根培養(yǎng)基成分為1/2MS +0.3 mg/L吲哚丁酸，培養(yǎng)8 20天后生根率達(dá)90%以上；
S6)煉苗移栽步驟選取生長出3條以上長度超過3cm的根的生根苗，在自然光條件下過度廣3星期，逐漸開蓋煉苗并移栽至溫室。實例2
本實例的各步驟具體如下
Si)獲得無菌苗步驟采集云南元謀野生小桐子種子，挑取飽滿的種子，剝?nèi)ネ鈿?，在體積百分比75%的乙醇溶液中浸泡30秒，無菌水沖洗2-3次，然后在0. 1%氯化汞中消毒 3-lOmin，無菌水沖洗5_7次，然后用無菌水浸泡2_4小時后，再剝?nèi)ヅ呷椋⊥暾呐吆妥尤~，接種于MS培養(yǎng)基中，每瓶接2-3顆，23-260C暗培養(yǎng)2_4天后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)10-12天，得到無菌苗。S2)愈傷組織初次誘導(dǎo)步驟選取生長健壯，葉面平整均勻的無菌苗子葉，取滅菌的盤，墊上無菌濾紙，加入少量無菌水，切成0. 5cm2大小，子葉片形態(tài)學(xué)正面朝上接入愈傷組織初次誘導(dǎo)培養(yǎng)基，本實例中，所述愈傷組織初次誘導(dǎo)培養(yǎng)基為C2固體培養(yǎng)基，其成分為=MS培養(yǎng)基+0. 5 mg/L的吲哚丁酸+3. 0%蔗糖+0. 7%瓊脂，pH5. 8，置于M_26°C暗培養(yǎng)9天。S3)愈傷組織再次誘導(dǎo)步驟將培養(yǎng)后的材料轉(zhuǎn)入愈傷組織再次誘導(dǎo)培養(yǎng)基C11， 置于M-26°C光照培養(yǎng)14天，光照強度為160(Γ2000 lx，所述愈傷組織再次誘導(dǎo)培養(yǎng)基Cll 成分為=MS培養(yǎng)基+0. 5mg/L 6-芐基嘌呤+0. lmg/L 3-吲哚丁酸+3. 0%蔗糖+0. 7%瓊脂， ρΗ5· 8。S4)再生芽誘導(dǎo)步驟將愈傷組織轉(zhuǎn)出，接入不定芽分化培養(yǎng)基SR10，溫度控制在 24l6°C，光照時間為12h/天光照強度為1600 2000 lx，培養(yǎng)20 30天獲得不定芽，所述不定芽分化培養(yǎng)基SRlO成分為MS培養(yǎng)基+0. 5 mg/L 6-芐基嘌呤+0. 05 mg/L吲哚丁酸 +0. 25 mg/L 的赤霉素 +3. 0% 蔗糖 +0. 7% 瓊脂，ρΗ5· 8。S5)生根培養(yǎng)步驟將不定芽切下，切口選在結(jié)下2mm處，用濃度為1. 0 mg/L吲哚丁酸浸泡切口 5min后，接入生根培養(yǎng)基培養(yǎng)基，所述生根培養(yǎng)基培養(yǎng)基成分為1/2MS培養(yǎng)基+1 mg/L吲哚丁酸，培養(yǎng)8 20后生根率達(dá)90%以上；
S6)煉苗移栽步驟選取生長出3條以上長度超過3cm的根的生根苗，在自然光條件下過度廣3星期，逐漸開蓋煉苗并移栽至溫室。實例3
各步驟具體如下Sl)獲得無菌苗步驟采集云南元謀野生小桐子種子，挑取飽滿的種子，剝?nèi)ネ鈿ぃ皿w積百分比75%乙醇中浸泡30秒，無菌水沖洗2-3次，然后在0. 1%氯化汞中消毒3-lOmin，無菌水沖洗5-7次，然后，用無菌水浸泡2-4小時后剝?nèi)ヅ呷?，取完整的胚和子葉，接種于MS 培養(yǎng)基中，每瓶接2-3顆，2316°C暗培養(yǎng)2-4天后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)10-12天，得到無菌苗。S2)愈傷組織初次誘導(dǎo)步驟選取生長健壯，葉面平整均勻的無菌苗子葉，取滅菌的盤，墊上無菌濾紙，加入少量無菌水，切成0. 5 cm2大小，子葉片形態(tài)學(xué)正面朝上接入愈傷組織初次誘導(dǎo)培養(yǎng)基，置于M_26°C暗培養(yǎng)11天，所述愈傷組織初次誘導(dǎo)培養(yǎng)基為C6固體培養(yǎng)基，其成分為MS培養(yǎng)基+含8. 0 mg/L的吲哚丁酸+3. 0%蔗糖+0. 7%瓊脂，pH5. 8。S3)愈傷組織再次誘導(dǎo)步驟將培養(yǎng)后的材料轉(zhuǎn)入愈傷組織再次誘導(dǎo)培養(yǎng)基，置于 24j6°C光照培養(yǎng)14天，光照強度為160(Γ2000 lx，愈傷組織再次誘導(dǎo)培養(yǎng)基為C13培養(yǎng)基，其成分為MS培養(yǎng)基+2 mg/L 6-芐基嘌呤+0.1 mg/L 3-吲哚丁酸+3. 0%蔗糖+0. 7%瓊脂，pH5. 8。S4)再生芽誘導(dǎo)步驟將愈傷組織轉(zhuǎn)出，接入不定芽分化培養(yǎng)基SR17，溫度控制在 24l6°C，光照時間為12h/天，光照強度為160(Γ2000 lx，培養(yǎng)20 30天即獲得分化出的不定芽，所述不定芽分化培養(yǎng)基SR17成分為MS培養(yǎng)基+1.5 mg/L 6-芐基嘌呤+0. 05 mg/L 吲哚丁酸+0. 5 mg/L的赤霉素+3. 0%蔗糖+0. 7%瓊脂，pH5. 8。S5)生根培養(yǎng)步驟將不定芽切下，切口選擇在結(jié)下2mm處，用濃度為1. 0 mg/L吲哚丁酸浸泡切口 5min后，接入生根培養(yǎng)基，所述生根培養(yǎng)基成分為1/2MS培養(yǎng)基+2 mg/L 吲哚丁酸，培養(yǎng)8 20天后生根率達(dá)90%以上；
S6)煉苗移栽步驟選取生長出3條以上長度超過3cm的根的生根苗，在自然光條件下過度廣3星期，逐漸開蓋煉苗并移栽至溫室。以上三個實例中，各自使用的樣品總數(shù)量、愈傷組織數(shù)量及經(jīng)不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)后的芽分化數(shù)量如下表2所示
表2 各實例中芽分化數(shù)量統(tǒng)計表
權(quán)利要求
1.一種小桐子高頻再生方法，其特征在于，包括如下步驟獲得無菌苗步驟，選取飽滿的野生小桐子種子，剝?nèi)ネ鈿?，消毒處理后再剝離胚乳，將完整的種子胚和子葉接種在萌發(fā)培養(yǎng)基上萌發(fā)培養(yǎng)，獲得無菌苗；愈傷組織初次誘導(dǎo)步驟，剪取無菌苗長勢好的子葉再切成子葉小塊并接入愈傷組織初次誘導(dǎo)培養(yǎng)基黑暗培養(yǎng)7 11天，該愈傷組織初次誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分為MS培養(yǎng)基+0. 5 8. 0 mg/L吲哚丁酸，PH值5.8 ；愈傷組織再次誘導(dǎo)步驟，取出經(jīng)過初次誘導(dǎo)的愈傷組織，轉(zhuǎn)入愈傷組織再次誘導(dǎo)培養(yǎng)基黑暗培養(yǎng)12 14天，該愈傷組織再次誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分為MS培養(yǎng)基+0.廣2.0 mg/L 6-芐基嘌呤+0. 05 1. 0 mg/L吲哚丁酸；再生芽誘導(dǎo)步驟，取出經(jīng)過再次誘導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基光照培養(yǎng)直至獲得分化出的不定芽，該不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分為MS培養(yǎng)基+0. 5^1.5 mg/L 6-芐基嘌呤 +0. 05 0. 1 mg/L吲哚丁酸+(Tl. 0 mg/L的赤霉素；生根培養(yǎng)步驟，選取莖葉生長均勻的不定芽切下，并在0.廣2.0 mg/L的吲哚丁酸或生根粉中浸泡5 120min，接入生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)，該生根培養(yǎng)基成分為1/2MS培養(yǎng)基 +0 2 mg/L吲哚丁酸；煉苗移栽步驟，選擇長出至少3條長度超過3cm的根的生根苗，煉苗移栽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小桐子高頻再生方法，其特征在于萌發(fā)培養(yǎng)基主要包括MS 培養(yǎng)基，PH值5. 8，每瓶培養(yǎng)基接2-3顆，接好的材料在M_26°C下先在暗培養(yǎng)3飛天再光照培養(yǎng)，光照12_16h/天，光照強度1600-2000 lx，光照培養(yǎng)10-12天后獲得無菌苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的小桐子高頻再生方法，其特征在于所述萌發(fā)培養(yǎng)基中還加入有3. 0%蔗糖和0. 7%瓊脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小桐子高頻再生方法，其特征在于愈傷組織初次誘導(dǎo)步驟中，切好的子葉小塊是正面朝上地接入愈傷組織初次誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的小桐子高頻再生方法，其特征在于愈傷組織初次誘導(dǎo)步驟中，將無菌苗長勢好的子葉放入墊有無菌濾紙的滅菌的盤中，加入無菌水，子葉是切成 0. 3^0. 5cm2大小的子葉小塊，愈傷組織初次誘導(dǎo)培養(yǎng)時，溫度為24l6°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小桐子高頻再生方法，其特征在于愈傷組織再次誘導(dǎo)步驟中，培養(yǎng)溫度為M 26°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小桐子高頻再生方法，其特征在于再生芽誘導(dǎo)步驟中，培養(yǎng)條件為溫度M 26°C，光照時間12h/天，光照強度1600 2000 lx，培養(yǎng)20 30天。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的小桐子高頻再生方法，其特征在于生根及移栽步驟中，不定芽的切法為芽在結(jié)下廣4mm處平切。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小桐子高頻再生方法，其特征在于煉苗移栽步驟，將選中的生根苗在自然光條件下過渡廣3星期，期間逐漸開蓋煉苗并移栽至溫室。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小桐子高頻再生方法，其特征在于所述獲得無菌苗步驟中選用的野生小桐子種子為中國云南元謀野生小桐子種子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種小桐子高頻再生方法，包括獲得無菌苗步驟，選取飽滿的野生小桐子種子，消毒處理后將種子胚和子葉接種在萌發(fā)培養(yǎng)基上萌發(fā)培養(yǎng)，獲得無菌苗；愈傷組織初次誘導(dǎo)步驟，剪取無菌苗長勢好的子葉切成小塊，接入愈傷組織初次誘導(dǎo)培養(yǎng)基黑暗培養(yǎng)7~11天；愈傷組織再次誘導(dǎo)步驟，取出經(jīng)過初次誘導(dǎo)的愈傷組織，轉(zhuǎn)入愈傷組織再次誘導(dǎo)培養(yǎng)基黑暗培養(yǎng)12~14天；再生芽誘導(dǎo)步驟，取出經(jīng)過再次誘導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基光照培養(yǎng)直至獲得分化出的不定芽；生根培養(yǎng)步驟，選取莖葉生長均勻的不定芽切下，并在吲哚丁酸或生根粉中浸泡后接入生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)；煉苗移栽步驟。本發(fā)明愈傷率可達(dá)100%，不定芽分化率可達(dá)90%左右。
文檔編號A01H4/00GK102524065SQ201110426508
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月19日
發(fā)明者孔曉香, 孫懷娟, 李耿光, 李艷梅, 陳小蓮 申請人:普羅米綠色能源(深圳)有限公司