專利名稱：一種脫除崇明水仙病毒的方法
技術領域：
本發(fā)明屬植物組培脫毒技術領域，涉及一種脫除崇明水仙病毒的方法，具體涉及一種利用醫(yī)用抗病毒藥物脫除崇明水仙病毒的方法。
背景技術：
我國水仙栽培歷史悠久，大約1300多年前就開始了引種與栽培。水仙是我國十大名花之一，素有“凌波仙子”之美稱，具有重要的觀賞價值和經(jīng)濟價值。目前我國水仙的主要產(chǎn)地為福建的漳州、廈門、福州、上海市的崇明島及浙江的普陀地區(qū)。這些地區(qū)栽培的水仙均屬多花水仙(Narcissus tazetta)變種(N. tazettavar. chinensis Roem)。崇明水仙作為上海的傳統(tǒng)花卉之一，在崇明縣栽培已有上百年歷史，以合興鄉(xiāng)的栽培面積為最大，享有“水仙之鄉(xiāng)”的盛名。作為上海地方特色花卉、特色資源，“崇明水仙”是上海唯一具有地理標志性的花卉品種資源，崇明水仙曾經(jīng)因其濃郁的芳香而著稱于國內外花卉市場。但在最近的幾十年，崇明水仙的生產(chǎn)數(shù)量和品質不斷下降，最嚴重時幾乎沒有開花種球上市。造成這種局面的主要原因在于長期無性繁殖使得崇明水仙的品種退化。并且，崇明水仙在長期栽培過程中還嚴重遭受病毒的侵染及其危害，在植株上主要表現(xiàn)為花葉、斑駁、褪綠、黃化、壞死和啞花，或花變小、花劍明顯減少、香味淡，以及整個植株矮化畸形、鱗莖變小、生長勢差、抗性減弱等缺陷，這已成為影響崇明水仙花品質和產(chǎn)量的主要原因之一。據(jù)報道，目前崇明水仙主要存在以下3類病毒①水仙普通潛隱病毒(Narcissuscommon latent virus,簡稱 NCLV，Genbank 登錄號為 EU200454)；②水仙退化病毒(Narcissus degeneration virus, NDV, GenebankEU200456) ； (3)/^^
(Narcissus mottling-associated virus, fH ^ NMaV, Genebank S 5 ^EU182651)；其中，在36份崇明水仙田間病樣中，NCLV、NDV和NMaV檢出率分別為11. 1%,13. 9%和 100%。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種脫除崇明水仙病毒的方法，該方法操作簡單，成本低，脫毒效果顯著，能在短時間內獲得大量崇明水仙的脫毒種源，用于快繁和工廠化生產(chǎn)，恢復崇明水仙種源商品性和觀賞性，提高種植戶的經(jīng)濟效益。本發(fā)明的脫除崇明水仙病毒的方法，通過采用植物組織培養(yǎng)脫毒技術，選擇試管籽球作為脫毒材料，利用醫(yī)用抗病毒藥物可以將崇明水仙的主要病毒完全脫除或顯著降低病毒含量。該方法有效提高了脫毒效率，并且可以立即對脫毒后的種球在無菌條件下進行擴繁，極大提高了脫毒材料的利用率。具體來講，本發(fā)明的脫除崇明水仙病毒的方法，包括如下步驟1、試管鱗莖的病毒脫除將增殖培養(yǎng)產(chǎn)生的崇明水仙鱗莖，選擇直徑< 0. 5cm的切分成單個鱗莖，接種在含抗病毒藥劑的脫毒培養(yǎng)基上。20-25°C，濕度70-80%，8-10h/d、光照條件下進行脫毒培養(yǎng)，光照強度為1500-2000LX，其中，所述脫毒培養(yǎng)基包括MS培養(yǎng)基以及下述組分
蔗糖40 g/L
瓊脂4 g/L
6-芐氨基嘌呤(6-BA)1-5 mg/L
萘乙酸(NAA)0.5-2 mg/L
抗病毒藥劑10-60 mg/L
pH5.8-6.0 ο2、病毒檢測剪取脫毒處理后的崇明水仙試管球上的葉子作為病毒檢測材料，RT-PCR進行病毒檢測。步驟如下2. 1葉子經(jīng)液氮研磨后用RNArose Reagent試劑盒提取崇明水仙總RNA，于_70°C冰箱保存?zhèn)溆谩?. 2引物設計2. 2. 1水仙斑駁相關病毒(NmaV)檢測的寡聚核苷酸引物反轉錄引物CMV_2(5，-TTTAGCCGTAAGCTGGATGGA-3‘)。巢式PCR 第一輪引物NmaV-P0L 簡并引物(5，-CARTCNGCHAWDKCTAA-3，)(R = Aor G ;N = A，C，G or T ;ff = A or T ;H = A, T or C ;D = A, T or G) ；CMV-2 (5，-TTTAGCCGTAAGCTGGATGGA-3’ )。巢式PCR 第二輪引物NmaV-l (5，-CTGTCAAGCGTGATGCTACCC-3，) ；NmaV-2 (5，-CTCCATCTCCACCAGCTTCCT-3')。2. 2. 2水仙退化病毒(NDV)檢測的寡聚核苷酸引物反轉錄引物M4T(5，-GTTTTCCCAGTCACGAC (T) 16-3，)。PCR 擴增引物Sprimer (5，-GGXAAYAAYAGYGG XCAZCC-3，) (X = A，G，C or T ;Y =T or C ;Z = A or G) ；M4(5，-GTTTTCCCAGTCACG AC-3，)。2. 2. 3水仙潛隱病毒(NCLV)檢測的寡聚核苷酸引物反轉錄引物M4T(5，-GTTTTCCCAGTCACGAC (T) 16-3，)。PCR 擴增引物pCar-l (+) (5，-ATGCCNCTNAM XCCXC C_3，)(N = A 或 T ;M = C 或G ;X = A，T，C 或 G ;Y = T 或 C ;Z = A 或 G) ；M4(5' -GTTTTCCCAGTCACG AC-3')。2. 3cDNA合成以所提的總RNA為模板，檢測病毒樣本均以各自下游引物為起始引物，用M-MLV反轉錄酶合成病毒第一鏈cDNA。取一新的0. 5mL離心管，依次加入以下試劑Rnase Free H2O5 χ RT Buffer
dNTP Mixture (10 mM/L)Rnase Inhibitor (10 u/pL)下游起始引物(lOpmoL&L)模板RNA
ReverTra Ace(100 ii/pL)
總體積
0.5-2 μ 2-8 μL1-4 μ 0.5-2 μL0.5-2 μL5-20 μL0.5-2 μL10-40 μ .按以下條件進行反轉錄反應42°C、1. 5h ；99°C、5. Omin ；4°C、5. Omin ；瞬間離心?；パa鏈cDNA合成后加入40 μ L dd H2O,置于冰上或4°C下保存，作為進一步PCR擴增的cDNA模板。2. 4PCR 擴增PCR 擴增體系cDNA 模板 1 μ L，上、下游引物(IOpmol/ μ L)各 2 μ L，10 X PCRBuffer 2 μ L，MgCl2 (25mM/L) 2 μ L, dNTP (lOmM/L) 2 μ L, TaqDNA 聚合酶(1-5U/ μ L) 0· 1 μ L，ddH20 8· 9μ L。PCR 擴增程序94 °C l-3min ；94°C 30_60s，55°C 0_lmin，52°C 0_lmin，45°C，
0-lmin，47°C0-lmin 72°C l_3min，30 次循環(huán)；最后 72°C延伸 lOmin。2. 5PCR產(chǎn)物檢測PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳，觀察PCR是否擴增出目標片段。陽性表明有病毒存在；陰性沒檢測到病毒。3、脫毒種源的試管保存將經(jīng)檢測已脫除病毒的脫毒種源轉移到脫毒種源保存培養(yǎng)基上進行試管保存。每
1-2個月更換一次新培養(yǎng)基。保存培養(yǎng)條件為20-25°C，濕度70%，8-10h/d光照條件下進行培養(yǎng)，光照強度為1500-2000LX。其中，上述方法中，所述的抗病毒藥劑選自阿昔洛韋注射液或片劑(9-[(2_羥基乙氧基)甲基]鳥嘌呤)、利巴韋林注射液或片劑(Ι-β-D-呋喃核糖基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酰胺)、鹽酸嗎啉胍注射液或片劑(N-(2-胍基-乙亞氨基)-嗎啉)中的一種或多種。所述的脫毒種源保存培養(yǎng)基包括MS培養(yǎng)基以及下述組分 所述的崇明水仙試管鱗莖在進行病毒脫除前需經(jīng)過外植體選擇及消毒、誘導培養(yǎng)
瓊脂
6-芐氨基嘌呤(6-BA)萘乙酸(NAA)
蔗糖
活性炭(AC)pH
4g/L
1-5 mg/L0.5-2 mg/L30-60 g/L0-1.0 g/L5.8-6.0。和增殖培養(yǎng)步驟。分別如下a、外植體選擇及消毒選取健康、4_6°C左右冷處理4-6周后的崇明水仙的鱗莖，去掉干枯鱗葉、老根及鱗莖盤底部，自來水沖洗6-lOmin，剝去兩層外部鱗葉，進行消毒處理。b、試管鱗莖的誘導培養(yǎng)經(jīng)消毒處理后，在無菌濾紙上，將消毒處理的鱗莖分切為8mmX 5mm左右，帶2 3片基部鱗片的小塊接種在誘導培養(yǎng)基上，誘導試管鱗莖。誘導培養(yǎng)條件為誘導培養(yǎng)條件為溫度20-25°C，濕度70-80%。暗培養(yǎng)10_15d后，再轉入8_12h/d光照培養(yǎng)，光照強度為1500-2000LX。C、試管鱗莖的增殖培養(yǎng)將誘導產(chǎn)生的試管鱗莖切分后，接種增殖培養(yǎng)基上。增殖培養(yǎng)條件為20-25°C，濕度70-80 %，8-10h/d光照條件下進行增殖培養(yǎng)，光照強度為1500-2000LX。所述外植體的消毒過程為將鱗莖上部切除3/4后，再縱切成4塊，用500-1000mg/L頭孢拉定溶液浸泡2_4h。處理后，用75%酒精浸泡30_60s，再用0. 升汞浸泡10-15min，無菌水沖洗3_5遍。所述誘導培養(yǎng)基為MS+BAl-2mg/L+NAA l-2mg/L+ 蔗糖 30_40g/L+ 瓊脂 4_6g/L，ρΗ5· 8-6. O0所述增殖培養(yǎng)基為MS+BA3-5mg/L+NAA l-2mg/L+ 蔗糖 30_40g/L+ 瓊脂 4_6g/L，ρΗ5· 8-6. O0RT-PCR檢測結果表明經(jīng)本發(fā)明所述脫毒方法脫毒的崇明水仙試管鱗莖的NMaV病毒特異性普帶亮度明顯減低，而且未發(fā)現(xiàn)NCLV、NDV兩種病毒的特異性普帶?？梢?，本發(fā)明所述利用醫(yī)用抗病毒藥物脫除崇明水仙病毒的方法能有效降低崇明水仙NMaV病毒含量，并能完全脫除崇明水仙攜帶的NCLV、NDV病毒。本發(fā)明的有益效果1、首次在崇明水仙上運用醫(yī)用抗病毒藥物脫除病毒，操作簡便快捷，既符合崇明水仙無莖尖的特有性狀(不能通過莖尖培養(yǎng)脫毒)，又避免反復切割剖取莖尖帶來的污染。節(jié)省了人力物力的同時，又為其他植物的脫毒提供一條有效參考途徑。2、使用醫(yī)用抗病毒藥物代替?zhèn)鹘y(tǒng)的高純度試驗用進口試劑作為脫毒藥劑，價格低廉，藥劑也容易獲得，能大幅節(jié)省生產(chǎn)脫毒種源的成本。3、對脫毒試管鱗莖提出了試管保存的方法，解決了脫毒種源的保存問題，既能保證脫毒種源的優(yōu)良性狀，又避免種源露地栽培后遭受病毒再次侵染，減少了反復脫毒帶來的資源浪費。


圖1為本發(fā)明誘導的崇明水仙試管鱗莖。圖2為本發(fā)明RT-PCR技術病毒檢測NMaV病毒結果，其中，1_9為脫毒處理后待檢測樣品的代碼，CK為未經(jīng)脫毒處理的葉片PCR普帶，即陽性對照。圖3為本發(fā)明RT-PCR技術病毒檢測NCLV病毒結果，其中，1_9為脫毒處理后待檢測樣品的代碼，CK為未經(jīng)脫毒處理的葉片PCR普帶，即陽性對照。
圖4為本發(fā)明RT-PCR技術病毒檢測NDV病毒結果，其中，1-9為脫毒處理后待檢測樣品的代碼，CK為未經(jīng)脫毒處理的葉片PCR普帶，即陽性對照。
具體實施例方式通過以下實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，但本發(fā)明的內容并不限于此。本發(fā)明下述實施例所用的各種藥劑和材料，如阿昔洛韋注射液或片劑、利巴韋林注射液或片劑、鹽酸嗎啉胍注射液或片劑、頭孢拉定溶液、RNAroseReagent試劑盒、MS、ΒΑ、NAA> TaqDNA ^ ^ B|> RNase Free H2O> dNTPMixture>5 X RT Buffer> RNase Inhibitor>ReverTra Ace等均為常規(guī)市售產(chǎn)品。實施例11、外植體選擇及消毒選取健康、4°C左右冷處理4周后的崇明水仙的鱗莖，去掉干枯鱗葉、老根及鱗莖盤底部，自來水沖洗6min，剝去兩層外部鱗葉，將鱗莖上部切除3/4后，再縱切成4塊，用1000mg/L頭孢拉定溶液浸泡池。處理后，用75%酒精浸泡30s，再用0. 1 %升汞浸泡12min，無菌水沖洗5遍，備用。2、試管鱗莖的誘導外植體經(jīng)消毒處理后，在無菌濾紙上，將材料分切為8mmX 5mm左右大小，帶2 3片基部鱗片的小塊接種在MS+BAlmg/L+NAAlmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂4g/L (pH5. 8)誘導培養(yǎng)基上，誘導試管鱗莖。誘導培養(yǎng)條件為培養(yǎng)條件為溫度25C，濕度70%。暗培養(yǎng)IOd后，再轉入12h/d光照培養(yǎng)，光照強度為2000LX。培養(yǎng)2個月。誘導產(chǎn)生的崇明水仙鱗莖狀態(tài)參見圖1。3、試管鱗莖的增殖將誘導產(chǎn)生的試管鱗莖單個分開，切去葉子，縱切成2個，均需帶鱗莖盤。切好后，接種在MS+BA 5mg/L+NAA lmg/L+蔗糖40g/L+瓊脂4g/L (pH5. 8)增殖培養(yǎng)基上。增殖培養(yǎng)條件為25°C，濕度70%，10h/d光照條件下進行增殖培養(yǎng)，光照強度為2000LX。培養(yǎng)1個月。4、試管鱗莖的病毒脫除將增殖培養(yǎng)產(chǎn)生的崇明水仙鱗莖，選擇直徑< 0.5cm的小試管鱗莖，切分成單個鱗莖，切除所有葉片，接種在MS+BA 5mg/L+NAA lmg/L+阿昔洛韋注射液(或片劑)30mg/L (有效濃度)+利巴韋林注射液(或片劑)30mg/L (有效濃度)+蔗糖40g/L+瓊脂4g/L(pH5. 8)脫毒培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件為25°C，濕度70%，10h/d光照條件下進行培養(yǎng)，光照強度為2000LX。培養(yǎng)1個月。5、脫毒處理后的病毒檢測5. 1脫毒處理后，剪取0. 1克試管鱗莖上的葉子作為病毒檢測材料，用RT-PCR技術進行病毒檢測。5. 2葉子液氮研磨后用RNArose Reagent試劑盒(上海華舜生物公司)提取崇明水仙總RNA，最后于-70°C冰箱保存?zhèn)溆谩?. 3RT-PCR 相關引物5. 3. 1水仙斑駁相關病毒(NMaV)檢測的寡聚核苷酸引物
反轉錄引物CMV_2(5'-TTTAGCCGTAAGCTGGATGGA-3 ‘)。巢式PCR 第一輪引物匪aV-POL 簡并引物(5' -CARTCNGCHAWDKCTAA-3 ‘ ) (R = Aor G ;N = A，C，G or T ;ff = A or T ;H = A, T or C ;D = A, T or G) ；CMV-2 (5' -TTTAGCCGTAAGCTGGATGGA-3')。巢式PCR 第二輪引物NMaV-I (5' -CTGTCAAGCGTGATGCTACCC-3' );WaV_2(5'-CTCCATCTCCACCAGCTTCCT-3')。5. 3. 2水仙退化病毒(NDV)檢測的寡聚核苷酸引物反轉錄引物M4T(5'-GTTTTCCCAGTCACG AC(T) 16-3')。PCR擴增弓丨物Sprimer(5' -GGXAAYAAYAGYGG XCAZCC-3‘ ) (X = A，G，C or T ；Y = T or C ;Z = A or G) ；M4(5' -GTTTTCCCAGTCACG AC_3')。5. 3. 3水仙潛隱病毒(NCLV)檢測的寡聚核苷酸引物反轉錄引物M4T(5'-GTTTTCCCAGTCACG AC(T) 16-3')。 PCR 擴增引物:pCar-l (+) (5 ‘ -ATGCCNCTNAM XCCXC C-3 ‘ ) (N = A 或 T ;M = C 或G ;X = A, T，C 或 G ;Y = T 或 C ;Z = A 或 G) ;Μ4 (5 ‘ -GTTTTCCCAGTCACG AC-3 ‘)。5. ^DNA合成以所提的總RNA為模板，檢測病毒樣本均以各自下游引物為起始引物，用M-MLV反轉錄酶(Τ0Υ0Β0公司)合成病毒第一鏈cDNA。取一新的0. 5mL離心管，依次加入以下試劑互補鏈cDNA合成后加入40 μ L dd H2O,置于冰上或4°C下保存，作為進一步PCR擴增的cDNA模板。5. 5PCR 擴增5. 5. 1水仙斑駁相關病毒
RNase Free H2O5xRT Buffer
dNTP Mixture (10 mM/L)RNase Inhibitor (10 u/pL)下游起始引物(lOpmoL&L)模板RNA
ReverTra Ace(100 ii/pL)TotaL Volume
IpL4μΙ2μLIpLIpLIOpL
1 μ ν
20μΙ^ο
99°C、v5.0min
ψ
4。C、 5.0 miψ
瞬間離心
5.0 min
8
巢式第一輪PCR反應cDNA 模板 1 μ L, NMaV-POL (1 Opmol/ μ L) 2 μ L, CMV-2 (lOpmol/μ L) 2 μ L，10XPCRBuffer 2 μ L，MgCl2 (25mM/L) 2 μ L，dNTP (lOmM/L) 2 μ L，LA TaqDNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 1 μ L,ddH20 8. 9 μ L。擴增程序為94°C2min ；94°C 30s，55°C lmin，45°C lmin，72°C 2min，30 次循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin0PCR 產(chǎn)物大小631bp巢式第二輪PCR反應cDNA 模板 1 μ L, NMaV-I (lOpmol/μ L) 2 μ L，NMaV-2 (lOpmol/μ L) 2 μ L，10XPCRBuffer 2 μ L，MgCl2 (25mM/L) 2 μ L, dNTP (lOmM/L) 2 μ L, TaqDNA 聚合酶(IU/ μ L) 0· 4 μ L，ddH20 8· 6μ L。擴增程序為94°C2min ；94°C 30s，52°C lmin，72°C lmin，30 次循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin0PCR 產(chǎn)物大小500bp5. 5. 2水仙退化病毒cDNA 模板 1 μ L, Sprimer (lOpmol/μ L) 2 μ L, M4 (lOpmol/μ L) 2 μ L, IOXPCRBuffer2 μ L，MgCl2 (25mM/L) 2 μ L, dNTP (10mM/L) 2 μ L, TaqDNA 聚合酶(IU/ μ L) 0· 4 μ L，ddH208· 6 μ L0擴增程序為94°C2min ；94°C 30s，47°C lmin，72°C 3min，30 次循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin0PCR 產(chǎn)物大小156^3Ρ5. 5. 3水仙潛隱病毒cDNA 模板 IyL, pCar-1 (+) (lOpmol/μ L) 2 μ L, M4 (lOpmol/μ L) 2 μ L, 10XPCRBuffer 2 μ L，MgCl2 (25mM/L) 2 μ L, dNTP (10mM/L) 2 μ L, TaqDNA 聚合酶(IU/ μ L) 0· 4 μ L，ddH20 8· 6μ L。擴增程序為94°C2min ；94°C 30s，47°C lmin，72°C 3min,30 次循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin0PCR 產(chǎn)物大小1800bp5. 6PCR產(chǎn)物的檢測PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳，觀察PCR是否擴增出目標片段。陽性表明有病毒存在；陰性沒檢測到病毒。根據(jù)PCR檢測結果可以看出=NMaV病毒特異性普帶亮度明顯減低，肉眼幾乎難以分辨(參看圖2)，并且未發(fā)現(xiàn)NCLV、NDV兩種病毒的特異性普帶(參看圖3、4)。由此說明本發(fā)明方法靈敏度高，證實了脫毒結果的可靠性。6、脫毒種源的試管保存經(jīng)檢測已脫除病毒的試管鱗莖，轉移到MS+BA lmg/L+NAA lmg/L+蔗糖40g/L+瓊脂4g/L(pH5.8)脫毒種源保存培養(yǎng)基上進行試管保存。每1-2個月更換一次新培養(yǎng)基。20°C，濕度70%，8h/d光照條件下進行脫毒種源培養(yǎng)，光照強度為1500LX。將該試管保存的鱗莖再次種植栽培，生長迅速，鱗莖圓潤，葉片未出現(xiàn)病毒侵染癥狀。從上述方法可以看出本發(fā)明通過利用醫(yī)用抗病毒藥物脫除崇明水仙病毒的方法能有效降低崇明水仙NMaV病毒含量，完全脫除攜帶的NCLV、NDV病毒。本發(fā)明對脫除崇明水仙的幾種主要侵染病毒具有良好的效果。實施例2本實施例中脫毒培養(yǎng)基為MS+BA 5mg/L+NAA lmg/L+鹽酸嗎啉胍注射液(或片劑)10mg/L+利巴韋林注射液(或片劑)30mg/L (有效濃度)+蔗糖40g/L+瓊脂4g/L(pH5. 8)，其余工藝步驟均同實施例1。經(jīng)RT-PCR檢測后，檢測結果同實施例1近似，NMaV病毒特異性普帶亮度明顯減低，肉眼幾乎難以分辨，而且未發(fā)現(xiàn)NCLV、NDV兩種病毒的特異性普帶。最后應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍中。
權利要求
1. 一種脫除崇明水仙病毒的方法，其特征在于，包括如下步驟1)試管鱗莖的病毒脫除將增殖培養(yǎng)產(chǎn)生的崇明水仙鱗莖，選擇直徑< 0. 5cm的切分成單個鱗莖，接種在含抗病毒藥劑的脫毒培養(yǎng)基上，20-250C，濕度70-80 %，8_10h/d、光照條件下進行脫毒培養(yǎng)，光照強度為1500-2000LX，其中，所述脫毒培養(yǎng)基包括MS基本培養(yǎng)基以及下述組分蔗糖瓊脂6-芐氨基嘌呤萘乙酸抗病毒藥劑40 g/L4g/L1-5 mg/L0.5-2 mg/L10-60 mg/L5.8-6.0?！鰴z測材料，采用RT-PCR技術進pH2)病毒檢測剪取脫毒處理后的崇明水仙試管球上的葉子作為??；行病毒檢測；3)脫毒種源的試管保存將經(jīng)檢測病毒已脫除的脫毒種源轉移到脫毒種源保存培養(yǎng)基上進行試管保存；每1-2個月更換一次新培養(yǎng)基，20-25C,濕度70 %，8-10h/d光照條件下進行保存培養(yǎng)，光照強度為 1500-2000LX。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗病毒藥劑選自阿昔洛韋注射液或片劑、利巴韋林注射液或片劑、鹽酸嗎啉胍注射液或片劑中的一種或多種。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述脫毒種源保存培養(yǎng)基包括:MS基本培養(yǎng)基以及下述組分瓊脂4 g/L6-芐氨基嘌呤1-5 mg/L萘乙酸0.5-2 mg/L蔗糖30-60 g/L活性炭0-1.0 g/LpH5.8-6.0。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，崇明水仙試管鱗莖在進行病毒脫除前還需經(jīng)外植體選擇及消毒、誘導培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)步驟。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種脫除崇明水仙病毒的方法，包括試管鱗莖的病毒脫除、病毒檢測，以及脫毒種源的試管保存。本發(fā)明首次在崇明水仙上運用醫(yī)用抗病毒藥物脫除病毒，操作簡單，成本低，脫毒效果顯著，并且對脫毒試管鱗莖提出了試管保存的方法，解決了脫毒種源的保存問題，既能保證脫毒種源的優(yōu)良性狀，又避免種源露地栽培后遭受病毒再次侵染，減少了反復脫毒帶來的資源浪費。能在短時間內提供大批崇明水仙的脫毒種源，能用于快繁和工廠化生產(chǎn)，恢復了崇明水仙種源商品性和觀賞性，提高了經(jīng)濟效益。
文檔編號A01H4/00GK102550408SQ201110446929
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月28日 優(yōu)先權日2011年12月28日
發(fā)明者張永春, 方麗華, 朱春美, 楊柳燕, 湯庚國, 許曉崗 申請人:上海市農業(yè)科學院