專(zhuān)利名稱(chēng)：應(yīng)用真菌發(fā)酵液誘導(dǎo)沉香樹(shù)快速形成沉香的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種應(yīng)用真菌發(fā)酵液誘導(dǎo)沉香樹(shù)快速形成沉香的方法。
背景技術(shù)：
沉香是我國(guó)、日本、印度以及東南亞國(guó)家的傳統(tǒng)名貴藥材和世界知名名貴香料。所謂沉香，為瑞香科沉香屬的部分種和擬沉香屬的部分種以自然、微生物或人工方式使之發(fā)生生物化學(xué)過(guò)程形成的產(chǎn)品，能生產(chǎn)沉香的植物統(tǒng)稱(chēng)為沉香樹(shù)。沉香屬有18種，主要分布于印度、中國(guó)、東南亞以及馬來(lái)半島。我國(guó)有土沉香和云南沉香兩個(gè)種?，F(xiàn)有人工結(jié)香方法有五種。第一、砍傷法樹(shù)干用刀造成3 4cm傷口，幾年后在傷口處形成沉香。第二、打釘法鐵釘打入樹(shù)干任其生銹，爾后產(chǎn)香。第三、鑿洞法樹(shù)干用鑿孔機(jī)開(kāi)孔洞，爾后產(chǎn)香。第四、化學(xué)刺激法在樹(shù)干上開(kāi)一小孔，在小孔中滴入乙烯利、甲酸、冰醋酸等化學(xué)物質(zhì)，刺激沉香的形成。第五、接菌法樹(shù)干用鑿孔機(jī)開(kāi)孔洞接種真菌，真菌寄生在沉香樹(shù)上促使木材薄膜細(xì)胞貯存物質(zhì)產(chǎn)生生理變化，最后在組織中形成香脂。前三種方法被稱(chēng)為傳統(tǒng)方法，這三種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)工、時(shí)間長(zhǎng)、產(chǎn)量低且質(zhì)量不穩(wěn)定，但其要求的技術(shù)門(mén)檻低，仍有不少香農(nóng)延用此技術(shù)；化學(xué)刺激法所產(chǎn)生沉香由于安全問(wèn)題不宜入藥。 國(guó)內(nèi)外近年來(lái)的研究認(rèn)為，接菌法促進(jìn)沉香形成具有安全有效、時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，形成沉香大約只需要2年的時(shí)間。但由于接菌的成功與否受環(huán)境條件影響較大，且形成沉香的范圍僅局限在接菌四周，為提高產(chǎn)量，需要在樹(shù)干打很多菌孔。綜上所述，現(xiàn)有人工結(jié)香方法仍存在缺陷，不利于工業(yè)產(chǎn)業(yè)上廣泛應(yīng)用推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種應(yīng)用真菌發(fā)酵液誘導(dǎo)沉香樹(shù)快速形成沉香的方法，利用該方法生產(chǎn)沉香時(shí)間短、產(chǎn)量高，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。本申請(qǐng)的發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，人工接菌后真菌的代謝產(chǎn)物是誘導(dǎo)沉香樹(shù)形成沉香的關(guān)鍵因素，同時(shí)，本申請(qǐng)的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，再育鐮刀菌(Fusarium proliferatum)為沉香樹(shù)結(jié)香部位的十余種真菌之一，其代謝產(chǎn)物能大大促進(jìn)沉香樹(shù)結(jié)香。因此，本發(fā)明的技術(shù)方案是直接滴注再育鐮刀菌的發(fā)酵液誘導(dǎo)沉香樹(shù)形成沉香。這種技術(shù)手段既簡(jiǎn)便又能避免接菌過(guò)程受環(huán)境影響的缺陷。同時(shí)，發(fā)酵液在植物的蒸騰作用的帶動(dòng)下，能快速地遍布樹(shù)體，既促進(jìn)沉香的快速形成又提高沉香的產(chǎn)量。本發(fā)明的應(yīng)用真菌發(fā)酵液誘導(dǎo)沉香樹(shù)快速形成沉香的方法包括以下步驟1)再育鐮刀真菌的培養(yǎng)將由沉香樹(shù)結(jié)香部位分離得到的鐮刀真菌自低溫保藏的斜面試管轉(zhuǎn)接于盛有PDA 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，于26 下培養(yǎng)3 5天后，待菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基后再轉(zhuǎn)接于盛有PDA 液體培養(yǎng)基的三角瓶中，再置于搖床上震蕩培養(yǎng)1周；2)發(fā)酵液的獲取
從搖床上取下三角瓶，用紗布濾去菌絲體，濾液即為發(fā)酵液；3)滴注發(fā)酵液將發(fā)酵液分裝于輸液器具中，在沉香樹(shù)干上鉆孔，將輸液器具中的發(fā)酵液注射經(jīng)鉆孔滴注式輸入樹(shù)體。優(yōu)選地，由沉香樹(shù)結(jié)香部位分離再育鐮刀真菌的步驟包括a)取樣在沉香樹(shù)結(jié)香部位取樣；b)樣品消毒在0. 的升汞溶液中浸泡lmin，無(wú)菌水清洗后，75%乙醇中浸泡 Imin，無(wú)菌水清洗；c)菌種的分離純化在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌剪刀挑取樣品中心部分，置于PDA培養(yǎng)基中J6 恒溫培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌絲后，挑取平板中單一菌落的菌絲轉(zhuǎn)接至新的平板， 繼續(xù)沈 恒溫培養(yǎng)；d)將步驟c)獲得的菌種進(jìn)行鑒定，選取其中的再育鐮刀菌(Fusarium proliferatum)轉(zhuǎn)接試管斜面進(jìn)行低溫保藏。再育鐮刀菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天， 菌落呈圓形，菌絲體白色毛絮狀，后期中央菌絲體由白色轉(zhuǎn)為紫色。大型分生孢子呈鐮刀形或紡錘形，無(wú)色透明，具2 5個(gè)隔膜；小型分生孢子呈卵形、梨形或腎形，無(wú)色透明。優(yōu)選地，滴注發(fā)酵液的沉香樹(shù)干為樹(shù)齡5年以上的土沉香、奇楠沉香或馬來(lái)沉香。優(yōu)選地，在春夏季天氣晴朗的時(shí)候滴注發(fā)酵液。優(yōu)選地，鉆孔在沉香樹(shù)干的同一高度的東西兩側(cè)進(jìn)行。優(yōu)選地，自首次滴注發(fā)酵液2個(gè)月后再滴注一次發(fā)酵液。優(yōu)選地，所述輸液器具包括輸液袋、輸液軟管和針頭；輸液軟管固定在輸液袋下方，呈倒“Y”字形，上方為主液管，下方為兩個(gè)分支輸液管，主液管上設(shè)流速控制器，分支輸液管末端連接針頭。優(yōu)選地，鉆孔的孔徑與針頭的孔徑匹配。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明產(chǎn)生的顯著效果是1.結(jié)香周期短沉香形成的時(shí)間縮短為1年；2.沉香產(chǎn)量高形成沉香的范圍大，由樹(shù)干至分枝及根部均可形成沉香，沉香總產(chǎn)量較現(xiàn)有人工結(jié)香方法提高4 5倍；3.生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單；4.運(yùn)用生物技術(shù)，所產(chǎn)沉香為無(wú)公害產(chǎn)品，宜作藥用。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1應(yīng)用真菌發(fā)酵液誘導(dǎo)沉香樹(shù)快速形成沉香的方法1)由沉香樹(shù)結(jié)香部位分離再育鐮刀菌(Fusarium proliferatum)a)取樣在沉香樹(shù)結(jié)香部位取樣；b)樣品消毒在0. 的升汞溶液中浸泡lmin，無(wú)菌水清洗后，75%乙醇中浸泡 Imin，無(wú)菌水清洗；c)菌種的分離純化在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌剪刀挑取樣品中心部分，置于PDA培養(yǎng)基中J6 恒溫培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌絲后，挑取平板中單一菌落的菌絲轉(zhuǎn)接至新的平板，繼續(xù)沈 恒溫培養(yǎng)；d)將步驟C)獲得的菌種轉(zhuǎn)接試管斜面進(jìn)行低溫保藏。2)再育鐮刀菌(Fusarium proliferatum)的培養(yǎng)將由沉香樹(shù)結(jié)香部位分離得到的再育鐮刀菌(Fusarium proliferatum)自低溫保藏的斜面試管轉(zhuǎn)接于盛有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，于沈 下培養(yǎng)3 5天后，待菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基后再轉(zhuǎn)接于盛有PDA液體培養(yǎng)基的三角瓶中，再置于搖床上震蕩培養(yǎng)1周。3)發(fā)酵液的獲取從搖床上取下三角瓶，用紗布濾去菌絲體，濾液即為發(fā)酵液。4)滴注發(fā)酵液在天氣晴朗的時(shí)候，將發(fā)酵液分裝于輸液器具中，在樹(shù)齡為5年以上的沉香樹(shù)干的同一高度的東西兩側(cè)分別鉆孔，將輸液器具中的發(fā)酵液經(jīng)鉆孔以滴注方式輸入樹(shù)干中， 所述沉香樹(shù)干為土沉香、奇楠沉香或馬來(lái)沉香。所述輸液器具包括輸液袋、輸液軟管和針頭；輸液軟管固定在輸液袋下方，呈倒“Y”字形，上方為主液管，下方為兩個(gè)分支輸液管，主液管上設(shè)流速控制器，分支輸液管末端連接針頭，發(fā)酵液裝在輸液袋中，通過(guò)主液管上的流速控制器控制發(fā)酵液從輸液袋流出的速度，從而控制發(fā)酵液由針頭輸入鉆孔中的流速。為防止浪費(fèi)，鉆孔時(shí)控制孔徑的大小與針頭的孔徑大小相等。5)自首次滴注發(fā)酵液2個(gè)月后再一次滴注發(fā)酵液。實(shí)施例2應(yīng)用本發(fā)明的方法誘導(dǎo)沉香樹(shù)產(chǎn)生沉香的產(chǎn)量的測(cè)試選取6年生土沉香樹(shù)5株，分別命名為A1-A5，5株土沉香樹(shù)的平均胸徑12. 46cm, 在離地面30cm處，直徑為11 15cm的樹(shù)干段上使用電鉆(鉆頭Φ = 0. 2cm)鉆一小孔， 孔深約3cm。取再育鐮刀菌發(fā)酵液1000ml裝于輸液器具中，在天氣晴朗的條件下，往預(yù)先鉆好的小孔中對(duì)樹(shù)體滴注式真菌發(fā)酵液，約2 3天后輸液完成。2個(gè)月后再輸液一次。1年后取下(上至離滴注口 70cm下至離滴注口 30cm的)Im樹(shù)干段，去除非棕褐色部分，經(jīng)曬干后即為沉香，測(cè)定其重量并參照2010版《中華人民共和國(guó)藥典》測(cè)定其醇浸出物含量，結(jié)果如表1。表 權(quán)利要求
1.應(yīng)用真菌發(fā)酵液誘導(dǎo)沉香樹(shù)快速形成沉香的方法，其包括以下步驟1)再育鐮刀菌的培養(yǎng)將由沉香樹(shù)結(jié)香部位分離得到的再育鐮刀菌自低溫保藏的斜面試管轉(zhuǎn)接于盛有PDA 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，于26 下培養(yǎng)3 5天后，待菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基后再轉(zhuǎn)接于盛有PDA 液體培養(yǎng)基的三角瓶中，再置于搖床上震蕩培養(yǎng)1周；2)發(fā)酵液的獲取從搖床上取下三角瓶，用紗布濾去菌絲體，得到發(fā)酵液；3)滴注發(fā)酵液將發(fā)酵液分裝于輸液器具中，在沉香樹(shù)干上鉆孔，將輸液器具中的發(fā)酵液注射進(jìn)鉆孔中。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用真菌發(fā)酵液誘導(dǎo)沉香樹(shù)快速形成沉香的方法，其特征在于由沉香樹(shù)結(jié)香部位分離再育鐮刀菌的方法包括以下步驟a)取樣在沉香樹(shù)結(jié)香部位取樣；b)樣品消毒在0.1%的升汞溶液中浸泡lmin，無(wú)菌水清洗后，75%乙醇中浸泡lmin，無(wú)菌水清洗；c)菌種的分離純化在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌剪刀挑取樣品中心部分，置于PDA培養(yǎng)基中，沈 恒溫培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌絲后，挑取平板中單一菌落的菌絲轉(zhuǎn)接至新的平板，繼續(xù) 26 恒溫培養(yǎng)；d)將步驟c)獲得的再育鐮刀菌轉(zhuǎn)接試管斜面進(jìn)行低溫保藏。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用真菌發(fā)酵液誘導(dǎo)沉香樹(shù)快速形成沉香的方法，其特征在于滴注發(fā)酵液的沉香樹(shù)干為樹(shù)齡5年以上的土沉香、奇楠沉香或馬來(lái)沉香。
4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用真菌發(fā)酵液誘導(dǎo)沉香樹(shù)快速形成沉香的方法，其特征在于在春夏季天氣晴朗的時(shí)候滴注發(fā)酵液。
5.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用真菌發(fā)酵液誘導(dǎo)沉香樹(shù)快速形成沉香的方法，其特征在于鉆孔在沉香樹(shù)干的同一高度的東西兩側(cè)進(jìn)行。
6.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用真菌發(fā)酵液誘導(dǎo)沉香樹(shù)快速形成沉香的方法，其特征在于自首次滴注發(fā)酵液2個(gè)月后再滴注一次發(fā)酵液。
7.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用真菌發(fā)酵液誘導(dǎo)沉香樹(shù)快速形成沉香的方法，其特征在于所述輸液器具包括輸液袋、輸液軟管和針頭；輸液軟管固定在輸液袋下方，呈倒“Y”字形，上方為主液管，下方為兩個(gè)分支輸液管，主液管上設(shè)流速控制器，分支輸液管末端連接針頭。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用真菌發(fā)酵液誘導(dǎo)沉香樹(shù)快速形成沉香的方法，其特征在于鉆孔的孔徑與針頭的孔徑匹配。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用真菌發(fā)酵液誘導(dǎo)沉香樹(shù)快速形成沉香的方法，其將由沉香樹(shù)結(jié)香部位分離純化得到的再育鐮刀菌(Fusariumproliferatum)進(jìn)行培養(yǎng)、發(fā)酵，然后取發(fā)酵液滴注到沉香樹(shù)上的鉆孔內(nèi)，發(fā)酵液在沉香樹(shù)內(nèi)誘導(dǎo)形成沉香。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單，沉香形成的時(shí)間縮短為1年；沉香產(chǎn)量較現(xiàn)有人工結(jié)香方法提高4～5倍，1米長(zhǎng)直徑為10cm的樹(shù)干能產(chǎn)生合格沉香200～300克。
文檔編號(hào)A01G1/04GK102550311SQ20111045331
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者周再知, 林明平, 梁坤南, 馬華明, 黃桂華 申請(qǐng)人:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所