專利名稱：來自Solanum x edinense的功能R基因的克隆和開發(fā)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從S.x edinense分離的抗性基因。此外，本發(fā)明涉及所述抗性基因(例如用于克隆功能同源物)的應(yīng)用，以及所述抗性基因在提高或賦予植物中對卵菌感染的至少部分抗性的方法中的應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明提供了一種抗性基因，該抗性基因能夠通過基因工程技術(shù)或通過標(biāo)記物輔助的育種技術(shù)增強(qiáng)或賦予對疫霉屬(Phytophthorasp.)(例如致病疫霉(Phytophthora infestans))的至少部分抗性。
背景技術(shù)：
由卵菌致病疫霉引起的晚疫病(late blight)是在全球馬鈴薯生產(chǎn)中最嚴(yán)重的疾病之一，也是二十世紀(jì)中期白馬鈴薯(Irish potato)饑荒的原因，曾導(dǎo)致100萬人死亡。業(yè)內(nèi)已經(jīng)耗費(fèi)大量工作來控制病原體，對致病疫霉的化學(xué)控制仍然是主要的作物管理策略。但是由于環(huán)境安全正在變得更加重要，而且所述病原體有時能夠進(jìn)化出對殺真菌劑處理的抗性。因此，將抗性導(dǎo)入現(xiàn)代馬鈴薯變種中是控制該疾病最持久的策略。上個世紀(jì)，曾廣泛使用矮爺(Solanum demissum)(六倍體的墨西哥種)在馬鈴薯中培育晚疫病抗性。最初，描述了源自矮茄的一系列11個R基因。其中，已將Rl、R2、R3a/b、R6和R7定位于馬鈴薯(Solanum tuberosum)的基因圖譜中。但是，這些R基因賦予致病變-特異性(pathovar-specific)抗性,但所述病原體會迅速戰(zhàn)勝滲入馬鈴薯變種中的那些基因(主要是町、1 2、1 3、1 4和1 10)。因此，需要新的抗性來源來解決這些問題。目前，已經(jīng)報(bào)道有幾種其它的野生茄屬(Solanum)品種為抗性的潛在來源，其中已對許多品種進(jìn)行了基因表征(表8)。近來，鑒別晚疫病抗性的工作已經(jīng)聚焦于源自不同野生茄屬品種且賦予廣譜抗性的主要的R基因上。除了 S. demissum以外，已經(jīng)報(bào)道了作為晚疫病抗性新來源的其它野生爺屬品種，諸如 無莖薯(S. acaule)、S. chacoense、S. berthaulti1、S. brevidens、S. bulbocastanum、S. microdontum、S. sparsipilum、S. spegazzini1、S. stoloniferum、S. sucrense、S. toralapanum、S. vernei 和 S. verrucosum(綜述(Jansky, 2000))。S. xedinense P. Berthault (—種來自墨西哥的五倍體(2n = 5x = 60)馬鈴薯品種)是墨西哥矮煎和南美洲S. tuberosum spp. andigena之間的天然雜種。已在1908年由Salaman鑒定出五倍體S. x edinense作為對致病疫霉抗性的有趣來源，且在1914年被 Brioli 列入育種計(jì)劃中(Pavek 等 2001 ;Toxopeus 1964)。用 Edinburgh BotanicGarden(Glendinning 1983，其中首次描述了五倍體S. x edinense的雜種特性)命名五倍體S. X edinense。已在育種計(jì)劃中使用了五倍體S. x edinense，且已顯示出對致病疫霉良好的大田抗性(Van Soest等1984)。已從一種S. x edinense基因型(ednl51_3)中克隆出兩種功能 R 基因Rpi_ednl.1 和 Rp1-ednl. 2 (也被稱為 R2-樣)(Champouret 2010)。已通過R2家族的等位基因發(fā)掘鑒定了該兩種基因。該兩種基因均位于染色體4上的R2簇中。該兩種R基因均識別AVR2 (Champouret 2010 ；Lokossou等2009)，且它們的抗性并不對所有的致病疫霉分離群(包括IP0-C)有效(Lokossou等.2009)。
迄今為止，已經(jīng)不僅從該品種，還從其它茄屬品種中克隆了多個晚疫病R-基因，如位于染色體8上的等位基因RB和Rp1-blbl,及位于S. bulbocastanum染色體6上的Rp1-blb2 (表6)。近來，也已經(jīng)分離了 Rpi_blb3抗性基因(W02008/091153)。此外，還表征了S. chacoense 的抗性基因(EP 09170769.5)。盡管用 RB 及 Rpi_blbl、Rpi_blb2 和 Rpi_blb3得到的初步結(jié)果是有希望的，但仍需要更多的R-基因，尤其因?yàn)樵赟. bulbocastanum基因型中這些基因的等位基因發(fā)掘揭示在單個基因型中以相對較高的頻率發(fā)生Rp1-blbl和Rpi_blb3的天然堆疊(stacking) (Lokossou 2010)。在單個基因型中堆疊多個R基因呈現(xiàn)為實(shí)現(xiàn)對抗?jié)撛诓≡w高水平且持久保護(hù)的可行策略。R基因的聚合(pyramiding)仍具有爭議，不知道它是否為持久的方法(McDowell等2003 ；Pink等1999 ；Pink2002)。Rp1-blbl (Rauscher 等 2006)( 一種具有強(qiáng)效果的 R 基因)和 Rp1-mcdl (Tan 等 2008)( 一種具有弱效果的R基因)的聚合揭示在抗性水平上的累加效果(Tan等2010)。觀察R基因的天然聚合強(qiáng)化了植物可從組合單個R基因(甚至包括具有較弱效果的一些R基因)中收益的觀念(Pink 2002)。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)在，本發(fā)明涉及一種分離或重組的核酸序列，所述分離或重組的核酸序列包括編碼圖4的氨基酸序列Rpi_edn2的核酸序列或該核酸序列的功能片段或功能同源物。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種包括根據(jù)本發(fā)明所述的核酸序列的載體。本發(fā)明進(jìn)一步包括一種包括·根據(jù)本發(fā)明所述的核酸序列或根據(jù)本發(fā)明所述的載體的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞優(yōu)選為農(nóng)桿菌細(xì)胞或植物細(xì)胞。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包括一種包括根據(jù)本發(fā)明所述的核酸或載體的植物細(xì)胞。所述植物細(xì)胞優(yōu)選地是來自茄科植物的細(xì)胞，更優(yōu)選地是來自馬鈴薯(Solanumtuberosum)的細(xì)胞，更優(yōu)選的是來自四倍體馬鈴薯(tetraploid Solanum tuberosum)的細(xì)胞。此外，本發(fā)明還涉及一種包括所述細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物及源自所述植物的一部分，更優(yōu)選地其中所述部分是塊莖。本發(fā)明的又一部分是一種由根據(jù)本發(fā)明所述的分離或重組的核酸或它的功能片段或功能同源物編碼的蛋白，優(yōu)選地其中所述蛋白具有如圖4中描述的Rp1-edn2的氨基酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種(特異性)結(jié)合所述蛋白的抗體。在又一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種用于在植物中提供抗卵菌感染的至少部分抗性或提高抗卵菌感染的抗性的方法，所述方法包括為植物或它的一部分提供根據(jù)本發(fā)明所述的核酸或載體或宿主細(xì)胞或蛋白。在所述方法中，所述植物優(yōu)選地是來自茄科屬的植物，更優(yōu)選地是馬鈴薯。更優(yōu)選地是在所述方法中，所述卵菌包括疫霉屬(Phytophthora),優(yōu)選地包括致病疫霉(Phytophthora infestans )。在再一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種能夠特異性結(jié)合根據(jù)本發(fā)明所述的核酸或它的互補(bǔ)核酸的結(jié)合分子，優(yōu)選地，其中所述結(jié)合分子是引物或探針。在又一實(shí)施方式中，本發(fā)明包括一種用于選擇植物或植物材料或它們的后代對卵菌感染的易感性或抗性的方法，所述方法包括以下步驟測試所述植物或植物材料或它們的后代的至少一部分存在或沒有根據(jù)本發(fā)明所述的核酸；優(yōu)選地，其中使用特異性結(jié)合所述核酸的引物或探針進(jìn)行所述測試；或，其中所述測試包含檢測表5和表7的一種或多種標(biāo)記物的存在；或，其中所述標(biāo)記物包括如圖4中描述的Rp1-edn2基因序列的一部分。進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及一種用于培育具有抗性的四倍體植物的方法，包括a.使用已經(jīng)包含根據(jù)本發(fā)明所述的核酸序列的多倍體植物的配子與四倍體植物的配子雜交；以及b.選擇存在所述核酸序列的所述雜交的后代。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包括一種用于在植物育種中進(jìn)行標(biāo)記物輔助的選擇以獲得抗卵菌抗性的標(biāo)記物，其中所述標(biāo)記物挑選自在表5和表7中示出的標(biāo)記物；或其中所述標(biāo)記物包括如圖4中描述的Rp1-edn2基因序列的一部分。


圖1 :用于Rpi_edn2的定位和克隆的基因型的譜系。圖2 :ednl50-4x cv.并行種群的基因型圖譜。示出了多個Fl個體的子集。圖中示出對四種致病疫霉分離群(90128、IP0-C、PCI99189和UK7824)的應(yīng)答，對分別連接至對90128和PIC99189的抗性的效應(yīng)物AVR2和AVR4的應(yīng)答，及連接至單個R基因座的一個或兩個標(biāo)記物的基因型評分。R :抗性(綠色)，S :易感的(紅色)，Q :不清楚的基因型，ab 存在片段，aa:不存在片段，nd:不確定?；疑乃骄€使R基因座分開。Fl個體數(shù)16包含來自cv.并行體的三個Rp1-edn基因和潛在的R10。圖3 :在ednl50_4x cv.并行種群中隔離的、分別定位在染色體9和11上的Rp1-edn2和Rp1-edn3基因的基因位置?；驁D譜與SH x RH UHD參照基因圖譜進(jìn)行對比(van Os 等 2006，Genetics 173:1075-1089)。垂直的黑色條示出已知的R基因簇。圖4 Rp1-edn2的核苷酸序列和對應(yīng)的氨基酸序列。圖5 Rp1-edn2和高同源性蛋白的氨基酸序列比對。圖6 :本氏煙草(Nicotiana benthamiana)葉中疫霉菌易感性的瞬時互補(bǔ)。在使用pDEST32:edn2或空的雙元載體(binary vector)進(jìn)行農(nóng)桿菌滲入法(agro-1nfiltration) 2天后,通過接種致病疫霉分離群IP0_C (左半側(cè)葉片)和H30P04(右半側(cè)葉片)的游動孢子懸浮液攻擊葉片。對上述兩種分離群均具有抗性與在Fl種群中的染色體9基因共隔離。已經(jīng)被空的雙元載體進(jìn)行農(nóng)桿菌滲入的對照植物在接種后6天出現(xiàn)典型的病害表型。在使用Rpi_edn2進(jìn)行農(nóng)桿菌滲入的植物中可看到為HR或XR(極值抗性(extreme Resistance))的抗性。圖7 :通過 Rpi_edn2 的 PITG_15039 的識別。效應(yīng)物的候選者在OD6tltl = O. 5(斑點(diǎn) 2 = Avr3a，4 = PITG_09616，6 =PITG_10540，和8 = PITG_15039)時通過農(nóng)桿菌滲入本氏煙草的右半側(cè)葉片中。在左半側(cè)葉片中，相同的效應(yīng)物與R3a(斑點(diǎn)I = Avr3a)或與Rpi_edn2 (斑點(diǎn)3 = PITG_09616, 5 =PITG_10540，和7 = PITG_15039)共滲入。在農(nóng)桿菌滲入后6天獲取圖片。圖8 :包含Rp1-edn2 基因的BAC克隆的核苷酸序列。斜體是增變基因轉(zhuǎn)座因子(pos. 195 3310)。突出顯示的是Rpi_edn2基因(pos. 5618 8829)。編碼序列位于位置6140 8731之間。粗體顯示的是部分Rpi_edn2同源基因(pos. 11924 13956)。下劃線顯示的是完整的Rp1-edn2同源基因(pos. 14406 17847)。潛在的開放閱讀框位于位置15157 17745之間。圖9 Rp1-edn2染色體組區(qū)域的注釋。使用FGENESH算法預(yù)測基因。黃色箭頭示出增變基因轉(zhuǎn)座因子(基因a)的存在。紅色箭頭示出Rp1-edn2和Rp1-edn2-樣序列(基因b和c)的存在。第一紅色箭頭中的方框示出編碼Rpi_edn2蛋白的單個外顯子的位置。由各數(shù)字示出在如圖8中所描述的BAC插入片段中相對于插入片段的起始位點(diǎn)的位置。
具體實(shí)施例方式本文所用術(shù)語“植物或該植物的一部分”是指任何完整或部分的植物，單細(xì)胞和細(xì)胞組織(如植物中未受損的植物細(xì)胞)，可以再生出馬鈴薯植物的細(xì)胞團(tuán)(cell clump)和組織培養(yǎng)物。植物部分的實(shí)例包括但不限于來自花粉、胚珠、葉片、胚芽、根、根尖、花藥、花、果實(shí)、莖、芽、塊莖(包括用于食用的馬鈴薯塊莖，或用于栽培或克隆繁殖的“種塊”)和種子的單個細(xì)胞和組織，以及花粉、胚珠、葉片、胚芽、根、根尖、花藥、花、果實(shí)、莖、芽、幼枝、根莖、種子、原生質(zhì)體、愈傷組織等。本文所用術(shù)語“種群(population) ”是指具有共同遺傳起源的植物的遺傳多樣性的集合。本文所用術(shù)語“變種”如在國際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟(UPOV)條約中所定義的，表示在已知最低類別的單個植物分類單元內(nèi)的任意植物群，所述群可以(a)由給定基因型或基因型的組合產(chǎn)生的特征性的表達(dá)來確定；(b)通過至少一種所述特征性的表達(dá)而與其它任意植物群區(qū)分開；和(C)視作關(guān)于其進(jìn)行無變化繁殖的適宜性的單位。本文所用術(shù)語“栽培品種(cultivar) ” (表示栽培的變種)定義為通常不會在自然界發(fā)現(xiàn)、但已被人類栽培出的變種，即具有與“野生”狀態(tài)不同的生物學(xué)狀態(tài)，其中所述“野生”狀態(tài)表示植物或 加物(accession)最初未經(jīng)栽培或天然的狀態(tài)。術(shù)語“栽培品種”具體涉及具有為四倍體的多倍性水平的馬鈴薯植物。術(shù)語“栽培品種”進(jìn)一步包括但不限于半天然品種、半野生品種、雜草品種(weedy)、傳統(tǒng)栽培品種、地方品種、育種材料、研究材料、育種系、復(fù)合種群、雜種、原始原種/基本種群、近交系(雜種栽培品種的親本)、隔離種群、突變體/遺傳原種和高級/改良的栽培品種。本文所用“雜交”是指雄性植物(或配子)對雌性植物(或配子)進(jìn)行授精。術(shù)語“配子”表示單倍體或二倍體的生殖細(xì)胞(卵子或精子)，該生殖細(xì)胞是在植物中通過減數(shù)分裂、或通過第一次或第二次重組、或從配子體經(jīng)雙減數(shù)分裂生成的，并該生殖細(xì)胞參與有性生殖；在有性生殖的過程中，兩個異性配子融合以形成二倍體或多倍體的合子。該術(shù)語通常包括花粉(包括精子細(xì)胞)和胚珠(包括卵子)。因此“雜交”通常表示一個個體的胚珠與來自另一個個體的花粉進(jìn)行授精，而“自交”表示一個個體的胚珠與遺傳上相同的該個體的花粉進(jìn)行授精。本文所用術(shù)語“回交”是指如下過程兩個親本系之間雜交所產(chǎn)生的植物與其親本系之一雜交；其中在回交中使用的親本系稱作回歸親本(recurrent parent)。重復(fù)回交會產(chǎn)生與回歸親本越來越相似的基因組，直至這可在所述親本的純合性或雜合性水平下實(shí)現(xiàn)。
本文所用“自交”定義為表示自體受精的過程，其中某一個體被它自身的花粉授粉或授精。本文所用術(shù)語“標(biāo)記物”是指，在推斷基因組序列特性差異的方法中使用的任意指示物。所述指示物的實(shí)例是限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記物、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)標(biāo)記物、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、插入突變、微衛(wèi)星標(biāo)記物(SSR)、序列特征性擴(kuò)增區(qū)域(SCAR)、酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(CAPS)標(biāo)記物或同工酶標(biāo)記物，或本文所述標(biāo)記物的組合，所述標(biāo)記物限定特定的遺傳定位和染色體定位。本文所用“基因座”定義為給定基因在植物染色體上占據(jù)的遺傳位置或物理位置。本文所用術(shù)語“等位基因”是指基因的一種或多種可選擇形式中的任意一種，所有所述等位基因皆涉及植物中特定表型特性或特征的存在或缺失。在二倍體細(xì)胞或生物體中，給定基因的兩個等位基因占據(jù)一對同源染色體上的對應(yīng)基因座。在有些情況下，稱為“單倍型”(haplotype)(即染色體段的等位基因)比“等位基因”更準(zhǔn)確，但在這些情況下，術(shù)語“等位基因”應(yīng)當(dāng)理解為包括術(shù)語“單倍型”。本文所用且 僅限于二倍體的術(shù)語“雜合的”是指當(dāng)不同的等位基因位于同源染色體上的對應(yīng)基因座處時存在的遺傳條件。本文所用的且僅限于二倍體的術(shù)語“純合的”定義為當(dāng)相同的等位基因位于同源染色體上的對應(yīng)基因座處時存在的遺傳條件。本文所用且限于四倍體的術(shù)語“無顯性組合(nulliplex) ”、“單純形(simplex) ”、“二顯性組合(duplex) ”、“三顯性組合(triplex)”和“四顯性組合(quadruplex) ”定義為當(dāng)在對應(yīng)同源染色體的對應(yīng)基因座處的特定等位基因分別出現(xiàn)O、1、2、3或4次時的遺傳條件。在四倍體水平，當(dāng)?shù)任换虼嬖谟谒娘@性組合條件下時，才觀察到與隱性等位基因相關(guān)的表型效應(yīng)；而當(dāng)?shù)任换虼嬖谟趩渭冃位蚋邨l件下時，已經(jīng)觀察到與顯性等位基因相關(guān)的表型效應(yīng)。本文所用術(shù)語“單倍體”、“二倍體”、“四倍體”和“五倍體”定義為在每個細(xì)胞(不包括生殖細(xì)胞)中分別具有一對、兩對、四對和五對各染色體。本文所用術(shù)語“單倍型”是指在相同染色體上一起傳遞的多個基因座上的等位基因的組合。根據(jù)給定組的基因座之間已發(fā)生重組現(xiàn)象的次數(shù)，單倍型包括指少至兩個基因座的單倍型和指整個染色體的單倍型。當(dāng)提及評定存在與Rpi_edn2基因表達(dá)相關(guān)的真菌抗性時，本文所用術(shù)語“推斷(infer或inferring) ”是指,通過在植物或其部分的核酸樣品中單獨(dú)或組合地分析所述基因核苷酸的存在，得出關(guān)于所述基因存在于該植物或其部分中的結(jié)論。如本文所公開的，通過檢驗(yàn)核酸分子表達(dá)水平的定性差異或定量差異可以直接鑒別核苷酸的存在，或者，通過檢驗(yàn)Rp1-edn2蛋白的表達(dá)水平可間接鑒別核苷酸的存在。本文所用術(shù)語“引物”是指如下的寡核苷酸當(dāng)置于能誘導(dǎo)與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的合成的條件下，即，存在核苷酸和聚合試劑(諸如DNA聚合酶)且在適宜溫度和pH的條件下，所述寡核苷酸能夠與擴(kuò)增靶點(diǎn)退火結(jié)合，以允許DNA聚合酶附著在上面，從而作為DNA合成的起始位點(diǎn)。(擴(kuò)增)引物優(yōu)選為單鏈，以獲得最大擴(kuò)增效率。優(yōu)選地，引物是寡脫氧核糖核苷酸。另外，引物必須足夠長，從而在存在聚合試劑的條件下啟動延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長度取決于許多因素，包括溫度和引物來源。如本文所使用的“雙向引物對”或“引物對”表示如在DNA擴(kuò)增(諸如在PCR擴(kuò)增中)的技術(shù)領(lǐng)域中通常使用的一個正向引物和一個反向引物。
本文所用術(shù)語“探針”是指單鏈寡核苷酸序列，所述單鏈寡核苷酸序列可識別靶核酸序列分析物或其cDNA衍生物中的互補(bǔ)序列，并與所述互補(bǔ)序列形成氫鍵合的雙鏈。
術(shù)語“嚴(yán)謹(jǐn)(stringency)” 或“嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件(stringent hybridization condition) ”表示可影響雜交物穩(wěn)定性的雜交條件，例如，溫度、鹽濃度、pH、甲酰胺濃度等。 通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化這些條件，以使引物或探針與其靶核酸序列的特異性結(jié)合最大化，并使非特異性結(jié)合最小化。所用的該術(shù)語包括如下的條件在該條件下，探針或引物會與其靶序列雜交以達(dá)到比其它序列更大的可檢測程度，例如超過背景至少2倍。嚴(yán)謹(jǐn)條件是序列依賴性的，且在不同情況下是不同的。較長序列在較高溫度下進(jìn)行特異性雜交。通常所選擇的嚴(yán)謹(jǐn)條件為在限定的離子強(qiáng)度和PH下，比特定序列的熱解鏈溫度(Tm)低約5°C。Tm是如下的溫度(在限定的離子強(qiáng)度和PH下)在該溫度處，50%的互補(bǔ)靶序列與完全匹配的探針或引物雜交。
典型的嚴(yán)謹(jǐn)條件如下在該嚴(yán)謹(jǐn)條件中，在pH7. O 8. 3時，鹽濃度小于約1.0M Na+離子、典型地約O. 01 1.0M Na+離子濃度(或其它鹽)，并且對于短的探針或引物(例如，10 50個核苷酸)該溫度至少約為30°C，而對于長的探針或引物(例如，多于50個核苷酸)該溫度則至少約為60°C?？山柚诩尤肴シ€(wěn)定劑(諸如甲酰胺)來實(shí)現(xiàn)嚴(yán)謹(jǐn)條件。 示例性的低嚴(yán)謹(jǐn)條件或“降低的嚴(yán)謹(jǐn)條件”包括在37°C，在30%甲酰胺、IM NaClU % SDS 的緩沖溶液中雜交；并在40°C，在2x SSC中洗滌。示例性的高嚴(yán)謹(jǐn)條件包括在37°C，在 50%甲酰胺、IM NaCl、l% SDS中雜交；并在60°C，在O.1x SSC中洗滌。雜交過程在本領(lǐng)域中是眾所周知的，且描述在例如 Ausubel, F. M. , Brent, R. , Kingston, R. E. , Moore, D. D., Seidman, J. G. , Smith, J. A. , Struhl, K.主編(1998)的 Current protocols in molecular biology (V. B. Chanda,系列版 New York John Wiley & Sons (紐約約翰威立國際出版公司))中。
本發(fā)明描述了 Rpi_edn2基因的克隆。Rpi_edn2被定位于S. X edinense的染色體 9上的R基因簇。該基因包含與其它抗性基因共同的三個結(jié)構(gòu)域CC、NBS和LRR結(jié)構(gòu)域。
迄今為止，基于保守的蛋白結(jié)構(gòu)域已經(jīng)鑒定出R-基因的五個主要類別(綜述參見 Martin GB, Bogdanove AJ, Sessa G, Annu Rev Plant Biol 2003,54:23-61)。最豐富的類別是細(xì)胞質(zhì)核苷酸結(jié)合位點(diǎn)-富含亮氨酸的重復(fù)序列(NBS-LRR)蛋白(Rommens CM， Kishore GM,Curr Opin Biotechnol 2000，11 :120-125)。其它類別的包括錨定至跨膜(TM) 結(jié)構(gòu)域(受體樣蛋白[RLP])具有細(xì)胞質(zhì)外的LRR(eLRR)的蛋白，具有細(xì)胞外LRR的細(xì)胞質(zhì)絲氨酸-蘇氨酸(Ser/Thr)受體樣激酶(RLK)(諸如在W02004/007712中公布的)，沒有LRR的細(xì)胞質(zhì)Ser/Thr激酶,及具有融合至卷曲螺旋(CC)結(jié)構(gòu)域的膜錨定物(membrane anchor)的蛋白。共有的NBS-LRR編碼蛋白目前包括來自不同植物種類的超過二十種已經(jīng)經(jīng)過功能驗(yàn)證的 R-基 因(Van Der Biezen EA, Freddie CT, Kahn K, Parker JE, Jones JD，Plant J 2002,29 =439-451) 0已經(jīng)將研究集中于這個家族，因?yàn)槠駷橹顾鼉H有的已知功能在于抗病性(Meyers BC, Kaushik S, Nandety RS, Curr Opin Plant Biol 2005,8 129-134)?；虍a(chǎn)物由保守的中心NBS和10 40個短的LRR基序的可變長度的C-末端 LRR 結(jié)構(gòu)域組成(Cannon SB, Zhu H, Baumgarten AM, Spangler R, May G, Cook DR, YoungND, J Mol Evol 2002,54:548-562)。NBS結(jié)構(gòu)域?qū)τ贏TP結(jié)合和水解是很重要的，且相信NBS結(jié)構(gòu)域參與了由病原體存在引發(fā)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(van Der Biezen EA, Jones, Curr Biol1998，8 :R226_R227 ；Tameling WI,Elzinga SD, Darmin PS, Vossen JH, Takken FL,HaringMA,Cornelissen BJ,Plant Cell 2002，14 :2929-2939)。LRR結(jié)構(gòu)域可能參與蛋白-蛋白的相互作用，識別病原體誘導(dǎo)子分子(Young ND, Curr Opin Plant Biol 2000,3:285-290)。LRR中的高突變率有助于遺傳變異性，對不同病原體的特異識別是必需的(Michelmore Rff,Meyers BC, Genome Res 1998,8:1113-1)。基于 N-末端基序，在 NBS-LRR R 蛋白中存在兩個子家族。TIR NBS子家族R蛋白在N-末端氨基酸基序和Drosophila Toll中的受體結(jié)構(gòu)域和在動物中的基底哺乳動物白介素(IL)I免疫因子之間顯示出同源性(Parker JE,Coleman MJ,Szabo V,Frost LN,Schmidt R,van Der Biezen EA,Moores T,Dean C,DanielsMJ, Jones JD, Plant Cell 1997,9:879-894)。非-TIR NBS 子家族 R 蛋白可包含 N-末端卷曲螺旋(CC)基序，該N-末端卷曲螺旋(CC)基序的一個子集為亮氨酸拉鏈序列(LZ)編碼。TIR子家族NBS-LRR蛋白顯示受限于雙子葉植物。卷曲螺旋(CC)結(jié)構(gòu)域位于Rpi_edn2蛋白在氨基酸I和153之間的N-末端部分(在圖4中描述了氨基酸序列)。在第一 153個殘基中，可在Rp1-edn2中識別出由疏水殘基組成的三對推斷的七肽基序(heptad motif)?？稍跉埢?53和444 (Ploop,激酶_2, GLPL)之間的氨基酸伸展中識別出NB-ARC (核苷酸-結(jié)合位點(diǎn)，凋亡，R基因產(chǎn)物，CED-4)結(jié)構(gòu)域(Van der Biezen和Jones 1998)。Rpi_edn2的C末端的一半包括一系列不規(guī)則大小的15個LRR基序,可根據(jù)共有序列Lx·xLxxLxxLxLxxC/N/Sx (X) LxxLPxx (其中x是任意氨基酸，且L選自亮氨酸、異亮氨酸或纈氨酸(L、I或V)的組)比對該不規(guī)則大小的15個LRR基序(McHaIe 等 2006)。在上述蛋白水平下,Rpi_edn2與Rp1-mcql.1享有80%的氨基酸一致性，Rpi_edn2與Rp1-mcql. 2享有77%的氨基酸一致性。而發(fā)現(xiàn)Rpi_edn2與Rpi_vntl (73% )和Tm_22(抗番茄花葉病毒的番茄抗性基因)具有較低的半分比同源性，分別享有73%和72%的一致性。在第一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離或組合的核酸序列，所述分離或組合的核酸序列包括編碼如4中所示的氨基酸序列Rpi_edn2的核酸序列或其功能片段或功能同源物(即如圖4中示出的氨基酸序列的功能片段或功能同源物)。術(shù)語“核酸”指單鏈或雙鏈的DNA或RNA分子。還包括本文所描述的核苷酸序列的互補(bǔ)序列。術(shù)語“其功能片段”典型地用于指Rpi_edn2蛋白的片段或編碼該片段的核酸序列，所述“其功能片段”能夠在茄科(Solanaceae)植物中提供抗卵菌感染，更具體地抗致病疫霉，更具體地抗分離群IPO-C的至少部分抗性或提高抗卵菌感染，更具體地抗致病疫霉，更具體地抗分離群IPO-C的抗性。所述片段例如為Rp1-edn2蛋白的截短形式。Rpi_edn2蛋白的截短形式/片段是如下的片段小于863個氨基酸，且優(yōu)選(部分)包括Rpi_edn2蛋白的NB-ARC和LRR結(jié)構(gòu)域和/或N-末端CC結(jié)構(gòu)域。術(shù)語“功能同源物”典型地用于指與本文所述的Rp1-edn2蛋白或核酸具有高度同源性或具有高度一致性的蛋白序列或編碼所述蛋白的核酸序列，所述(編碼的)蛋白能夠在茄科植物中提供抗卵菌感染，更具體地抗致病疫霉，更具體地抗分離群IPO-C的至少部分抗性或提高抗卵菌感染，更具體地抗致病疫霉，更具體地抗分離群IPO-C抗性。所述功能同源物包括至少部分保持Rpi_edn2蛋白的作用的人工改變或氨基酸殘基替換。例如，某些氨基酸殘基可以常規(guī)替換為其他具有相似性質(zhì)的殘基，例如將一個堿性殘基替換為另一個堿性殘基，將一個酸性殘基替換為另一個酸性殘基，將一個疏水殘基替換為另一個疏水殘基等等。疏水氨基酸的實(shí)例是纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸是具有芳族側(cè)鏈的氨基酸的實(shí)例，半胱氨酸以及甲硫氨酸是具有含硫側(cè)鏈的氨基酸的實(shí)例。絲氨酸和蘇氨酸含有脂族羥基，且被認(rèn)為是親水的。天冬氨酸和谷氨酸是具有酸性側(cè)鏈的氨基酸的實(shí)例。簡言之，術(shù)語“其功能同源物”包括Rpi_edn2蛋白的變體，其中已經(jīng)插入、取代或缺失了氨基酸，但該Rpi_edn2蛋白的變體仍至少部分保持Rpi_edn2蛋白的作用，即在茄科植物中至少部分地提供抗卵菌感染，更具體地抗致病疫霉，更具體地抗分離群IPO-C 的抗性或提高抗卵菌感染，更具體地抗致病疫霉，更具體地抗分離群IPO-C抗性。優(yōu)選的變體是僅含有如上所述的常規(guī)氨基酸取代的變體。在術(shù)語“其功能同源物”中還包括同源序列。優(yōu)選地，所述同源物在氨基酸水平上具有高于80%的一致性。更優(yōu)選地，所述氨基酸具有至少85%或90%的一致性。甚至更優(yōu)選的是具有91%、92%、93%、94%或95%—致性的氨基酸。最優(yōu)選的是與Rpi_edn2的氨基酸序列具有有96%、97%、98%或99% —致性的氨基酸。當(dāng)將各序列與圖5中的那些蛋白比對時，根據(jù)本發(fā)明的同源蛋白與Rp1-edn2序列具有更高程度的一致性。
功能同源核酸序列是編碼如上所述的功能同源蛋白的核酸序列。
例如，使用計(jì)算機(jī)程序(諸如BLAST、ClustalW或ClustalX)可以確定同源性和/ 或一致性百分比。
許多核酸序列編碼與圖4所示的Rpi_edn2蛋白100%—致的蛋白。這是因?yàn)楹塑账崛?lián)體中的核苷酸可以在不會改變對應(yīng)氨基酸的情況下發(fā)生改變(核苷酸三聯(lián)體中的擺動)。因而，可以在不影響蛋白氨基酸序列的情況下，改變編碼該蛋白的核苷酸序列。然而在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了如圖4中描述的分離或重組的核酸序列。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種代表Rpi_edn2蛋白編碼序列(CDS)的分離、合成或重組的核酸，即圖4的核苷酸I 2589(加陰影的)或其功能片段或功能同源物。
例如，通過使用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)瞬時轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(農(nóng)桿菌滲入法)和/或使用離體葉片試驗(yàn)，可以測試本文所描述的Rpi_edn2基因和蛋白的片段及其同源物的功能。
農(nóng)桿菌滲入形成功能篩選用于測試候選基因，由此使用含有候選Rp1-edn2同源物或編碼該候選Rpi_edn2同源物的核苷酸序列的農(nóng)桿菌株滲入4周齡野生型本氏煙草植物。滲入后一天或幾天(最多三天)，在離體葉片試驗(yàn)中，使用對本氏煙草有毒性的致病疫霉菌株(例如IPO-C或90128)攻擊經(jīng)滲入的葉片。該系統(tǒng)同樣適用于測試Rpi_edn2的候選同源片段。
如通過農(nóng)桿菌滲入實(shí)現(xiàn)的瞬時基因表達(dá)是用于有用蛋白的高水平表達(dá)的一種快速靈 活且可再現(xiàn)的方法。在植物中，根癌農(nóng)桿菌重組菌株可以用于瞬時表達(dá)已插入細(xì)菌Ti 質(zhì)粒的T-DNA區(qū)域中的基因。將細(xì)菌培養(yǎng)物滲入葉片中，在T-DNA轉(zhuǎn)移期間，在植物細(xì)胞中異位表達(dá)感興趣的基因。但是，由于異位RNA表達(dá)在2 3天后停止，因此使該系統(tǒng)的實(shí)用性受到限制。已示出轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)是該效率不足的主要原因?；诠脖磉_(dá)病毒編碼的基因沉默抑制蛋白(番茄叢矮病毒(TBSV)的pl9蛋白)的系統(tǒng)阻止了滲入組織中的PTGS的起始，從而允許高水平的瞬時表達(dá)。在pl9的存在下，許多蛋白的表達(dá)增加了 50倍或更多，以便可以從少至IOOmg的滲入的葉片材料中實(shí)現(xiàn)蛋白純化。盡管pl9的使用具有優(yōu)點(diǎn)是明顯的，但沒有P19的農(nóng)桿菌滲入也可以用于測試候選片段和功能同源物的功能?？蛇x擇地，各候選基因(例如是片段或同源物)構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化易感的馬鈴薯栽培品種例如Desiree。在離體葉片試驗(yàn)中使用例如分離群H30P04、IPO-C、CA65、USA618或90128攻擊初級轉(zhuǎn)化體。對這些分離群(特別是對IP0-C)具有抗性的轉(zhuǎn)化體攜帶例如Rp1-edn2的功能片段或同源物。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種包含本文提供的核酸的載體，上述核酸即能夠在茄科植物中提供抗卵菌感染的至少部分抗性或提高抗卵菌感染的抗性。更具體地，本發(fā)明提供了一種包含分離、合成或重組的核酸序列的載體，該分離、合成或重組的核酸序列包含編碼圖4的氨基酸序列Rpi_edn2的核酸序列或其功能片段或功能同源物。本發(fā)明還提供了一種包含上述核酸序列的載體?？蛇x擇地，此類載體包含編碼Rpi_edn2蛋白的兩種核苷酸序列。合適的載體的實(shí)例是pBeloBACI1、pBINplus、pKGW_MG或任何可商購的克隆載體。如下所述，存在許多可將本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)移至植物中的途徑。一種合適的轉(zhuǎn)移方法是由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的，其中要轉(zhuǎn)移的核酸是雙元載體的一部分，因此優(yōu)選上述載體是雙元載體。另一種合適的方法是包含編碼Rpi_edn2的基因的植物與不含該基因的植物雜交，且鑒定已經(jīng)遺傳得到Rpi_edn2基因的那些雜交后代。本發(fā)明另外提供了一種包含本文所述核酸或本文所述載體的宿主細(xì)胞。優(yōu)選的宿主細(xì)胞的實(shí)例是適用于BAC克隆的大腸桿菌(E. coli)細(xì)胞(例如DH10B)或農(nóng)桿菌屬(宿主)細(xì)胞。在另一個實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞包括植物細(xì)胞。優(yōu)選的植物細(xì)胞是源自茄科成員的細(xì)胞；甚至更優(yōu)選地，所述植物細(xì)胞包括來自馬鈴薯、番爺(Solanum Iycopersicum)(以前稱作Lycopersicon esculentum)、胡椒屬植物(pepper)和爺子的細(xì)胞。通過技術(shù)人員已知的方法(例如再生方法)，可以從所述細(xì)胞得到轉(zhuǎn)基因或遺傳改造的植物(例如馬鈴薯或番茄植物)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種本文所述的遺傳改造的植物的葉片、塊莖、果實(shí)或種子或部分或后代。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種由本文所述的分離或重組的核酸或其功能片段或功能同源物編碼的蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種由圖4中描述的核酸序列編碼的蛋白。在另一個優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種包括圖4的氨基酸序列或其功能片段或功能同源物的蛋白。本文所描述的Rp1-edn2蛋白包括863個氨基酸。Rpi_edn2與來自S. mochiquense的R基因Rp1-mcql. 1(80%)和Rp1-mcql. 2(77%)享有最高的同源性。但是，如在表6中所示，本發(fā)明的Rpi_edn2蛋白由于它提供對疫霉屬分離群不同譜系的抗性的事實(shí)，而與這些高度同源性的蛋白不同。Rpi~edn2 (與 Rp1-vntl、Tm_22 和 Rp1-mcql.1 一樣)是 CC-NBS-LRR抗性基因大家族的成員。參考基因T m-22、Rp1-vntl和Rp1-mcql.1可被稱為歸于所謂的Tm-22家族子群中，Rp1-edn2成為該Tm_22家族子群的成員。但是，基于序列同源性，可認(rèn)為Rp1-edn2形成該Tm_22家族的新的子類。
如已經(jīng)描述的，Rpi_edn2的功能片段或其功能同源物是能夠在茄科植物中提供抗卵菌感染的至少部分抗性或提高抗卵菌感染的抗性的片段或同源物。
上文中已經(jīng)提供了測試Rp1-edn2的功能片段或功能同源物的功能性的方式。
基于本文所描述的核酸序列，本發(fā)明還提供了探針和引物，即與圖4中描述的(互補(bǔ))DNA鏈互補(bǔ)的寡核苷酸序列。探針例如在Southern或Northern分析中是有用的,且引物例如在PCR分析中是有用的?；诒疚乃枋龅暮怂嵝蛄械囊飳o助在經(jīng)典育種和/ 或通過植物(優(yōu)選地，所述植物是馬鈴薯、番爺(以前稱作Lycopersicon esculentum))、胡椒屬植物和茄子的核酸成分的遺傳改造進(jìn)行育種以選擇能夠表達(dá)例如Rpi_edn2的植物的領(lǐng)域中活躍的植物育種者非常有用。
因此，在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種能夠結(jié)合至如本文所述的核酸或它的互補(bǔ)核酸的結(jié)合分子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，上述結(jié)合分子是引物或探針。如上所述，該結(jié)合分子對于植物育種者是非常有用的，因此本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種用于選擇植物或植物材料或它們的后代對卵菌感染的易感性或抗性的方法。優(yōu)選地，從所述植物分離要被測試的植物的核酸，然后所獲得的核酸與一種或多種(優(yōu)選不同的)結(jié)合分子接觸。研究人員可例如使用PCR分析以測試植物的植物基因組中存在或不存在Rp1-edn2。所述方法在無標(biāo)記物的轉(zhuǎn)化方案(諸如在W003/010319中描述的方案)中特別優(yōu)選。
本文描述的Rpi_edn2蛋白還可用于通過技術(shù)人員已知的方式誘導(dǎo)出抗體。由此, 本發(fā)明還提供了一種(特異性)結(jié)合由本文所描述的分離或重組的核酸(例如圖4的核酸序列)編碼的蛋白的抗體，或一種(特異性)結(jié)合如圖4中描述的蛋白或其功能片段或功能同源物的抗體。所述抗體在蛋白分析方法(諸如Western印跡或ELISA)中有用，因此所述抗體可用于選擇成功表達(dá)Rpi_edn2基因的植物。
基于本文所提供的核酸序列，本發(fā)明還提供了在植物中導(dǎo)入或提高抗卵菌感染的抗性的方式。因此，本發(fā)明還提供了一種用于在植物中提供抗卵菌感染的至少部分抗性或提高抗卵菌感染的抗性的方法，所述方法包括為植物或其部分提供
分離或重組的核酸序列，所述分離或重組的核酸序列包括編碼圖4的Rpi_edn2氨基酸序列的核酸序列或其功能片段或功能同源物；或
載體，所述載體包括如本文所描述的核酸序列；或
如本文所描述的宿主細(xì)胞。
所述用于在植物中提供抗卵菌感染的至少部分抗性或提高抗卵菌感染的抗性的方法可基于經(jīng)典育種，與已經(jīng)包含Rpi_edn2基因的親本植物分離開。或者所述方法涉及將 DAN轉(zhuǎn)移入植物中，即涉及用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法，所述用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法包括為所述植物細(xì)胞提供一個或多種本文所描述的核酸序列或本文所描述的載體或本文所描述的宿主細(xì)胞。
存在多種可將重組核酸轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞的途徑，例如農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。但是， 當(dāng)研究人員希望實(shí)施本發(fā)明時，還存在其它將DNA有效傳遞給受體植物細(xì)胞的方式。值得相信的是，用于將DNA傳遞給植物細(xì)胞的合適方法實(shí)際上包括可以將DNA導(dǎo)入細(xì)胞中的任意方法，諸如通過DNA的直接傳遞(諸如通過PEG-介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化)，通過干燥 / 抑制-介導(dǎo)的 DNA 攝取(Potrykus 等人，Mol. Gen. Genet.，199 :183-188,1985)，通過電穿孔(美國專利號5，384，253),通過與碳化娃纖維一起攪拌(Kaepp ler等人，1990 ;美國專利號5，302，523 ;和美國專利號5，464，765)，及通過DNA包被顆粒的加速(美國專利號5，550, 318 ;美國專利號5，538，877 ;和美國專利號5，538，880)。通過應(yīng)用所述這些技術(shù)，可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)化來自基本任意的植物物種的細(xì)胞，且這些細(xì)胞可以發(fā)育成轉(zhuǎn)基因植物。在使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移的情況下，優(yōu)選使用實(shí)質(zhì)有毒性的農(nóng)桿菌，諸如根癌農(nóng)桿菌(A tumefaciens)(實(shí)例是A281菌株或由其衍生菌株)，或在本領(lǐng)域中可得到的其它有毒性的菌株。這些農(nóng)桿菌菌株攜帶源自Ti質(zhì)粒PTiBo542毒性區(qū)域的DNA區(qū)域，所述Ti質(zhì)粒PTiBo542協(xié)調(diào)T-DNA的加工及該T-DNA向植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移?；谵r(nóng)桿菌的植物轉(zhuǎn)化是本領(lǐng)域眾所周知的，例如，Komari, T.等人的Plant Transformation Technology Agrobacterium-Mediated Transformation(見 Handbook of Plant Biotechnology,Christou, P.和Klee, H.編,約翰威立國際出版公司，奇切斯特(Chichester), UK 2004,第233-262頁)。優(yōu)選地，使用無標(biāo)記物的轉(zhuǎn)化方法，諸如在W003/010319中描述的方法。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用額外的抗性基因轉(zhuǎn)化靶標(biāo)植物，為已知名為“基因堆疊”的現(xiàn)象。如在實(shí)驗(yàn)部分解釋且示出的，多種抗性基因的存在可提高植物抗感染的抗性，因?yàn)槭紫龋鄬τ趯Ω腥驹噭┑牟煌蛛x群或致病型的抗性，這些基因可互相補(bǔ)償；其次，引發(fā)多于一種的抗性機(jī)制(僅靠一種抗性機(jī)制自身將不會導(dǎo)致完全抗性)可導(dǎo)致在宿主植物中抗性反應(yīng)的實(shí)質(zhì)增加，這將足以達(dá)到完全抗性。可選擇地，可通過雜交將Rp1-edn2基因的核酸，及可選的其它抗性基因(如Rp1-mcql.1、Rp1-mcql.2、Rp1-vntl、Rp1-chcl、Rp1-avll.1、Rp1-avll. 2、Rp1-blblΛRp1-blb2、Rp1-blb3及其它很多抗性基因)導(dǎo)入植物中。所述雜交方案從選擇合適的親本植物開始。所述親本植物可以是例如原始的Solanum x edinense基因型(諸如增加物GLKS 25492，GLKS 25493和GLKS 25494)，或通過上述基因工程已得到期望核酸的植物。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，可以使用本領(lǐng)域已知用于雜交的所選擇的植物的任意合適的方法，包括體內(nèi)和體外方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，在合適的時侯，可以使用體外技術(shù)，諸如原生質(zhì)體融合或胚拯救(embryo rescue)。在根據(jù)本發(fā)明方法中用于雜交目的的所選擇的植物可以具有任意類型的倍性。例如，所選擇的植物可以是單倍體、二倍體、四倍體或五倍體。使用四倍體植物雜交多倍體植物的方法在本領(lǐng)域是公知的，且本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地應(yīng)用。例如，已在育種計(jì)劃，特別是用于S. X edinense抗致病疫霉良好的大田抗性中使用了很長時間的S. X edinense (van Soest, 1984)。使用四倍體變種(例如并行體)的五倍體S. X edinense的雜交產(chǎn)生四倍體后代。對于馬鈴薯，優(yōu)選是具有抗性的四倍體植物，已知四倍體植物具有塊莖的較高產(chǎn)量。優(yōu)選地，使用經(jīng)典的體內(nèi)雜交方法使選擇的植物彼此雜交，所述經(jīng)典的體內(nèi)雜交方法包括一次或多次包括自交的雜交步驟。通過實(shí)施上述經(jīng)典雜交步驟，可以在后代中組合兩種親本的特征。例如，可以使提供高產(chǎn)量的植物與含有大量某種營養(yǎng)物的植物雜交。所述雜交會得到包含兩種特征的后代，即不僅包含大量營養(yǎng)物而且還提供高產(chǎn)量的植物。當(dāng)實(shí)施回交時，F(xiàn)l后代與它的高產(chǎn)親本P之一雜交，以確保F2后代的特征類似于高產(chǎn)親本的特征。例如，為了最終提供具有卵菌抗性的高產(chǎn)四倍體后代的目的，使用秋水仙素使選擇的具有卵菌抗性的二倍體馬鈴薯成為四倍體，然后與選擇的高產(chǎn)四倍體馬鈴薯栽培品種雜交。另外，還可以實(shí)施自交。選擇的植物(親本或后代)與它們自身雜交，以產(chǎn)生用于育種的自交系變種(inbred variety)。例如,從上述Fl后代選出的樣本與它們自身雜交以得到F2后代，從該F2后代中可以選擇出具有水平增加的抗性的樣本。
在將核酸轉(zhuǎn)移至植物或植物細(xì)胞中以后，必須確定哪些植物或植物細(xì)胞已經(jīng)具有所述核酸。當(dāng)在根據(jù)本發(fā)明的方法中選擇和雜交親本基因型時，在至少一個選擇步驟中使用標(biāo)記物來輔助選擇。本領(lǐng)域已知，可在體內(nèi)和體外發(fā)現(xiàn)處于不同生物學(xué)水平的指示某種特性或狀況的標(biāo)記物。例如，可在肽水平或基因水平上發(fā)現(xiàn)標(biāo)記物。在基因水平，可以在 RNA水平或DNA水平上檢測標(biāo)志物。優(yōu)選地，在本發(fā)明中，在DNA水平上檢測所述標(biāo)記物的存在?？蛇x擇地，通過特異性結(jié)合Rpi_edn2蛋白的抗體轉(zhuǎn)化免疫測定，可以評估Rpi_edn2 蛋白在植物部分中的適當(dāng)表達(dá)。與根據(jù)本發(fā)明的引物和探針最接近地，還可以利用在編碼序列附近發(fā)現(xiàn)的特異性標(biāo)記物。在下面的實(shí)驗(yàn)部分中示出了上述標(biāo)記物，包括在表7中示出的Tm2-樣圖譜的標(biāo)記物。高度優(yōu)選的標(biāo)記物是Tml900、Tml9F_Mse、Stm021、mcq-ATGl、 mcq-c2-終止、EDN-F和EDN-R，以及用于在實(shí)驗(yàn)部分和表5中描述的Tm2_樣圖譜的引物。 甚至更高度優(yōu)選的標(biāo)記物源自圖4中示出的核酸序列。建議該序列的各部分對基因是唯一的，從而該序列的部分可用作非常特異的標(biāo)記物。
在轉(zhuǎn)基因方法的情況中，通過使用可選擇的標(biāo)記物或報(bào)告基因可實(shí)現(xiàn)選擇轉(zhuǎn)化的植物。在選擇性標(biāo)記物或選擇中，在植物轉(zhuǎn)化中使用最廣泛的基因是EP131623中提出的賦予抗選擇性試劑卡那霉素抗性的細(xì)菌新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptl、nptll和nptIII基因)，及在EP186425中提出的賦予抗潮霉素抗性的細(xì)菌aphIV基因。EP275957公開了來自產(chǎn)綠色鏈霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的乙?；D(zhuǎn)移酶基因的應(yīng)用，該乙?；D(zhuǎn)移酶基因賦予抗除草劑草胺膦(phosphinotricin)的抗性。EP218571中提出了賦予抗除草劑草甘膦相對抗性的植物基因。報(bào)告基因適合的實(shí)例是葡糖醛酸酶(GUS)、 β_半乳糖苷酶、螢光素酶和綠色熒光蛋白(GFP)。然而優(yōu)選使用無標(biāo)記物的方法(諸如在 W003/010319中公開的方法)，其中使用基于核苷酸序列的試驗(yàn)可測定抗性基因的存在。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于在植物中提供抗卵菌感染的部分抗性或提高抗卵菌感染的抗性的方法，所述方法包括為植物或其部分提供
分離或重組的核酸序列，所述分離或重組的核酸序列包括編碼Rpi_edn2氨基酸序列(見圖4)的核酸序列或其功能片段或功能同源物；或
載體，所述載體包括本文所描述的核酸序列；或
如本文所描述的宿主細(xì)胞，
其中，所述卵菌包括疫霉屬、優(yōu)選致病疫霉；和/或其中，所述植物包括來自茄科的植物，優(yōu)選馬鈴薯或番茄植物，更優(yōu)選四倍體的馬鈴薯植物。
本發(fā)明還提供了一種植物，所述植物可使用如上所述的用于在植物中提供抗卵菌感染至少部分抗性或提高抗卵菌感染的抗性的方法得到。優(yōu) 選的植物是來自茄科的植物，更優(yōu)選地，所述植物是馬鈴薯或Solanum Iycopersicum(以前稱作Lycopersicon esculentum)、Solanum melononga、Capsicum spp (諸如 C. annuum、C. baccatum、C.chinense、C. frutescens和C. pubescens)。因而本發(fā)明還提供了一種植物，所述植物已經(jīng)具有編碼Rpi_edn2蛋白的核酸或其功能片段或功能同源物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種根據(jù)本發(fā)明植物的轉(zhuǎn)基因植物部分或后代，所述根據(jù)本發(fā)明的植物包含編碼圖4的Rp1-edn2氨基酸序列的核酸或其功能片段或功能同源物。
在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，將本文所述的核酸轉(zhuǎn)移至除Solanum edinense以外的茄屬變種，即將本文所述的核酸優(yōu)選提供給具有非edinense背景的植物，優(yōu)選S. lycopersicon或馬鈴薯。其中后者最優(yōu)選是四倍體變種，更優(yōu)選是商業(yè)上感興趣的變種，諸如 Bint je、Desiree 或 Premiere、Spunta、Nicola、Favorit、Russet Burbank、Aveka 或Lady Rosetta。還可將根據(jù)本發(fā)明的抗性提供給對卵菌感染已經(jīng)具有部分抗性的植物，其中為所述植物提供編碼其它抗性基因(諸如Rp1-blbl、Rp1-blb-2、Rp1-blb-3、Rp1-vntl、Rp1-chcl、Rp1-avl 1-1 > Rpi_avll_2、Rp1-Rl> Rpi_R2、Rpi_R3a、Rpi_R3b、Rp1-mcdl 或Rp1-mcql)的核酸。為了向植物提供抗卵菌感染的至少部分抗性，本發(fā)明進(jìn)一步提供了分離或重組的核酸序列的應(yīng)用，所述分離或重組的核酸序列包含編碼圖4的Rpi_edn2氨基酸序列的核酸序列或其功能片段或功能同源物；或包含任意所述核酸序列的載體的應(yīng)用；或包含任意所述核酸序列或所述載體的宿主細(xì)胞的應(yīng)用。在一個優(yōu)選實(shí)施例中，所述卵菌包括疫霉屬菌，甚至更優(yōu)選包括致病疫霉。在另一個優(yōu)選實(shí)施例中，所述植物包括馬鈴薯或SolanumIycopersicum (以前稱作 Lycopersicon esculentum)。在又一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)Rpi_edn2蛋白或其功能片段或功能同源物的方法，所述方法包括將本文描述的核酸功能性地連接至調(diào)節(jié)序列，且允許所述核酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)。調(diào)節(jié)序列的實(shí)例為啟動子和/或終止子序列 。此外，攜帶本發(fā)明的抗性分子的植物還示出特異的病原體圖譜，在這個意義下，所述植物將示出與源自致病疫霉的不同分離群的許多誘導(dǎo)子或效應(yīng)物分子的過敏反應(yīng)(結(jié)果為受感染組織的壞死)。如在表9中可見的，幾種效應(yīng)物誘發(fā)avl478-2植物中的該應(yīng)答(更多細(xì)節(jié)參見實(shí)驗(yàn)部分)，諸如 PITG_20336、PITG_14039、PITG_20301、PITG_20303、PITG_20300、PITG_22880、PITG_09616、PITG_10540、PITG_15039、PITG_04097、PITG_04169、PITG_16726、PITG_23131 和 PITG_07550_9,而其它效應(yīng)物(諸如 Avr3a、Avr-vntl、Avr-blbl、PITG_00774和PITG_10465)僅示出沒有或極小的應(yīng)答。因此，本發(fā)明的多個部分還為當(dāng)轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物且在植物中表達(dá)時示出對病原體效應(yīng)物應(yīng)答的那些核酸，所述病原體效應(yīng)物類似于在表7中描述的圖譜，更具體的是示出以多于50%的情況在HR發(fā)生中示出對 PITG_20336、PITG_14039、PITG_20301、PITG_20303、PITG_20300、PITG_22880、PITG_09616、PITG_10540、PITG_15039、PITG_04097、PITG_04169、PITG_16726、PITG_23131和 PITG_07550_9 的反應(yīng)。將以下面非限制性的實(shí)例更加詳細(xì)的解釋本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)部分在本研究中，我們旨于鑒定負(fù)責(zé)在S. X edinense中抗致病疫霉的高水平抗性的R基因的定位位置，用于進(jìn)一步的基于基因圖譜的克隆。從與CV.并行體雜交的不同S. X edinense基因型(ednl51_l和ednl50_4)產(chǎn)生兩種隔離種群。使用可以在不同的R基因之間進(jìn)行區(qū)分分離群和效應(yīng)物測試該兩種隔離種群(Champouret 2010 ；0h等2009 ；Vleeshouwers 等 2008)。使用 SSR標(biāo)記物、NBS 作圖(profiling) (van der Linden 等 2004)和CAPS標(biāo)記物將抗性的隔離連接至染色體位置。對于不同的R基因開發(fā)基因家族導(dǎo)向的圖譜分析(⑶FP)，且成功實(shí)施⑶FP以獲得與那些R基因密切連接的標(biāo)記物。
材料和方法
植物材料和定位種群(mapping population)
由德國(GLKS)的馬鈴薯收藏大 Liisewitz (Potato Collection Gross Liisewitz) 提供S. X edinense P. Berthault增加物。從接近墨西哥的托盧卡(Toluca de Lerdo)區(qū)域收集該增加物(SolRgene 數(shù)據(jù)庫，http://www. plantbreeding. wur. nl/phytophthora/)。 篩選來自三種S. x edinense增加物(GLKS 25492,GLKS 25493和GLSK 25494)的十五種基因型對致病疫霉的抗性。選擇兩種抗性基因型，且該兩種抗性基因型與易感的cv.并形體雜交以產(chǎn)生Fl定位種群。轉(zhuǎn)移感興趣的重組Fl基因型以進(jìn)行體外培養(yǎng)，以維持并增殖該重組Fl基因型。具有抗性的個體Ednl50-4-104與cv Aveka雜交(圖1)。具有抗性的克隆RH4x-149-006與KA2002-5030雜交以產(chǎn)生隔離種群KA2006-515。在大田中測試100個個體對致病疫霉IPO-C的抗性?？剐砸?:1在得到的后代中隔離，表示在具有抗性的親本中一個主要Rpi基因的存在。
疫霉屬分尚群和疾病測試
疫霉屬分離群和它們的種特異性及來源示于表I中。通過Geert Kessel>Francine Govers (瓦格寧根大學(xué)，荷蘭)和Paul Birch (鄧迪大學(xué)，蘇格蘭，英國)可獲得這些分離群。通過三種不同的疾病試驗(yàn)測試植物的抗性體外試驗(yàn)(Huang 2005)、離體葉片試驗(yàn) (Vleeshouwers等1999)和大田實(shí)驗(yàn)。使用致病疫霉分離群90128在五株小植物上進(jìn)行一次體外試驗(yàn)。在離體葉片試驗(yàn)中，從五周齡的植物收集在第三和第五完全發(fā)育的葉片之間的一個葉片，且使用兩種分離群90128和IPO-C接種該葉片。六天后對葉片進(jìn)行評分，由于過敏感應(yīng)答(hypersensitive response, HR)評為具有抗性(R)，如果出現(xiàn)孢子病變則評為易感(S)，或因?yàn)闊o明確抗性或易感的應(yīng)答被評為定量的(quantitative，Q)。在荷蘭的瓦格寧根，于2005年和2007年的夏天進(jìn)行了包括S. X edinense基因型的兩次大田試驗(yàn)。每次大田試驗(yàn)由兩個隨機(jī)化的田區(qū)(block)組成，且在這兩個田區(qū)中，基因型表示為作為單個實(shí)驗(yàn)單元處理的四種植物的小塊試驗(yàn)田(如Colon和Budding(1988)所描述的)。 為了在不同年份之間進(jìn)行對比，包括了標(biāo)準(zhǔn)栽培品種Ostara、Bildtstar、Eersteling、Pimpernel、 Robijn和Biogold。撒料機(jī)(spreader)排由馬鈴薯栽培品種Bintje組成,邊界排由馬鈴薯栽培品種Nicola組成。為了進(jìn)行接種生產(chǎn)，在離體葉片試驗(yàn)中使用分離群IPO-C接種大量馬鈴薯栽培品種Bintje的葉片。六天后，洗掉孢子以在大型容器中制備孢子懸浮液。通過于10°C在容器中培養(yǎng)誘導(dǎo)游動孢子釋放。在傍晚，使用具有兩個噴射臂的拖拉機(jī)將游動孢子懸浮液噴射到馬鈴薯大田上。以每周為間隔進(jìn)行疾病評估。對各樣地估計(jì)覆蓋晚疫病病變的葉片區(qū)域的百分比(Colon等1988)。從這些讀數(shù)計(jì)算疾病發(fā)展曲線下方的面積 (AUDPC) (Fry 1978)，隨后將AUDPC值轉(zhuǎn)化成I (易感的) 9 (具有抗性)的級別(SolRgene 數(shù)據(jù)庫)。
標(biāo)記物的開發(fā)
從在溫室中生長的植物收集幼小的葉片組織。通過下面的CTAB方案(Park等 2005)，使用Retsch儀器以96孔的版式分離基因組DNA。在本研究中使用了幾個標(biāo)記物技術(shù)CAPS標(biāo)記物，SSR標(biāo)記物,NBS作圖標(biāo)記物(van der Linden等2004)和不出特定R基因家族的R基因家族導(dǎo)向的(GFDP)作圖標(biāo)記物。
應(yīng)用覆蓋馬鈴薯基因組(Collins等 1999 ;Feingold 等 2005 ;Ghislain 等 2004)的一組大約80個SSR標(biāo)記物，以確定隔離的R基因的染色體位置。來自定位種群的親本基因組DNA以及11個有抗性的Fl個體和11個易感的Fl個體用于SSR標(biāo)記物篩選。使用單個PCR程序進(jìn)行SSR標(biāo)記物的PCR反應(yīng)初始循環(huán)，95°C 2分鐘；然后包括95°C 30秒， 56 0C 30秒(使用1°C /分鐘的變速(ramp))，及72°C 45秒(使用1°C /分鐘的變速)的30 個循環(huán)；及，最終步驟，720C 3分鐘。隨后在丙烯酰胺凝膠上跑PCR產(chǎn)物，且使用L1-COR技術(shù)(Lincoln,內(nèi)布拉斯加,美國)可視化。
為了證實(shí)定位位置且獲得連接至R基因的PCR標(biāo)記物，測試了來自SGN數(shù)據(jù)庫 (http://solgenomics. net/)的已知CAPS標(biāo)記物,及位于在已鑒定的染色體臂上的R基因簇附近的SH X RH基因圖譜(van Os等，2006)。
使用基因家族導(dǎo)向的作圖來開發(fā)緊密連接至R基因的標(biāo)記物。通過用基因家族特異的引物取代NBS引物，按照之前描述的NBS作圖(van der Linden等2004)進(jìn)行基因家族導(dǎo)向的作圖。對于三種R基因家族R2、Tm2和N,收集了從NCBI (http://www. ncb1. nlm. nih. gov/)可獲得的序列和來自我們實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的等位基因發(fā)掘研究的序列，并進(jìn)行了比對。對于基因的不同結(jié)構(gòu)域上的各家族(CC或TIR，NBS和LRR)(表I)，在保守序列上設(shè)計(jì)引物。特別為N樣作圖設(shè)計(jì)一些簡并的引物。該分析與對Fl種群的集群分離分析法(BSA， Michelmore等1991)組合。集中提供抗性表型或易感表型的八個Fl個體,且使用引物/酶組合進(jìn)行篩選。通過丙烯酰胺凝膠上的電泳使PCR產(chǎn)物可視化。從凝膠中切出已鑒定出與抗性相關(guān)聯(lián)的片段，且測序。
效應(yīng)物篩選
克隆源自致病疫霉基因組(Haas等2009)的大約250個RXLR編碼基因(還被稱為效應(yīng)物)的集合，使得它們的信號肽在雙35S啟動子的控制下不進(jìn)入雙元載體pMDC32 中。所有的質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒pBBRlMCS-5. virGN54D(Van Der Fits等2000)組合導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株AGLl (Lazo等1991)中。在從體外增殖移植后三周，在幼小的ednl50_4植物上進(jìn)行農(nóng)桿菌滲入。在總的24個重復(fù)(implication)中，制得每個效應(yīng)物克隆。使用R3a 和Avr3a(Bos等2006)作為陽性對照，空的pMDC32作為陰性對照。通過van der Hoorn等 (2000)描述的方法經(jīng)一些適應(yīng)性改變進(jìn)行重組根癌農(nóng)桿菌的農(nóng)桿菌滲入實(shí)驗(yàn)。
根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)物在補(bǔ)充有抗生`素的3ml的LB培養(yǎng)基中生長，以選擇根癌農(nóng)桿菌菌株(羧芐青霉素)、雙元載體(卡那霉素或壯觀霉素)和輔助質(zhì)粒(氯霉素)。第二天， 將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充有抗生素的15ml的YEB培養(yǎng)基中，以選擇載體和輔助質(zhì)粒。在第三天，收獲細(xì)胞，并重懸在補(bǔ)充有乙酰丁香酮的MMA溶液中至最終0D600為0. 3。從滲入后的 3 8天評分應(yīng)答，對通過(過敏感的)細(xì)胞死亡對滲入的反應(yīng)的重復(fù)數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，且計(jì)算反應(yīng)性滲入的百分比。
對于與效應(yīng)物克隆的Rpi_edn2共滲入，制備OD6tltl = 0. 5的農(nóng)桿菌在MMA中的懸浮液。連續(xù)制成各農(nóng)桿菌懸浮液的1:1混合物，且滲入到本氏煙草植物的葉片中。滲入后一星期，評價過敏感細(xì)胞死亡的出現(xiàn)。
實(shí)施例1
在Solanum x edinense增加物中對致病疫霉抗性的篩選
為了鑒定用于R基因定位和克隆的抗性基因型,在來自三種Solanum x edinense 增加物的總的15種基因型中測試了對致病疫霉的抗性。通過使用分離群90128進(jìn)行的體外試驗(yàn)首先測試了 15個個體。14種基因型給出了高水平抗性，一種基因型具有較低水平的抗性(表2)。從各增加物中，每種增加物選擇兩種高抗性基因型。在離體葉片試驗(yàn)中證實(shí)它們對分離群90128的抗性，且使用額外的分離群IPO-C接種也得出抗性表型。在2005年和2007年的兩次大田實(shí)驗(yàn)證實(shí)在所有測試基因型中對IPO-C的強(qiáng)抗性。選擇兩種抗性基因型ednl50-4和ednl51_l產(chǎn)生Fl種群。在定位種群中的抗性的隔離基因型ednl50_4和ednl51_l與cv.并形體雜交以產(chǎn)生Fl定位種群。在離體葉片實(shí)驗(yàn)中，對各Fl個體進(jìn)行表型分析對四種不同的致病疫霉分離群的抗性。測試了來自ednl50_4 x cv.并形體種群的159個個體及來自ednl51_l x cv.并形體種群的125個個體。對四種分離群的每一種分離群的抗性隔離在兩個種群中(表3)。對90128的抗性隔離在兩個種群中。對90128的抗性的隔離模式不同于對其它隔離群的抗性的隔離模式。Champouret (2010)在S. x edinense基因型ednl51_3中克隆到兩個功能R2同源物(Rp1-ednl.1和R2-樣)。R2賦予對90128的抗性，及賦予對在該種群上測試的其它分離群的易感性。因此，假定賦予對90128的抗性的R基因(Rp1-ednl)定位于R2簇。在兩個種群中對IPO-C的抗性的隔離也仿效不同于對分離群PIC99189和UK7824的抗性的隔離的模式(表4)。這暗示著至少三種R-基因是形成觀察到的隔離模式的原因，且這三種基因可基于它們的分離群識別圖譜進(jìn)行區(qū)分?？傊?，兩個Fl種群示出對三種分離群(90128、99189和UK7824)的抗性和易感性(表3)的相似的隔離比率，且所述相似的隔離比率在分離群之間是獨(dú)立的(表4)。在兩個種群中對IPO-C的抗性的隔離是輕微歪斜的。但是種群ednl51-l x cv.并形體中具有抗性的Fl植物的數(shù)量較高，而種群ednl50-4 x cv.并形體中易感Fl植物的數(shù)量較高?？赏茰y三種R基因的相同組存在于兩種S. X edinense親本基因型中。因此，本研究的剩余部分僅著重于一個Fl種群ednl50-4x cv.并形體。標(biāo)記物開發(fā)使用種群ednl50_4 x cv.并形體對在種群中隔離的R基因進(jìn)行定位。已知源自ednl50-4的Rp1-ednl.1和源自親本并形體的RlO的兩種基因的定位位置。所有我們測試了已知存在于感興趣基因座中的標(biāo)記物。對于定位于染色體4上的R2簇中的Rp1-ednl. 1，進(jìn)行R2基因家族的作圖。RlO定位于R3簇中的染色體11上(Bradshaw等2006)，因此測試了來自R3簇的CAPS標(biāo)記物。其它兩種基因的定位位置是未知的，且進(jìn)行了基因組的廣泛篩選。進(jìn)行SSR篩選和NBS作圖，以確定給予對IPO-C抗性的R基因，及給予對PIC99189的抗性的R基因的定位位置。為了該目的選擇出對所有分離群均具有抗性或易感性的Fl個體的子集。使Fl個體的DNA保持分離用于SSR篩選，且擴(kuò)大Fl個體的DNA用于NBS作圖。來自R2族的Rp1-ednl存在于ednl50_4中 已經(jīng)從基因型ednl51_3克隆得到同源物R-樣和Rp1-ednl. 1，該基因型ednl51_3源自如ednl51-l的相同的增加物(Champouret 2010)。我們研究了該基因是否也存在于ednl50-4中。在R2基因家族的幾個保守區(qū)域上設(shè)計(jì)了 7個R2作圖引物(表I)。與RsaI組合測試上述引物，RsaI在親本和Fl擴(kuò)大的DNA上的R2序列中進(jìn)行頻繁地切割。每一引物揭示了示出與群集體(bulk)中的抗性相關(guān)聯(lián)的至少一個片段。在整個種群的個體上測試給出最大量多態(tài)性帶的引物(R2ch4F4)。得到的NBS標(biāo)記物R2ch4F4-Rsa(400bp的片段) 與對90128的抗性相聯(lián)系，在45個個體中具有10個重組體( 20cM)。在種群的一個子集上進(jìn)行使用PiAvr2的農(nóng)桿菌滲入，且證實(shí)在40個Fl個體中PiAvr2應(yīng)答與對90128的抗性共隔離(圖2)。從而證實(shí)在ednl50-4中的R2簇中的染色體4上Rpi_edn(R2-樣或 Rp1-ednl.1或兩者)的存在。
Rpi_edn2定位在染色體9上
施加在親本及24個Fl個體上的一組大約80個SSR的篩選得到與對IPO-C的抗性相關(guān)聯(lián)的一個連接的標(biāo)記物。該標(biāo)記物Stm021 (表5)位于染色體9上(Bakker等,原稿在準(zhǔn)備中)。通過116個個體中的17個重組體( 15cM)證實(shí)了與對IPO-C抗性的連鎖。 我們提議稱賦予對IPO-C的抗性的R基因位于染色體9長臂上的該基因?yàn)镽pi_edn2(圖 3)。標(biāo)記物Stm021位于染色體9上的兩個已知R基因之間包含來自S. venturii的R基因的簇，Tm-22同源物(Foster等2009 ；Pel等2009);及包含Rpiicql的簇，也為Tm_22同源物(Smilde等2005 ;專利W02009013468)。Tm_22是來自番茄的R基因，位于染色體9的上臂上，且賦予對煙草花葉病毒的抗性(Lanfermei jer等2003)。需要更多的標(biāo)記物以確定 Rp1-edn2是否可能定位于這些簇中的一個中。來自基因組那些區(qū)域的CAPS標(biāo)記物的開發(fā)沒有成功，因?yàn)闇y試的13個引物組合沒有一個揭示出連鎖(linkage)。因此，為了開發(fā)緊密連鎖的標(biāo)記物且確定R基因的確切位置，進(jìn)行了 Tm-22基因家族的作圖(profiling)。在親本和Fl群集的DNA上與兩種酶RsaI和MseI組合設(shè)計(jì)和測試了 12種Tm_22特異性引物(表 I)。兩種引物/酶的組合揭示了群集DNA中與抗IPO-C的抗性之間的聯(lián)系，但僅證實(shí)了一種標(biāo)記物。標(biāo)記物Tml9F-Mse連鎖至Rpi_edn2，且在107個個體中有6個重組體( 6cM)。 從凝膠中切出示出與表型聯(lián)系的70bp片段,并進(jìn)行測序。該序列與Rp1-vntl和Rpi_mcql 的對比不能揭示標(biāo)記物來源的簇。使用用于克隆Rp1-vntl的起始密碼子和終止密碼子引物的PCR反應(yīng)沒有在S. X edinense表 型的任一種上得到任意的擴(kuò)增產(chǎn)物，表明該簇沒有存在于兩種edn基因型中。
使用候選基因/等位基因發(fā)掘途徑的Rp1-edn2的克隆
迄今為止，典型地通過位置克隆策略進(jìn)行R基因的克隆。一旦從特定地R基因座克隆功能基因，則可嘗試從相同或不同品種克隆功能同源物以確定在給定基因座處的序列多樣性。這里，我們證實(shí)基于定位位置且與候選基因發(fā)掘途徑結(jié)合，可產(chǎn)生等位基因的特異性標(biāo)記物，該特異性標(biāo)記物可形成用于功能R基因克隆的起始位點(diǎn)。
本發(fā)明人采用了基于同源物的候選基因發(fā)掘策略以克隆Rp1-edn2。第一步驟為設(shè)計(jì)并入候選mcq I基因同源物的推定的起始和終止密碼子的引物，即mcq-ATG-1 5’ -atggctgaaattcttcttac-3J,mcq-cl-終止 5’ -tcatattctgagctttgcaag-3J，mcq-c2_ 終止 5，-tcatactctcagttttgcaagtc-3，(表 5)。引物 mcq-ATG-1 與引物反向 2 組合擴(kuò)增 mcq 中的功能基因。
當(dāng)在兩種定位種群的親本基因型上測試時,使用引物組mcq-ATG和mcq-cl-終止沒有產(chǎn)生期望大小的擴(kuò)增子。然而當(dāng)組合mcq-ATG-Ι和mcq-c2-終止時，在既具有抗性又易感的后代中均擴(kuò)增出大約2. 4kb的單個擴(kuò)增子。隨后，對既易感又具有抗性的植物的 PCR 產(chǎn)物均進(jìn)行使用限制酶 Msel、Hael 11、NlaII1、HpaI1、DpnI1、AIu1、Hha1、Hinf1、Dde1、HpychIV、Rsal或TaqI的限制性酶切。經(jīng)過MseI酶切后,可看到大約600bp的特異的限制性片段，該大約600bp的特異的限制性片段在疫霉屬抗性隔離的60種基因型中100%連鎖。將具有抗性的植物的未經(jīng)酶切的PCR產(chǎn)物克隆至PGEMk-T Easy載體中，且24個克隆進(jìn)行MseI酶切。基于MseI酶切模式可區(qū)分出總共9種不同的類別。對所有9種類別的克隆進(jìn)行測序。獲得的序列彼此享有80 90%的相似性。基于MseI酶切模式，預(yù)測EDN61導(dǎo)致與Rp1-edn2共隔離的多態(tài)性。在初始的定位種群中為EDN61設(shè)計(jì)了特異性SCAR標(biāo)記物EDNF5’ -gcatcatgtctgcacctatg-3’ 和 EDN R 5’ ctttgatgtggatggatggtg-3’(表 5)。當(dāng)測試時，標(biāo)記物與抗性共隔離，證實(shí)了 EDN61與Rp1-edn2在基因方面非常接近，且潛在地可能是Rp1-edn2的候選者。Rp1-edn2的基因結(jié)構(gòu)Rp1-edn2的開放閱讀框編碼863個氨基酸的預(yù)測的肽。該基因沒有內(nèi)含子。Rp1-edn2的蛋白序列攜帶R蛋白的CC-NBS-LRR類別的幾個保守基序(圖8)。卷曲螺旋(CC)結(jié)構(gòu)域位于蛋白的氨基酸I和153之間的N末端部分。在第一個153個殘基中，可在Rp1-edn2中識別由疏水殘基組成的三對推定的七肽基序?？稍诎被嵫由於?strech)殘基153和444之間(Ploop ，激酶-2，GLPL)識別NB-ARC (核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，凋亡，R 基因產(chǎn)物，CED-4)結(jié)構(gòu)域(Van der Biezen 和 Jones 1998)。Rpi_edn2 的 C 末端一半包括可根據(jù)共有序列LxxLxxLxxLxLxxC/N/Sx (X) LxxLPxx對齊的一系列具有不規(guī)則大小的15個LRR基序，其中X是任意氨基酸，且其中L代表1、L或V (McHaIe等2006)。在蛋白水平上，Rp1-edn2享有與RpincqL I的80 %的氨基酸一致性，與Rp1-mcql. 2的77%的氨基酸一致性。而發(fā)現(xiàn)與Rp1-vntl (73% )和Tm-2_2具有較低的百分比的同源性，分別享有73%和72%的一致性，示出Rp1-edn2限定了 Tm-2_2基因家族的新的子類別。計(jì)算出的核苷酸一致性如下
權(quán)利要求
1.一種分離或重組的核酸序列，包括編碼圖4的氨基酸序列Rpi_edn2的核酸序列或該核酸序列的功能片段或功能同源物，所述氨基酸序列Rpi_edn2提供對卵菌感染的至少部分抗性，所述功能同源物為與圖4的氨基酸序列Rp1-edn2具有超過80%—致性的氨基酸序列進(jìn)行編碼。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離或重組的核酸序列，包括如圖4中描述的核酸序列。
3.—種包括根據(jù)權(quán)利要求1 2中任一項(xiàng)所述的核酸序列的載體。
4.一種宿主細(xì)胞,包括根據(jù)權(quán)利要求1 2中任一項(xiàng)所述的核酸序列或根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體，所述宿主細(xì)胞優(yōu)選為農(nóng)桿菌細(xì)胞或植物細(xì)胞。
5.一種植物細(xì)胞，包括根據(jù)權(quán)利要求1 2中任一項(xiàng)所述的核酸序列或根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體，優(yōu)選地，其中所述植物細(xì)胞是來自茄科的細(xì)胞，更優(yōu)選地是來自馬鈴薯的細(xì)胞，更優(yōu)選地是來自四倍體馬鈴薯的細(xì)胞。
6.一種包括根據(jù)權(quán)利要求5所述的細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物。
7.一種源自根據(jù)權(quán)利要求6所述的植物的一部分，更優(yōu)選地，其中所述部分是塊莖。
8.一種由根據(jù)權(quán)利要求1 2中任一項(xiàng)所述的分離或重組的核酸或它的功能片段或功能同源物編碼的蛋白，優(yōu)選地，其中所述蛋白具有如圖4中描述的Rp1-edn2的氨基酸序列。
9.一種(特異性)結(jié)合根據(jù)權(quán)利要求8所述的蛋白的抗體。
10.一種用于在植物中提供抗卵菌感染的至少部分抗性或提高抗卵菌感染的抗性的方法，包括通過轉(zhuǎn)化對植物或所述植物的一部分提供根據(jù)權(quán)利要求1 2中任一項(xiàng)所述的核酸，或根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體，或根據(jù)權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞；或者，為所述植物提供根據(jù)權(quán)利要求8所述的蛋白；優(yōu)選地，其中所述植物是來自茄科的植物，更優(yōu)選地是馬鈴薯。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述卵菌包括疫霉屬，優(yōu)選地包括致病疫霉。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的方法，其中還為所述植物提供編碼選自Rp1-blbl、Rpi_blb2、Rpi_blb3、Rpi_chql_l、Rpi_chql_2、Rpi_vntl、Rpi_chcl、Rpi_ednl、Rpi_edn3、Rp1-m c q I和它們的組合的組中的抗性蛋白的核酸。
13.—種能夠特異性結(jié)合根據(jù)權(quán)利要求1 2中任一項(xiàng)所述的核酸或它的互補(bǔ)核酸的結(jié)合分子，優(yōu)選地，其中所述結(jié)合分子是引物或探針，優(yōu)選地是如下的引物選自表7中描述的Tm2-作圖的引物的組，或選自表5中描述的染色體9的引物的組，或特異性結(jié)合如圖4中描述的核苷酸序列或它的一部分。
14.一種用于選擇植物或植物材料或它們的后代對卵菌感染的易感性或抗性的方法，所述方法包括以下步驟測試所述植物或植物材料或它們的后代的至少一部分存在或沒有如權(quán)利要求1 2中任一項(xiàng)所述的核酸， 優(yōu)選地，其中使用根據(jù)權(quán)利要求13所述引物或探針進(jìn)行所述測試，或 其中所述測試包含檢測選自表7中描述的Tm2-作圖的引物的組，或選自表5中描述的染色體9的引物的組中的一種或多種標(biāo)記物的存在，或 其中所述標(biāo)記物包括如圖4中描述的所述核苷酸序列的一部分。
15.一種用于培育具有抗性的四倍體植物的方法，包括 a.使用已經(jīng)包含根據(jù)權(quán)利要求1 2中任一項(xiàng)所述的核酸序列的五倍體植物的配子與四倍體植物的配子雜交；以及C.選擇存在所述核酸序列的所述雜交的后代。
16.一種用于在植物育種中進(jìn)行標(biāo)記物輔助的選擇以獲得抗卵菌抗性的標(biāo)記物，其中所述標(biāo)記物挑選自如下的標(biāo)記物選自表7中描述的Tm2-作圖的引物的組,或表5中描述的染色體9的引物的組中；其中所述標(biāo)記物包括如圖4中描述的所述核苷酸序列的一部分。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從S.x edinense分離的新的抗性基因，Rpi-edn2和它的功能同源物或功能片段。另外，本發(fā)明涉及所述抗性基因的應(yīng)用，例如所述抗性基因在提高或賦予植物中對卵菌感染的至少部分抗性的方法中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種分離或重組的核酸序列，所述分離或重組的核酸序列包括編碼圖4的氨基酸序列之一的核酸序列或其功能片段或功能同源物。
文檔編號A01N65/38GK103038350SQ201180027203
公開日2013年4月10日 申請日期2011年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月31日
發(fā)明者尼古拉斯·克萊門斯·瑪麗亞·亨里克斯·德·韋滕, E·C·韋爾佐, 雅各布斯·胡貝圖斯·福森, 漢德里克·里特曼, 維維安·赫爾特魯達(dá)·安東尼亞·安娜·福勒斯浩瓦斯, 埃弗特·雅各布森, 理查德·杰拉爾德斯·弗朗西斯庫斯·菲瑟 申請人:艾維貝合作公司