專利名稱：產石杉堿甲的離體蛇足石杉葉狀體誘導和增殖的培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ー種植物生物技木，即離體誘導和増殖的培養(yǎng)方法，尤其涉及ー種產石杉堿甲的離體蛇足石杉葉狀體誘導和増殖的培養(yǎng)方法。
背景技術：
Huperzia serrata(Thunb. ex Murray)Trev. , X^i =^B.^^Si^fk^ 蛇足草等，為石杉科石杉屬蕨類植物，全草入藥。自1972年國內首次報道該植物中的生物堿-石杉堿甲(hupenine A，Hup-A)具有橫紋肌松馳作用，以后深入研究發(fā)現(xiàn)該生物堿是一種強效、可逆和高選擇性乙酰膽堿酯酶抑制劑。在低劑量Hup-A下對乙酰膽堿酯酶(Ach E)有強大的抑制作用，使分布區(qū)內神經突觸間隙的乙酰膽堿(Ach)含量明顯升高，從而增強神經元興奮傳導，強化學習與記憶腦區(qū)的興奮作用，起到提高認知功能、增強記憶保持和促進記憶再現(xiàn)的作用。是目前國內最為成功的治療阿爾茨海默病(老年性癡呆癥)的藥物。石杉堿甲Hup-A藥物主要來源于天然蛇足石杉全草，由于石杉堿甲的特殊療效，國內外學者對它的全合成、衍生物及類似物的合成作了大量的工作，亦因Hup-A特殊的分子結構， 人工合成費時費力，代價高，至今幾乎沒有得到活性比天然Hup-A更好的衍生物和類似物， 因此人工合成的Hup-A及其類似物離商品化生產還有較長距離，隨著老年化社會到來，阿爾茨海默病(老年性癡呆癥)已成為人類的第四大病魔，直接導致國際市場上Hup-A的供應缺ロ越來越大，自然千層塔資源匱乏凸顯。由于蛇足石杉等石杉科植物生長于深山密林，生境條件特殊，很難解決石杉科植物大面積的人工栽培。采取石杉科植物離體組織培養(yǎng)能開發(fā)石杉屬植物中Hup-A資源，但因外植體消毒及其生長分化困難，目前國內外尚未突破其有效的技木。而蛇足石杉離體培養(yǎng)是開發(fā)其原植物快繁或生物技術生產天然石杉堿甲(Hup-A)資源的重要技術平臺，必須首先建立有效的離體培養(yǎng)無性増殖體系。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種產石杉堿甲的離體蛇足石杉葉狀體誘導和増殖的培養(yǎng)方法，該方法簡單，便于大規(guī)模生產使用。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，方法步驟為(1. 1)材料蛇足石杉(Huperzia serrata (Thunb. ex Murray) Trev.,選擇健壯無病蟲害的廬山野生蛇足石杉植株，取當年抽生約3cm長的新枝；(1. 2)對外植體清洗消毒；(1. 3)外植體接種在葉狀體分化啟動培養(yǎng)基上培養(yǎng)至切ロ處出現(xiàn)緑色小凸點，繼續(xù)在葉狀體分化啟動培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 15天，緑色小凸點發(fā)育成可辨的葉狀體組織，此時的葉狀體組織迅速増殖；葉狀體分化啟動培養(yǎng)基l/2(6，7-V)+NAA0. 1 1. Omg/L，蔗糖用量 20 30g/L ；(1. 4)將誘導増殖的葉狀體組織分割成小塊，每瓶45ml左右培養(yǎng)基接種1. Og
3至1. 5g，轉接到葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基6，7-V+NAA0. 1 1. 5mg/L 或 IΑΑ0. 1 1. Omg/L，蔗糖用量 20 30g/L ；(1. 5)葉狀體分割繼代；一小部分葉狀體切割作繼代小塊，接種到繼代増殖培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，以后每40 50天轉代一次，每世代葉狀體生物量鮮重比接種量增加8 13 倍，建成葉狀體無性繁殖系；另一大部分葉狀體收獲可提取石杉堿甲。本發(fā)明方法所用的培養(yǎng)基如下(1)適用的基本培養(yǎng)基6，7-V，并蔗糖用量范圍20 30g/L，(2)葉狀體分化啟動培養(yǎng)基l/2(6，7-V)+NAA0. 1 1. Omg/L ；(3)葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基6, 7-V+NAA0. 1 1. 5mg/L 或 IΑΑ0. 1 1. Omg/L ；以上培養(yǎng)基的pH值5. 8 6. 0、瓊脂粉質量分數(shù)0. 6%，并在溫度118 120°C暨壓カ0. 8 1. 0公斤/平方厘米的高溫高壓下滅菌25min。本發(fā)明的培養(yǎng)條件如下(1)培養(yǎng)參數(shù)恒溫對士2で，相対濕度60% 70%，光照強度為1000 15001x， 日照時長11 14h/d ；(2)技術參數(shù)外植體污染率低于10% 20%;葉狀體誘導率50% 80%;每世代葉狀體生物量鮮重比接種量增加8 13倍；繼代周期40 50d ；本發(fā)明建立了生產石杉堿甲的蛇足石杉原植物再生葉狀體組織的離體無性増殖系，該葉狀體能生產積累石杉堿甲。本發(fā)明方法中對外植體消毒過程中用自來水洗去枝葉上的灰塵后，再用洗衣粉液浸泡6 lOmin，然后用軟毛筆刷洗枝葉，自來水細流水中漂洗干凈，濾紙吸干水滴后裝入無菌容器；再以質量分數(shù)75%的乙醇消毒0. 5min--lmin，無菌水洗浄，吸干水后，再以質量分數(shù)0. 0. 5% HgCl2加1滴吐溫80浸泡消毒材料6 lOmin，傾去藥液后，用無菌水沖洗6-8次。本發(fā)明的技術效果是蛇足石杉離體培養(yǎng)葉狀體再生未有成功報道。鑒于蛇足石杉離體培養(yǎng)是開發(fā)其原植物快繁或生物技術生產原植物性藥用石杉堿甲(Hup-A)資源的重要技術平臺，本發(fā)明建立了生產石杉堿甲的蛇足石杉原植物再生葉狀體組織的離體無性増殖系，突破了同類研究的一項關鍵技木。本發(fā)明的培養(yǎng)方法及基質配方為蛇足石杉離體繁殖原植物葉狀體組織無性増殖提供了必需的條件。用本發(fā)明的方法進行蛇足石杉離體培養(yǎng)，可獲得大量的蛇足石杉葉狀體藥用植物資源。利用這項發(fā)明擴大規(guī)模離體培養(yǎng)葉狀體提取生產的藥物石杉堿甲(Hup-A)將產生極為重大的經濟價值。


圖1蛇足石杉原植物材料及其離體培養(yǎng)誘導葉狀體發(fā)生與增殖圖；圖2離體培養(yǎng)的葉狀體提取物與石杉堿甲標準品、原植株提取物対照的薄層層析圖。
具體實施例方式以下結合實施例對本發(fā)明進行詳細說明。實施例1 < 一 >選擇健壯無病蟲害野生蛇足石杉植株，取當年抽生約3cm長的新枝；
< ニ >用自來水洗去枝葉上的灰塵后，再用洗衣粉液浸泡6 lOmin，然后用軟毛筆刷洗枝葉，自來水細流水中漂洗干凈，濾紙吸干水滴后裝入無菌容器中進行表面滅菌處理；轉至超凈工作臺上，再以質量分數(shù)75%的乙醇消毒0. 5min--lmin，無菌水洗浄，吸干水后，再以質量分數(shù)0. 0.5% HgCl2加1滴吐溫80浸泡消毒材料6 lOmin，傾去藥液后，用無菌水沖洗6-8次。然后在無菌條件下，將蛇足石杉新枝分割切成長度為0. 5 Icm 左右的莖小段，接種到準備好的葉狀體分化啟動培養(yǎng)基上培養(yǎng)；<三 > 外植體培養(yǎng)至切ロ處出現(xiàn)緑色小凸點，繼續(xù)在葉狀體分化啟動培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 15天，緑色小凸點發(fā)育成可辨的葉狀體組織，此時的葉狀體組織迅速増殖，生長的葉狀體逐漸包圍了外植體，長成一団3cm直徑的葉狀體組織塊；將誘導増殖的葉狀體組織分割成小塊，每瓶45ml左右培養(yǎng)基接種l.Og至1.5g，轉接到葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)40 50天；<四 > 葉狀體分割繼代培養(yǎng)，一小部分葉狀體切割作繼代小塊，接種到繼代増殖培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，以后每40 50天轉代一次，每代増殖的葉狀體鮮重比接種量增加8 13 倍，建成葉狀體無性繁殖系；另一大部分葉狀體收獲可提取石杉堿甲。<五 > 培養(yǎng)條件1.培養(yǎng)基配方對培養(yǎng)基中的大量元素、微量元素、有機成分、植物激素、糖類等各個組成成分進行多次正交設計及梯度試驗的基礎上得到。本發(fā)明適用的基本培養(yǎng)基6，7-V，(1)葉狀體分化啟動培養(yǎng)基l/2(6，7-V)+NAA0. lmg/L，蔗糖用量25g/L(其它實施例的葉狀體分化啟動培養(yǎng)基蔗糖用量皆同)；( 葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基6，7-V+NAA0.5mg/L，蔗糖用量25g/ し以上培養(yǎng)基的pH值5. 8 6. O、瓊脂粉質量分數(shù)0. 6%，并在溫度118 120°C暨壓カ 0. 8 1. O公斤/平方厘米的高溫高壓下滅菌25min。2.培養(yǎng)環(huán)境提供培養(yǎng)環(huán)境恒溫( 士 1) °C，相対濕度60% 70%，光照強度為1000 15001x左右，目照時長11 14h(小吋)/d(天)。實施例2 選擇健壯無病蟲害野生蛇足石杉植株，取當年抽生約3cm長的新枝，對外植體清洗消毒后在無菌條件下，將蛇足石杉新枝分割切成長度為0. 5 Icm左右的莖小段， 接種到準備好的葉狀體分化啟動培養(yǎng)基上培養(yǎng)。(1)葉狀體分化啟動培養(yǎng)基1/2(6， 7-V)+IAA0. 5mg/L(單位下同)；⑵葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基6，7_V+NAA0. 5，蔗糖用量20g/ L，其它與實施例1相同。實施例3 (1)葉狀體分化啟動培養(yǎng)基1/2 (6，7-V)+IAA1. Omg/L (單位下同)；⑵葉狀體繼代増殖培養(yǎng)基6，7-V+NAAl. 0，蔗糖用量25g/L，其它與實施例1相同。實施例4 (1)葉狀體分化啟動培養(yǎng)基l/2(6，7-V)+IAA2. Omg/L(單位下同)；⑵葉狀體繼代増殖培養(yǎng)基6，7-V+NAAl. 5，蔗糖用量30g/L，其它與實施例1相同。實施例5 (1)葉狀體分化啟動培養(yǎng)基l/2(6，7-V)+IAA0. lmg/L(單位下同)；⑵葉狀體繼代増殖培養(yǎng)基6，7-V+NAA2. 0，蔗糖用量30g/L，其它與實施例1相同。實施例6 (1)葉狀體分化啟動培養(yǎng)基1/2 (6，7-V) +NAAO. 5mg/L (單位下同)；O)葉狀體繼代増殖培養(yǎng)基6，7-V+IAA0. 1，蔗糖用量25g/L，其它與實施例1相同。實施例7 (1)葉狀體分化啟動培養(yǎng)基1/2 (6，7-V)+NAA1. Omg/L (單位下同)；O)葉狀體繼代増殖培養(yǎng)基6，7-V+IAA0. 5，蔗糖用量25g/L，其它與實施例1相同。實施例8 (1)葉狀體分化啟動培養(yǎng)基l/2(6，7-V)+NAA2. Omg/L(單位下同)；O)葉狀體繼代増殖培養(yǎng)基6，7-V+IAAl. 0，蔗糖用量25g/L，其它與實施例1相同。實施例9 (1)葉狀體分化啟動培養(yǎng)基:l/2(6，7-V)+6-BA1.0mg/L (單位下同)+IAA0. 5 ； (2) 葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基6，7-V+IAA2. 0，蔗糖用量25g/L，其它與實施例1相同。實施例10 (1)葉狀體分化啟動培養(yǎng)基l/2(6，7-V)+ZTl. Omg/L(單位下同)+IAA0. 5 ； (2)葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基6，7-V+IAA0. 5，蔗糖用量30g/L，其它與實施例1相同。實施例11 (1)葉狀體分化啟動培養(yǎng)基l/2(6，7-V)+ZTl. Omg/L(單位下同)+NAA0. 5 ； (2)葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基6，7-V+IAA0. 5，蔗糖用量35g/L，其它與實施例1相同。實施例12 (1)葉狀體分化啟動培養(yǎng)基1/2 (6，7-V) +ZT2. Omg/L (單位下同)+NAA0. 5 ； (2)葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基6，7-V+IAA0. 5，蔗糖用量20g/L，其它與實施例1相同。實驗結果如表1、表2:表1 激素對蛇足石杉葉狀體啟動的影響
權利要求
1.一種產石杉堿甲的離體蛇足石杉葉狀體誘導和増殖的培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟(1. 1)材料蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb. ex Murray)Trev.,選擇健壯無病蟲害的廬山野生蛇足石杉植株，取當年抽生約3cm長的新枝；(1. 2)對外植體清洗消毒；(1. 3)外植體接種在葉狀體分化啟動培養(yǎng)基上培養(yǎng)至切ロ處出現(xiàn)緑色小凸點，繼續(xù)在葉狀體分化啟動培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 15天，緑色小凸點發(fā)育成可辨的葉狀體組織，此時的葉狀體組織迅速増殖；葉狀體分化啟動培養(yǎng)基l/2(6，7-V)+NAA 0. 1 1. Omg/L，蔗糖用量 20 30g/L ；(1. 4)將誘導増殖的葉狀體組織分割成小塊，每瓶45ml左右培養(yǎng)基接種1. Og至1. 5g， 轉接到葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基6，7-V+NAA0. 1 1. 5mg/L 或 IΑΑ0. 1 1. Omg/L，蔗糖用量 20 30g/L ；(1.5)葉狀體分割繼代；一小部分葉狀體切割作繼代小塊，接種到繼代増殖培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，以后每40 50天轉代一次，每代葉狀體生物量鮮重比接種量增加8 13倍，建成葉狀體無性繁殖系；另一大部分葉狀體收獲可提取石杉堿甲。
2.根據(jù)權利要求1所述的產石杉堿甲的離體蛇足石杉葉狀體誘導和増殖的培養(yǎng)方法， 其特征在于培養(yǎng)條件如下(2. 1)培養(yǎng)參數(shù)恒溫對士2で，相対濕度60% 70%，光照強度為1000 15001x，日照時長11 14h/d ；(2. 2)技術參數(shù)外植體污染率低于10% 20% ；葉狀體誘導率50% 80% ；繼代周期40 50d，建立蛇足石杉原植物再生葉狀體組織的離體無性増殖系；每代葉狀體生物量鮮重比接種量增加8 13倍，離體培養(yǎng)的蛇足石杉葉狀體能生產積累石杉堿甲。
3.根據(jù)權利要求1所述的產石杉堿甲的離體蛇足石杉葉狀體誘導和増殖的培養(yǎng)方法， 其特征在于對外植體消毒過程中用自來水洗去枝葉上的灰塵后，再用洗衣粉液浸泡6 lOmin，然后用軟毛筆刷洗枝葉，自來水細流水中漂洗干凈，濾紙吸干水滴后裝入無菌容器； 再以質量分數(shù)75%的乙醇和質量分數(shù)0. 0. 5% HgCl2加1滴吐溫80先后分次消毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產石杉堿甲的離體蛇足石杉葉狀體誘導和增殖的培養(yǎng)方法，包括以下步驟選擇健壯無病蟲害野生蛇足石杉植株，取當年抽生約3cm長的新枝為外植體；誘導產生葉狀體并增殖成一團3cm直徑的葉狀體組織塊，(1)葉狀體分化啟動培養(yǎng)基，(2)葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基；葉狀體分割繼代培養(yǎng)。本發(fā)明的培養(yǎng)方法及基質配方為產石杉堿甲的離體蛇足石杉葉狀體的誘導和增殖提供了必需的環(huán)境條件。用本發(fā)明的方法進行蛇足石杉離體培養(yǎng)，可獲得大量的蛇足石杉葉狀體藥用植物資源。利用這項發(fā)明擴大規(guī)模離體培養(yǎng)葉狀體提取生產的藥物石杉堿甲(Hup-A)將產生極為重大的經濟價值。
文檔編號A01H4/00GK102550416SQ201210005499
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月10日 優(yōu)先權日2012年1月10日
發(fā)明者丁明華, 涂藝聲 申請人:江西師范大學