專利名稱：一種羅非魚精子通用稀釋液及制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及羅非魚品種的精子技術領域，更具體涉及一種羅非魚精子通用稀釋液，同時還涉及一種羅非魚精子通用稀釋液的制備方法，適合所有羅非魚品種的精子。
背景技術：
羅非魚(Tilapia)為一種中小型魚，被譽為未來動物性蛋白質的主要來源之一。 原產于非洲，上世紀70年代被引進到我國，目前已成為我國一個重要的水產養(yǎng)殖品種。隨著我國對羅非魚品種的選育和改良，除最初引進的尼羅羅非魚(0. niloticus)和奧尼亞羅非魚(0. aureus)外，又培育了許多新的品種。如尼羅羅非魚和奧尼亞羅非魚的雜交后代奧尼羅非魚；通過3系雜交選育的后代尼羅超雄魚；以及由8個品系的尼羅羅非魚經雜交混合選育的吉富羅非魚等。為了能進一步開展羅非魚的新品種選育，以及羅非魚的人工繁殖，為市場提供更優(yōu)質的羅非魚新品種和苗種，需要進行羅非魚精子超低溫保存和人工繁殖。然而，無論是精子的超低溫保存，還是進行人工繁殖，都需要一種稀釋液對羅非魚精子進行稀釋。這是因為羅非魚精液中所含精子的密度很高，一般可以達到I. 4 I. 8X IO9個/ml。當對羅非魚精子進行超低溫保存時，含高密度精子的精原液是不能直接進行超低溫冷凍保存的。這是因為在冷凍過程中，當溫度降到0°C -20°C區(qū)間時，被保存的精液中會形成冰晶，冰晶像鋒利的刀一樣刺向四周的精子，將精子刺破。精液中的精子密度越高，精子被刺破的概率也越高。這種在冷凍過程中冰晶對精子的物理損傷將直接導致精子超低溫冷凍保存的失敗。因此，冷凍前必須要對精子進行稀釋，這就需要有一種適合羅非魚精子的精子稀釋液。而在進行羅非魚人工繁殖時，由于精液中含精子的密度很高，如果直接用來進行人工授精，不僅對非常寶貴的精液是一種浪費，而且，因為精子密度過高，精液的黏稠度增加，使精子不易與卵子混合均勻，從而導致授精效果也不好。如果對精液進行稀釋后，再用來進行人工授精， 可大大降低人工授精的成本，同時還能起到很好的授精效果，獲得較高的受精率。因此，羅非魚精子稀釋液的作用就是在不激活精子的前提下，對精子進行稀釋，使精子盡可能的保持其原有的生物學特性。然而，精子稀釋液是有一定要求的。每種魚類的精子都有自己一定的滲透壓，不同種魚類的滲透壓是不同的。魚類的精子在未遇見水或其它溶液前始終處在休眠狀態(tài)，淡水魚類只有在遇見低于自己滲透壓的溶液或淡水時才能被激活，而海水魚類則要遇見高于自己滲透壓的溶液或海水時才能被激活。精子一旦被激活，很快會衰減死亡。精子的壽命一般很短，短的只有幾十秒，長的也就幾十分鐘。要想對精子進行稀釋，首先要保證精子在稀釋液中不會被激活。這就要求每種魚的精子稀釋液必須與這種魚的精液滲透壓盡可能的相等。稀釋液的滲透壓是由稀釋液中的離子濃度總和決定的，不同濃度的稀釋液就有不同的滲透壓，調節(jié)稀釋液中的離子濃度就能調節(jié)這種稀釋液的滲透壓，從而達到與精液等滲的效果。除此之外，稀釋液中不同的離子成分對精子又有不同的作用。如稀釋液中的Na離子主要是起調節(jié)稀釋液滲透壓的作用；K離子起著改變精子膜表面通透性的作用；Ca、Mg離子則起著增加或降低精子運動速度的作用；而CO3離子則起著調節(jié)稀釋液pH的作用等。除此之外，有報道顯示葡萄糖等大分子類溶質除了起到調節(jié)滲透壓的作用外，還具有提供精子能量的作用。因此，不同的魚不僅稀釋液濃度完全不同，而且，根據精子的生物學特性，其離子成分也會有很大差異。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種羅非魚精子通用稀釋液，配方合理，使用方便，適合各種羅非魚品種精子的稀釋，是羅非魚精子超低溫保存和進行人工授精所必須的一種溶液。在羅非魚精子超低溫保存過程中，可確保精子不會被激活，并最大限度降低冰晶對精子的損傷。在進行羅非魚人工授精過程中，可有效稀釋精子，降低人工授精成本，提高受精率。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種羅非魚精子通用稀釋液制備方法，方法易行，操作簡便，適合配制各種體積的稀釋液，可確保所配制稀釋液中個組分濃度的準確性。為了實現上述的目的，本發(fā)明采用以下技術措施一種羅非魚精子通用稀釋液，它由以下重量份的原料制成
原料重量份
氯化鈉(NaCl)117.5- 137.5mmol/L
氯化鉀(KC1 )6.5-8.5mmol/L
碳酸氫鈉(NaHCO3)1.9-3.1 mmol/L
氯化鈣(CaC12 )1.5-2.5mmol/L
稀釋液滲透壓為洸5. 4 320. 6m0sM, pH為8-9。一種羅非魚精子通用稀釋液，它由以下重量份的原料制成(較好范圍):原料重量份
氯化鈉(NaCl)120.0- 135.0mmol/L
氯化鉀(KC1 ) 6.8-8.3mmol/L
碳酸氫鈉(NaHCO3) 2.1-3.0mmol/L
氯化鈣(CaC12 ) 1.7-2.4mmol/L稀釋液滲透壓為273. 0 314. 2m0sM, pH 為 8. 1-8. 8。ー種羅非魚精子通用稀釋液，它由以下重量份的原料制成(優(yōu)選范圍):
原料重量份氯化鈉(NaCl)122.5- 132.5mmol/L
氯化鉀(KC1 ) 7.0-8.0mmol/L
碳酸氫鈉(NaHCO3) 2.3- 2.8mmol/L
氯化鈣(CaC12 ) 1.8-2.3mmol/L
稀釋液滲透壓為280. 0 307. OmOsM，pH為8. 3-8. 6。羅非魚精子通用稀釋液，它由以下重量份的原料制成(最佳范圍)
原料 重量份
氯化鈉(NaCl) 125- 130mmol/L
氯化鉀(KCl )7.2-7.8mmol/L
碳酸氫鈉(NaHCO3) 2.3-2.7mmol/L
氯化鈣(CaC12 ) 1.9-2.2mmol/L稀釋液滲透壓為285. 8 300. 6mOsM, pH為8. 4-8. 5。一種羅非魚精子通用稀釋液，它由以下重量份的原料制成(最佳值)原料重量份
氯化鈉(NaCl)127.5mmol/L
氯化鉀(KCl )7.5mmol/L
碳酸氫鈉(NaHCO3)2.5 mmol/L
氯化I丐(CaCl2)2.0 mmol/L本配方的稀釋液滲透壓為293. OmOsM, pH為8. 5。一種羅非魚精子通用稀釋液的制備方法，其步驟是I.精子稀釋液母液的配制(I)每毫升含氯化鈉Immol的母液根據母液的濃度、體積和氯化鈉分子量計算出配制母液需要的氯化鈉重量，計算精確度為0. Og。用天平精確稱取該重量分析純的氯化鈉(NaCl)，將氯化鈉(NaCl)放入燒杯中，加入體積約為需要配制母液體積二分之一的蒸餾水，使NaCl充分溶解，將溶解后的氯化鈉(NaCl)溶液倒入需要配制母液同樣體積的容量瓶中，用5 IOml蒸餾水洗滌3次燒杯，將洗滌后的蒸餾水也倒入容量瓶，最后用蒸餾水定容至容量瓶刻度處。NaCl重量計算公式如下溶質重量=(母液濃度X溶質分子量)+母液體積以下溶質重量均按此公式計算。(2)每毫升含氯化鉀Immol的母液根據母液的濃度、體積和氯化鉀分子量計算出配制母液需要的氯化鉀重量，計算精確度為0. Og。用天平精確稱取該重量分析純的氯化鉀 (KCl)，將氯化鉀(KCl)放入燒杯中，加入體積約為需要配制母液體積二分之一的蒸餾水， 使氯化鉀(KCl)充分溶解，將溶解后的氯化鉀(KCl)溶液倒入需要配制母液同樣體積的容量瓶中，用5 IOml蒸餾水洗滌3次燒杯，將洗滌后的蒸餾水也倒入容量瓶，最后用蒸餾水定容至容量瓶刻度處。(3)每毫升含氯化鈣0. 5mmol的母液根據母液的濃度、體積和氯化鈣分子量計算出配制母液需要的氯化鈣重量，計算精確度為0.0g。用天平精確稱取該重量分析純的氯化鈣(CaCl2),將氯化鈣(CaCl2)放入燒杯中，加入體積約為需要配制母液體積二分之一的蒸餾水，使氯化鈣(CaCl2)充分溶解，將溶解后的CaCl2溶液倒入需要配制母液同樣體積的容量瓶中，用5 IOml蒸餾水洗滌3次燒杯，將洗滌后的蒸餾水也倒入容量瓶，最后用蒸餾水定容至容量瓶刻度處。(4)每毫升含碳酸氫鈉0. 5mmol的母液根據母液的濃度、體積和碳酸氫鈉分子量計算出配制母液需要的碳酸氫鈉重量，計算精確度為0. Og。用天平精確稱取該重量分析純的碳酸氫鈉(NaHCO3)，將碳酸氫鈉(NaHCO3)放入燒杯中，加入體積約為需要配制母液體積二分之一的蒸餾水，使碳酸氫鈉(NaHCO3)充分溶解，將溶解后的NaHCO3溶液倒入需要配制母液同樣體積的容量瓶中，用5 IOml蒸餾水洗滌3次燒杯，將洗滌后的蒸餾水也倒入容量瓶，最后用蒸餾水定容至容量瓶刻度處。(5)上述母液均放置4 °C冰箱保存，備用。2.精子稀釋液的配制(I)用微量取樣器(規(guī)格5 Ul 5ml)從各組分母液中精確量取配制稀釋液所需體積的各組分。量取各組分所需的體積根據稀釋液配方中各組分的濃度、各組分母液的濃度、以及所需配制的稀釋液體積，按如下公式計算量取體積=(配方濃度X稀釋液體積)+母液濃度(2)將上述各組分混合均勻。如果需要配制的稀釋液體積大于100ml，則在相應體積的容量瓶中混勻，然后用蒸餾水定容至容量瓶刻度。如果需要配制的稀釋液體積小于 100ml，則在玻璃瓶中混勻，然后根據需要配制的稀釋液體積減去已經量取的各組分體積總和，就是需要加入的蒸懼水體積(因為容量瓶最小為100ml)。(3)配制好的稀釋液放置4°C冰箱保存，備用。與其他魚類精子稀釋液的比較下表為羅非魚精子與其他幾種魚類精子稀釋液成分的比較
權利要求
1.一種羅非魚精子通用稀釋液，它由以下重量份的原料制成原料重量份氯化鈉117.5- 137.5mmol/L氯化鉀6.5-8.5mmol/L碳酸氫鈉1.9- 3.1 mmol/L氯化 1丐1.5-2.5mmol/L稀釋液滲透壓為265. 4 320. 6m0sM, pH為8-9 ；一種羅非魚精子通用稀釋液的制備方法，其步驟是A、精子稀釋液母液的配制(1)每毫升含氯化鈉Immol的母液根據母液的濃度、體積和氯化鈉分子量計算出配制母液需要的氯化鈉重量，稱取氯化鈉，將氯化鈉放入燒杯中，加入配制母液體積二分之一的蒸餾水，使氯化鈉充分溶解，將溶解后的氯化鈉溶液倒入配制母液同樣體積的容量瓶中，用 5 IOml蒸餾水洗滌3次燒杯，將洗滌后的蒸餾水也倒入容量瓶，最后用蒸餾水定容至容量瓶刻度處；(2)每毫升含氯化鉀Immol的母液根據母液的濃度、體積和氯化鉀分子量計算出配制母液需要的氯化鉀重量，稱取氯化鉀，將氯化鉀放入燒杯中，加入母液體積二分之一的蒸餾水，使氯化鉀充分溶解，將溶解后的氯化鉀溶液倒入配制母液同樣體積的容量瓶中，用5 IOml蒸餾水洗滌3次燒杯，將洗滌后的蒸餾水也倒入容量瓶，最后用蒸餾水定容至容量瓶刻度處；(3)每毫升含氯化鈣O.5mmol的母液根據母液的濃度、體積和氯化鈣分子量計算出配制母液需要的氯化鈣重量，稱取的氯化鈣，將氯化鈣放入燒杯中，加入配制母液體積二分之一的蒸餾水，使氯化鈣充分溶解，將溶解后的氯化鈣溶液倒入配制母液同樣體積的容量瓶中，用5 IOml蒸餾水洗滌3次燒杯，將洗滌后的蒸餾水也倒入容量瓶，最后用蒸餾水定容至容量瓶刻度處；(4)每毫升含碳酸氫鈉O.5mmol的母液根據母液的濃度、體積和碳酸氫鈉分子量計算出配制母液的碳酸氫鈉重量，稱取碳酸氫鈉，將碳酸氫鈉放入燒杯中，加入配制母液體積二分之一的蒸餾水，使碳酸氫鈉充分溶解，將溶解后的碳酸氫鈉溶液倒入配制母液同樣體積的容量瓶中，用5 IOml蒸餾水洗滌3次燒杯，將洗滌后的蒸餾水也倒入容量瓶，最后用蒸餾水定容至容量瓶刻度處；(5)上述母液均放置4°C冰箱保存；B、精子稀釋液的配制(1)用微量取樣器從各組分母液中量取配制稀釋液，量取各組分的體積根據稀釋液配方中各組分的濃度、各組分母液的濃度、以及配制的稀釋液體積，按如下公式計算量取體積=配方濃度X稀釋液體積+母液濃度；(2)將上述各組分混合均勻，配制的稀釋液體積100ml，在體積的容量瓶中混勻，然后用蒸餾水定容至容量瓶刻度；(3)配制好的稀釋液放置4°C冰箱保存，備用。
2.根據權利要求I所述的一種羅非魚精子通用稀釋液，其特征在于 原料重量份氯化鈉120.0- 135.0mmol/L氯化鉀6.8-8.3mmol/L碳酸氫鈉2.1- 3.0 mmol/L氯化 1丐1.7-2.4mmol/L稀釋液滲透壓為273. O 314. 2m0sM, pH為8. 1-8. 8。
3.根據權利要求I所述的一種羅非魚精子通用稀釋液，其特征在于 原料重量份氯化鈉122.5- 132.5mmol/L氯化鉀7.0-8.0mmol/L碳酸氫鈉2.3- 2.8mmol/L氯化I丐1.8-2.3 mmol/L稀釋液滲透壓為280. O 307. OmOsM, pH為8. 3-8. 6。
4.根據權利要求I所述的一種羅非魚精子通用稀釋液，其特征在于 原料重量份氯化鈉125- 130mmol/L氯化鉀7.2-7.8mmol/L碳酸氫鈉2.3-2.7 mmol/L氯化 1丐1.9-2.2mmol/L稀釋液滲透壓為285. 8 300. 6m0sM, pH為8. 4-8. 5。
5.根據權利要求I所述的一種羅非魚精子通用稀釋液，其特征在于 原料重量份氯化鈉127.5mmol/L氯化鉀7.5mmol/L碳酸氫鈉2.5 mmol/L氯化 1丐2.0 mmol/L稀釋液滲透壓為293. OmOsM, pH為8. 5。
6.根據權利要求I所述的一種羅非魚精子通用稀釋液，其特征在于原料重量份氯化鈉127mmol/L氯化鉀7mmol/L碳酸氫鈉2 mmol/L氯化 1丐1. 7mmol/L本配方的稀釋液滲透壓為293. OmOsM, pH為8. 7。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種羅非魚精子通用稀釋液及制備方法，它由氯化鈉、氯化鉀、碳酸氫鈉、氯化鈣按一定比例制成，其制備步驟為A、精子稀釋液母液的配制(1)每毫升含氯化鈉1mmol的母液的制備；(2)每毫升含氯化鉀1mmol的母液的制備；(3)每毫升含氯化鈣0.5mmol的母液的制備；(4)每毫升含碳酸氫鈉0.5mmol的母液的制備；(5)上述母液均放置4℃冰箱保存；B、精子稀釋液的配制(1)用微量取樣器從各組分母液中量取配制稀釋液；(2)將上述各組分混合均勻；(3)配制好的稀釋液放置4℃冰箱保存，備用。本發(fā)明配方合理，使用方便，適合各種羅非魚品種精子的稀釋，方法易行，操作簡便，適合配制各種體積的稀釋液，可確保所配制稀釋液中個組分濃度的準確性。
文檔編號A01N1/02GK102578076SQ20121000738
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月11日 優(yōu)先權日2012年1月11日
發(fā)明者張潔明, 張濤, 李忠, 柳凌, 梁宏偉, 鄒桂偉, 郭峰 申請人:中國水產科學研究院長江水產研究所