專利名稱：一種一菌多酶菌株及其篩選方法和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種一菌酶菌株，同時還涉及該菌株的篩選方法及應用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
酶是一種生物催化劑，飼用酶制劑作為一類高效、無毒副作用的環(huán)保型“綠色”飼料添加劑廣泛應用于在動物生產(chǎn)中，應用飼用酶制劑既能提高飼料的消化率和利用率，提高畜禽及水產(chǎn)動物的生產(chǎn)性能，又能減少排泄物中氮、磷含量，保護水體和土壤免受污染， 將有著十分廣闊的應用前景。
早期的酶制劑以動植物作為原料直接提取，但由于動植物生長周期長，又受地理、 氣候和季節(jié)等多種因素的影響，不適于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。目前人們已將目光轉(zhuǎn)向以微生物作為酶制劑的主要來源，如淀粉酶和蛋白酶的微生物制備使用于工業(yè)化生產(chǎn)。早期的復合酶制劑是通過單酶復配后再使用，此種方式易造成生產(chǎn)成本過高，質(zhì)量不穩(wěn)定，使用不方便。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種一菌多酶菌株。
同時，本發(fā)明的目的還在于提供一種該一菌多酶菌株的篩選方法。
進一步地，本發(fā)明的目的還在于提供一種該菌多酶菌株的應用。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了一種一菌多酶菌株，該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) I. 1111，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為 CCTCC NO M 2011286。
應用經(jīng)典的細菌鑒定方法及分子生物學方法16S rDNA對其進行鑒定其為枯草芽孢桿菌(Bac illus subtilis) I. 1111，于2011年8月11日保藏在中國湖北省武漢市武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為CCTCC NO M 2011286。
該枯草芽孢桿菌對對膽酸鹽、人工胃液、人工腸液等環(huán)境表現(xiàn)出很強的耐受能力， 對實驗動物安全無毒無副作用，并能產(chǎn)生木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果膠酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶多種酶，這有利于該菌株作為益生菌在飼料添加劑中的進一步開發(fā)利用， 為進一步研究各酶的性質(zhì)、各酶之間的相互關(guān)系、實現(xiàn)一菌多酶發(fā)酵奠定了良好的基礎(chǔ)。
所述的一菌多酶菌株可產(chǎn)木聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、植酸酶、果膠酶、 脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶。
本發(fā)明的技術(shù)方案還采用了一種一菌多酶菌株的篩選方法，包括以下步驟以產(chǎn)木聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、植酸酶、果膠酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶為篩選目標，分別用各酶選擇性培養(yǎng)基，根據(jù)菌落周圍有無透明圈或水解圈，以及透明圈或水解圈的直徑(D)與菌落直徑(d)的比值，來初步判斷是否為產(chǎn)酶菌株及高產(chǎn)酶活，最終從實驗室分離、篩選保存的菌種資源庫中篩選到一菌產(chǎn)多酶的菌株。
本發(fā)明的技術(shù)方案還涉及一種該一菌多酶菌株在制備益生菌劑方面的應用。
斜面和種子培養(yǎng)基以g/L計蛋白胨10.0，牛肉膏5，NaCl 5，斜面再加15-20， ρΗ7· 2 ;發(fā)酵培養(yǎng)基以 g/L 計玉米粉 36-44，豆餅粉 36-44，Na2HPO4 8，(NH4) 2SO4 4，NH4Cl 0.75，CaCl2 1.0，pH7. O ;培養(yǎng)條件10L發(fā)酵罐中發(fā)酵體積為7L，接種量為總體積10%， 溫度為35-40°C，通氣量為3L/L. min，攪拌速度為200-300r/min，發(fā)酵時間30_50h，發(fā)酵液中有大量的枯草芽孢桿菌活菌、以蛋白酶、甘露葡聚糖酶、淀粉酶和糖化酶為主，同時含有木聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、植酸酶、果膠酶、脂肪酶等水解酶，將發(fā)酵液濃縮加入 30% -60%淀粉干燥即制成益生菌和復合酶制劑。
同時，本發(fā)明的技術(shù)方案還涉及一種一菌多酶菌株在制備飼料方面的應用。
復合酶制劑在飼料中的添加量為每噸飼料加100_200g。
所述的復合酶制劑組成為蛋白酶5000_10000U/g、甘露葡聚糖酶1000_3000U/g、 糖化酶 700-3000U/g，木聚糖酶 7500-15000U/g、淀粉酶 500_3000U/g、纖維素酶 200-700U/ g、植酸酶 50-80U/g、果膠酶 100-200U/g、脂肪酶 200_500U/g。
本發(fā)明的復合酶有不同的作用機制，在飼料中的添加可減少其抗營養(yǎng)作用，提高飼料利用率，提高動物生產(chǎn)效率，充分發(fā)揮動物的生產(chǎn)性能。本發(fā)明通過模擬體內(nèi)膽酸鹽環(huán)境、人工胃液、人工腸液和動物試驗證明該菌株對膽鹽、人工胃液、人工腸液有很強的耐受能力，對試驗動物表現(xiàn)出安全性和促增長能力，這為有效提高該菌株的產(chǎn)酶能力，在發(fā)酵過程中能夠同時產(chǎn)生木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果膠酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶等，實現(xiàn)一菌多酶發(fā)酵奠定了基礎(chǔ)。該菌株產(chǎn)生的多種酶之間相互協(xié)同作用效果強，可作為飼料添加劑應用于畜、禽、水產(chǎn)動物等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。
產(chǎn)酶菌株的篩選
I.產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選
將已活化的菌株刺種在木聚糖酶篩選培養(yǎng)基上，在37°C恒溫培養(yǎng)24h，根據(jù)菌落周圍是否有透明圈產(chǎn)生，判斷其是否產(chǎn)生木聚糖酶。分別測量透明圈直徑和菌落直徑，根據(jù)兩者比值大小確定其分泌木聚糖酶活性的高低，并以比值大于等于2時判其為產(chǎn)木聚糖酶活性高的菌株。
2.產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選
將已活化的菌株刺種在酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基上，在37°C溫箱中培養(yǎng)24h，根據(jù)菌落周圍是否有酪素水解圈產(chǎn)生，判斷其是否產(chǎn)生蛋白酶。用直尺分別測量水解圈與菌落的直徑，根據(jù)兩者比值大小確定其分泌蛋白酶活性的高低，并以比值大于等于2時判其為產(chǎn)蛋白酶活性高的菌株。
3.產(chǎn)植酸酶菌株的篩選
將已活化的菌株刺種在植酸酶初篩培養(yǎng)基上，在30°C溫箱中培養(yǎng)48h，根據(jù)菌落周圍是否產(chǎn)生透明圈來判斷其是否產(chǎn)生植酸酶。用直尺分別測量透明圈的直徑(D)和菌落直徑(d)，根據(jù)兩者的比值大小來初步確定其產(chǎn)生植酸酶活性的高低，并以比值大于等于2 時判其為產(chǎn)植酸酶活性高的菌株。
4.產(chǎn)果膠酶菌株的篩選
將已活化的菌株刺種在果膠酶初篩培養(yǎng)基上，在37°C溫箱中培養(yǎng)36h，取出后，在菌落周圍滴加幾滴CTAB溶液，靜置IOmin后觀察透明圈。根據(jù)菌落周圍是否產(chǎn)生透明圈來判斷其是否產(chǎn)生果膠酶。用直尺分別測量透明圈的直徑(D)和菌落直徑(d)，根據(jù)兩者的比值大小來初步確定其產(chǎn)生果膠酶活性的高低，并以比值大于等于2時判其為產(chǎn)果膠酶活性高的菌株。
5.產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選
將已活化的菌株刺種在脂肪酶初篩培養(yǎng)基上，在37°C溫箱中培養(yǎng)24h，根據(jù)菌落周圍是否產(chǎn)生水解圈來判斷其是否產(chǎn)生脂肪酶。分別測量水解圈的直徑(D)和菌落直徑 (d)，根據(jù)兩者的比值大小來初步確定其產(chǎn)生脂肪酶活性的高低，并以比值大于等于2時判其為產(chǎn)脂肪酶活性高的菌株。
6.產(chǎn)甘露聚糖酶菌株的篩選
將已活化的菌株刺種在甘露聚糖酶篩選培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24h后，用剛果紅水溶液檢測菌落周圍是否產(chǎn)生透明圈及其大小，作為產(chǎn)甘露聚糖酶篩選的依據(jù)。，并以比值大于等于2時判其為產(chǎn)甘露聚糖酶活性高的菌株。
7.產(chǎn)糖化酶菌株的篩選
將活化后的菌株刺種糖苷酶篩選培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)36h，采用革蘭氏碘液染色， 在菌落周圍有透明圈產(chǎn)生證明其產(chǎn)糖化酶。分別測量透明圈直徑和菌落直徑，并以比值大于等于2時判其為產(chǎn)糖化酶活性高的菌株。
8.高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選
將活化后的菌株刺種可溶性淀粉培養(yǎng)基平皿上，在37°C溫箱中培養(yǎng)24h，采用革蘭氏碘液染色，根據(jù)菌落周圍是否有透明圈產(chǎn)生判斷其是否產(chǎn)生淀粉酶。分別測量透明圈直徑和菌落直徑，并以比值大于等于2時判其為高產(chǎn)淀粉酶的菌株。9.高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選
9.高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選
將活化后的菌株刺種纖維素酶篩選培養(yǎng)基上，在37°C溫箱中培養(yǎng)24h，采用Img/ ml剛果紅染色lh，然后依次用，lmol/LNaCl溶液徹底洗去染液lh，再用Imol/mlHCl定色， 根據(jù)菌落周圍是否形成染色圈，判斷芽孢桿菌是否產(chǎn)生纖維素酶。分別測量染色圈直徑和菌落直徑，以比值大于等于2的判其為活性比較高的纖維素酶產(chǎn)酶菌株。
一菌多酶發(fā)酵法可以大大提高生產(chǎn)效率、節(jié)約成本，而且由于各酶種來源于同一菌株，其安全性與復配性能顯得更有優(yōu)勢。
產(chǎn)酶菌株的鑒定
應用普通瓊脂培養(yǎng)基對產(chǎn)酶菌株的培養(yǎng)特征進行研究，利用革蘭氏染色法對其染色特性進行研究；利用糖發(fā)酵試驗、IMVIC試驗、淀粉水解、明膠液化、硫化氫、賴氨酸脫羧酶試驗、精氨酸雙水解酶試驗、鳥氨酸脫羧酶試驗等生化試驗對3其生理生化特性進行分析，并利用分子生物學方法16S rDNA對產(chǎn)酶菌株進行鑒定。
產(chǎn)酶菌株的耐受性及動物試驗
通過模擬體內(nèi)膽酸鹽環(huán)境、人工胃液、人工腸液環(huán)境，分別測定產(chǎn)酶菌株在不同的膽鹽含量、不同PH值的人工胃液、不同pH值的人工腸液環(huán)境中的耐受能力。并選擇健康小白鼠為實驗動物，將菌株制成菌懸液(菌懸液活菌數(shù)為109CFU/mL)，同時設(shè)空白對照，連續(xù)灌胃5天，觀察小白鼠的健康狀況。


圖I為產(chǎn)酶菌株16S rDNA PCR擴增鑒定圖譜；泳道M為DL2000Marker ;泳道1、2 均為產(chǎn)酶菌株16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物；泳道3陰性對照。
圖2產(chǎn)酶菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹；▲為目的菌株。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細的描述
產(chǎn)酶菌株篩選實施例
I、產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選
將活化的產(chǎn)酶菌株刺種在木聚糖酶篩選培養(yǎng)基上，在37°C溫箱中培養(yǎng)24h，根據(jù)菌落周圍是否有透明圈產(chǎn)生，經(jīng)過觀察，發(fā)現(xiàn)有該菌株產(chǎn)生透明圈，測量菌株的透明圈直徑 (D)、菌落直徑(d)及透明圈直徑與菌落直徑之比(D/d)，試驗結(jié)果見表I。
表I木聚糖酶分解菌酶活篩選結(jié)果
菌株D (mm)d (mm)D,/d 比值產(chǎn)酶菌株13.07.01.857
2.產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選
將活化的產(chǎn)酶菌株刺種在酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基上，在37°C溫箱中培養(yǎng)24h，觀察發(fā)現(xiàn)有該菌株株產(chǎn)生酪蛋白水 解圈。測量菌株的水解圈直徑(D)、菌落直徑(d)及水解圈直徑與菌落直徑之比(D/d)，試驗結(jié)果見表2。
表2蛋白酶分解菌酶活初篩
菌株D (mm)d (mm)D/d產(chǎn)酶菌株24.05. O4.80
3.產(chǎn)植酸酶菌株篩選結(jié)果
將活化的產(chǎn)酶菌株刺種在植酸酶初篩培養(yǎng)基平皿上，在30°C溫箱中培養(yǎng)48h后， 觀察發(fā)現(xiàn)菌株產(chǎn)生有透明圈，其透明圈直徑(D)、菌落直徑(d)及二者的比值見表3。
表3產(chǎn)值酸酶菌株篩選結(jié)果
菌株P(guān) (mm)d (mm)D./d產(chǎn)酶菌株179I. 889
由表3可知，該菌株的D/d值為2. 125，可初步確定這些菌株產(chǎn)植酸酶的活性較高。
4.產(chǎn)果膠酶菌株篩選結(jié)果
將活化的產(chǎn)酶菌株刺種在果膠酶初篩培養(yǎng)基平皿上，在37°C溫箱中培養(yǎng)36h后， 觀察發(fā)現(xiàn)該菌株產(chǎn)生透明圈，其透明圈直徑(D)、菌落直徑(d)及二者的比值見表4。
表4產(chǎn)果膠酶菌株篩選結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種一菌多酶菌株，其特征在于，該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) I. 1111，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為CCTCC NO M 2011286。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一菌多酶菌株，其特征在于可產(chǎn)木聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、植酸酶、果膠酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶，其中蛋白酶、甘露葡聚糖酶、淀粉酶和糖化酶為高產(chǎn)酶活。
3.一菌多酶菌株的篩選方法，其特征在于包括以下步驟以產(chǎn)木聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、植酸酶、果膠酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶為篩選目標，分別用各酶選擇性培養(yǎng)基，根據(jù)菌落周圍有無透明圈或水解圈，以及透明圈或水解圈的直徑(D)與菌落直徑(d)的比值，來初步判斷是否為產(chǎn)酶菌株及高產(chǎn)酶活，最終從實驗室分離、篩選保存的菌種資源庫中篩選到一菌產(chǎn)多酶的菌株。
4.一菌多酶菌株在制備益生菌劑方面的應用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于斜面和種子培養(yǎng)基以g/L計蛋白胨 10.0，牛肉膏5，NaCl 5，斜面再加15-20，pH7. 2 ;發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計玉米粉36-44，豆餅粉 36-44，Na2HPO4 8，(NH4) 2SO4 4，NH4Cl O. 75，CaCl2 I. O, ρΗ7· O ;培養(yǎng)條件10L 發(fā)酵罐中發(fā)酵體積為7L，接種量為總體積10%，溫度為35-40°C，通氣量為3L/L. min，攪拌速度為 200-300r/min，發(fā)酵時間30_50h，發(fā)酵液中有大量的枯草芽孢桿菌活菌、以蛋白酶、甘露葡聚糖酶、淀粉酶和糖化酶為主，同時含有木聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、植酸酶、果膠酶、脂肪酶等水解酶，將發(fā)酵液濃縮加入30% -60%淀粉干燥即制成益生菌和復合酶制劑。
6.—菌多酶菌株在制備飼料方面的應用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于復合酶制劑在飼料中的添加量為每噸飼料加 100-200g。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于所述的復合酶制劑組成為蛋白酶5000-10000U/g、甘露葡聚糖酶1000-3000U/g、糖化酶700_3000U/g，木聚糖酶 7500-15000U/g、淀粉酶 500-3000U/g、纖維素酶 200_700U/g、植酸酶 50_80U/g、果膠酶 100-200U/g、脂肪酶 200-500U/g。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種一菌多酶菌株及其制備方法和應用，該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)1.1111，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為CCTCC NOM 2011286。本發(fā)明枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)1.1111可產(chǎn)木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果膠酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶等9種酶的菌株，其中蛋白酶、甘露葡聚糖酶、淀粉酶和糖化酶產(chǎn)量特別高。同時通過模擬體內(nèi)膽酸鹽環(huán)境、人工胃液、人工腸液和動物試驗證明該菌株對膽鹽、人工胃液、人工腸液有很強的耐受能力，對試驗動物表現(xiàn)出安全性和促增長能力，這為有效提高該菌株的產(chǎn)酶能力，在發(fā)酵過程中能夠同時產(chǎn)生木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果膠酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶等，實現(xiàn)一菌多酶發(fā)酵奠定了基礎(chǔ)。該菌株產(chǎn)生的多種酶之間相互協(xié)同作用效果強，可作為飼料添加劑應用于畜、禽、水產(chǎn)動物等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號A23K1/165GK102864091SQ201210010890
公開日2013年1月9日 申請日期2012年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月15日
發(fā)明者劉一塵, 張謙, 李宏偉, 張春杰, 汪洋, 關(guān)隨霞, 龔婷, 丁軻, 李小康, 吳庭才, 李銀聚, 王臣 申請人:河南科技大學