專利名稱：一種無血清低溫保護(hù)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種無血清低溫保護(hù)劑。
背景技術(shù)：
目前體外制備的動物細(xì)胞低溫儲存保護(hù)劑主要采用含血清的DMSO溶液，但經(jīng)過這種低溫保護(hù)劑儲存的細(xì)胞制劑血清殘留很難清除，而且血清成分復(fù)雜，限制了細(xì)胞制劑的用途。間充質(zhì)干細(xì)胞與其它成體二倍體細(xì)胞不同，是一種具有自我更新和多向分化能力的細(xì)胞，具有廣泛的醫(yī)療用途，其低溫儲存對配方有更高的要求，為了滿足臨床需要，低溫保護(hù)劑最好不含有血清成分。無血清低溫保護(hù)劑是間充質(zhì)干細(xì)胞低溫保護(hù)劑的發(fā)展方向，現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)公開采用了 PEG或海藻糖作為低溫保護(hù)劑，也披露了 IV型膠原蛋白在人胚胎干細(xì)胞低溫儲存中的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種無血清低溫保護(hù)劑，在于解決現(xiàn)有技術(shù)中含血清的低溫保護(hù)劑血清成份復(fù)雜、血清殘留難清除的問題及無血清低溫儲存試劑成分不明確的問題。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取了如下技術(shù)方案—種無血清低溫保護(hù)劑，包括細(xì)胞內(nèi)滲透保護(hù)劑和細(xì)胞外保護(hù)劑，其特征在于所述細(xì)胞外保護(hù)劑由NaCl、KCl、Na2HPO4. 12H20、KH2PO4, PEG (400 2000)、D-海藻糖和膠原 IV (IV型膠原蛋白)組成，所述細(xì)胞內(nèi)滲透保護(hù)劑為DMSO (二甲基亞砜)，所述PEG (400 2000)是聚乙二醇的分子量在400 2000之間。進(jìn)一步的技術(shù)方案是，每IOOmL無血清低溫保護(hù)劑中，所述細(xì)胞外保護(hù)劑組成成份的重量為NaCl 為 800mg、KCL 為 20mg、Na2HP04. 12H20 為 290mg、KH2P04 為 24mg、PEG(400 2000)為5 15g、D-海藻糖為3. 423g 6. 846g、膠原IV為IOOug lOOOug，所述細(xì)胞內(nèi)滲透保護(hù)劑DMSO為5mL 15mL。一種制備無血清低溫保護(hù)劑的方法，步驟一將NaCl、KCl、Na2HPO4. 12H20、KH2PO4, PEG (400 2000)和 D-海藻糖全溶于注射用水中，溶液40°C保溫；步驟二 步驟一所述溶液降溫至20°C后，加入膠原IV，溶液20°C保溫；步驟三在無菌環(huán)境中將步驟二所述加入膠原IV后的20°C保溫溶液過濾除菌；步驟四將無菌DMSO溶入到步驟三經(jīng)過濾除菌的溶液中，得到無血清低溫保護(hù)劑。進(jìn)一步的技術(shù)方案是，每IOOmL的無血清低溫保護(hù)劑中，所述步驟一的NaCl為 800mg、KCl 為 20mg、Na2HPO4. 12H20 為 290mg、KH2PO4 為 24mg、PEG(400 2000)為 5 15g、CN 102578077 A
D-海藻糖為3. 423g 6. 846g，所述的注射用水為60mL。進(jìn)一步的技術(shù)方案是，每IOOmL的無血清低溫保護(hù)劑中，所述步驟二膠原IV為 IOOug IOOOug,加入膠原IVlOOug IOOOug后的溶液定容至85mL 95mL。進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述步驟三的過濾除菌，使用孔徑為O. 22um的無菌親水濾膜。進(jìn)一步的技術(shù)方案是，每IOOmL的無血清低溫保護(hù)劑中，所述步驟四的無菌DMSO 為 5mL 15mL。更進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述的一種無血清低溫保護(hù)劑，用于凍存間充質(zhì)干細(xì)胞， 所述間充質(zhì)干細(xì)胞包括人和動物的骨髓、肌肉、皮膚、肝臟、腎臟、心臟、骨骼、腦、肺臟、消化道、胎盤、羊膜、羊水、臍帶、臍帶血、外周血。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果(I)本發(fā)明不含有任何來源的血清成分，在低溫儲存細(xì)胞時不會有血清成分殘留。(2)本發(fā)明成分明確、簡單，易于配制。(3)本發(fā)明可用于間充質(zhì)干細(xì)胞的低溫儲存。


圖I為實施例2的不同低溫保護(hù)劑低溫凍存人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后F-CFU和存活率的檢測結(jié)果示意圖。
具體實施例方式實施例一一種無血清低溫保護(hù)劑，包括細(xì)胞內(nèi)滲透保護(hù)劑和細(xì)胞外保護(hù)劑，每IOOmL的無血清低溫保護(hù)劑中，所述細(xì)胞外保護(hù)劑的組成成份重量=NaCl為800mg、KCL為20mg、 Na2HPO4. 12H20 為 290mg、KH2PO4 為 24mg、PEG (400)為 5g、D-海藻糖為 3. 423g、膠原 IV 為 lOOOug，所述細(xì)胞內(nèi)滲透保護(hù)劑為DMSO為5mL。一種制備無血清低溫保護(hù)劑的方法，步驟一JfNaCl 800mg、KCL 20mg、Na2HPO4. 12H20 290mg、KH2P0424mg、PEG (400) 5g、 D-海藻糖3. 423g溶于60mL注射用水中，攪拌，直至全溶，溶液40°C保溫；步驟二 將步驟一所述溶液降溫至20°C，加入膠原IVlOOOug，攪拌，直至全溶，定容至95mL，溶液20°C保溫；步驟三在無菌環(huán)境中將步驟二所述加入膠原IV后的20°C保溫溶液經(jīng)0. 22um無菌親水濾膜過濾除菌；步驟四在使用前，將5mL無菌DMSO加入到步驟三經(jīng)過濾除菌的溶液中，混勻，得到IOOmL的無血清低溫保護(hù)劑。實施例二一種無血清低溫保護(hù)劑，包括細(xì)胞內(nèi)滲透保護(hù)劑和細(xì)胞外保護(hù)劑，每IOOmL的無血清低溫保護(hù)劑中，所述細(xì)胞外保護(hù)劑的組成成份重量=NaCl為800mg、KCL為20mg、 Na2HPO4. 12H20 為 290mg、KH2PO4 為 24mg、PEG (2000)為 15g、D_ 海藻糖為 6. 846g、膠原 IV 為 lOOug，所述細(xì)胞內(nèi)滲透保護(hù)劑為DMSO為15mL。
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一種制備無血清低溫保護(hù)劑的方法，步驟一將NaCl 800mg、KCL 20mg、Na2HPO4. 12H20 290mg、KH2P0424mg、 PEG (2000) 15g、D-海藻糖6. 846g溶于60mL注射用水中，攪拌，直至全溶，溶液40°C保溫；步驟二 將步驟一所述溶液降溫至20°C，加入膠原IVlOOOug，攪拌，直至全溶，定容至85mL，溶液20°C保溫；步驟三在無菌環(huán)境中將步驟二所述加入膠原IV后的20°C保溫溶液經(jīng)O. 22um無菌親水濾膜過濾除菌；步驟四在使用前，將15mL無菌DMSO加入到步驟三經(jīng)過濾除菌的溶液中，混勻，得到IOOmL的無血清低溫保護(hù)劑。更進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述的一種無血清低溫保護(hù)劑，凍存人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的低溫凍存將ImL的IXlO7個/mL人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞， 與ImL上述無血清低溫保護(hù)劑混勻，轉(zhuǎn)移到凍存管中，再將所述凍存管以程控降溫儀降溫， 1°C /分鐘，直至_90°C，轉(zhuǎn)移到液氮中凍存。取低溫凍存前的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，血清組、PEG組、D-海藻糖組和PEG+D-海藻糖組的低溫凍存劑分別凍存后的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，各10組，共50組，每組100個細(xì)胞， 進(jìn)行人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存活率和F-CFU(克隆形成單位)檢測，檢測結(jié)果見表I和表2。上述PEG+D-海藻糖組是通過本實施例的無血清低溫保護(hù)劑配方和制備方法制成，上述血清組、PEG組、D-海藻糖組的低溫凍存劑配方僅是分別用血清、PEG、D-海藻糖等量替換了上述PEG+D海藻糖組配方中的PEG和D-海藻糖，其它成份和用量相同，制備方法與上述PEG+D-海藻糖組的制備方法相同。表I不同低溫保護(hù)劑低溫凍存人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后F-CFU的檢測
權(quán)利要求
1.一種無血清低溫保護(hù)劑，包括細(xì)胞內(nèi)滲透保護(hù)劑和細(xì)胞外保護(hù)劑，其特征在于所述細(xì)胞外保護(hù)劑由 NaCl、KCl、Na2HP04. 12H20、KH2PO4、PEG (400 2000)、D-海藻糖和膠原 IV 組成，所述細(xì)胞內(nèi)滲透保護(hù)劑為DMSO。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種無血清低溫保護(hù)劑，其特征在于每IOOmL無血清低溫保護(hù)劑中，所述細(xì)胞外保護(hù)劑組成成份的重量為=NaCl為800mg、KCL為20mg、Na2HP04. 12H20 為 290mg、KH2PO4 為 24mg、PEG (400 2000)為 5 15g、D-海藻糖為 3. 423g 6. 846g、膠原IV為IOOug lOOOug，所述細(xì)胞內(nèi)滲透保護(hù)劑DMSO為5mL 15mL。
3.一種制備權(quán)利要求I所述的無血清低溫保護(hù)劑的方法，其特征在于步驟一將 NaCl、KCl、Na2HPO4. 12H20、KH2PO4, PEG (400 2000)和 D-海藻糖全溶于注射用水中，溶液40°C保溫；步驟二 步驟一所述溶液降溫至20°C后，加入膠原IV，溶液20°C保溫；步驟三在無菌環(huán)境中將步驟二所述加入膠原IV后的20°C保溫溶液過濾除菌；步驟四將無菌DMSO溶入到步驟三經(jīng)過濾除菌的溶液中，得到無血清低溫保護(hù)劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種制備無血清低溫保護(hù)劑的方法，其特征在于每IOOmL的無血清低溫保護(hù)劑中，所述步驟一的NaCl為800mg、KCl為20mg、Na2HPO4. 12H20為290mg、 KH2PO4 為 24mg、PEG (400 2000)為 5 15g、D-海藻糖為 3. 423g 6. 846g，所述的注射用水為60mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種制備無血清低溫保護(hù)劑的方法，其特征在于每IOOmL的無血清低溫保護(hù)劑中，所述步驟二膠原IV為IOOug lOOOug，加入膠原IVlOOug IOOOug 后的溶液定容至85mL 95mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種制備無血清低溫保護(hù)劑的方法，其特征在于所述步驟三的過濾除菌，使用孔徑為0. 22um的無菌親水濾膜。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種制備無血清低溫保護(hù)劑的方法，其特征在于每IOOmL的無血清低溫保護(hù)劑中，所述步驟四的無菌DMSO為5mL 15mL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種無血清低溫保護(hù)劑，包含細(xì)胞內(nèi)滲透保護(hù)劑和細(xì)胞外保護(hù)劑，所述細(xì)胞外保護(hù)劑由NaCL、KCL、Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、PEG(400-2000)、D-海藻糖和膠原IV組成，所述細(xì)胞內(nèi)滲透保護(hù)劑為DMSO。本發(fā)明還公開了一種制備無血清低溫保護(hù)劑的方法。本發(fā)明不含有任何來源的血清成分，在低溫儲存細(xì)胞時不會有血清成分殘留，本發(fā)明成分明確、簡單，易于配制，可用于間充質(zhì)干細(xì)胞的低溫儲存。
文檔編號A01N1/02GK102578077SQ20121001103
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月13日
發(fā)明者戴成祥, 苑春慧, 鄧濤 申請人:成都美進(jìn)生物科技有限公司