專利名稱：用冰片高效誘導(dǎo)黃花蒿形成不定根的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用冰片(borneol)高效誘導(dǎo)黃花蒿產(chǎn)生不定根方法。
背景技術(shù)：
青蒿素是具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的化合物實(shí)體，是我國學(xué)者首次從黃花蒿 (Artemisia annua L.)中分離得到的一種倍半萜內(nèi)酯過氧化物，目前是治療瘧疾的特效藥。隨著近年瘧疾發(fā)病率的逐年增長，青蒿素的國際市場需求量呈日益增長的趨勢。進(jìn)一步的藥理研究證明，青蒿素及其類似物對多種腫瘤細(xì)胞具有毒性作用，包括乳腺癌細(xì)胞、血癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞等，而對正常細(xì)胞損傷很小，并且與傳統(tǒng)化療藥物不存在交叉耐藥性。因此，青蒿素及其類似物有望被開發(fā)成高效、低毒、價(jià)廉、譜廣的抗癌新藥，具有廣泛的應(yīng)用前景，從而導(dǎo)致青蒿素的市場進(jìn)一步擴(kuò)大，青蒿素的需求量將進(jìn)一步上升。然而，目前藥用青蒿素均是從黃花蒿植株中提取分離而得。由于黃花蒿中青蒿素含量非常低(0. 01%-0. 8% )，導(dǎo)致青蒿素的生產(chǎn)成本過高。雖然現(xiàn)在已經(jīng)能夠人合成青蒿素，但由于難度大、產(chǎn)量、成本高，不具備商業(yè)化生產(chǎn)的可能性。利用組織培養(yǎng)及基因工程技術(shù)來獲得青蒿素含量較高的青蒿素新品種是一種很有吸引力的方法，但生根頻率非常低一直制約黃花蒿組織培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)基因成功的瓶頸問題。此外，由于黃花蒿具有自交不親和性， 因此，無性繁殖是保持優(yōu)異種質(zhì)的最有效的手段。但在采用側(cè)枝扦插的方式進(jìn)行黃花蒿優(yōu)良品種無性繁殖時(shí)，也存在生根率低、成活率不高的問題。因此，如何高效誘導(dǎo)黃花蒿產(chǎn)生不定根是目前青蒿素生產(chǎn)中急需解決的重大技術(shù)問題。雖然，通過生長素如IBA或NAA，可在一定程度上促進(jìn)黃花蒿不定根的形成，但生根時(shí)間長、生根率低，無法滿足生產(chǎn)需求，并且過量使用人工合成激素，一方面會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)成本高，另外一方面產(chǎn)生殘留、污染環(huán)境。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用冰片高效誘導(dǎo)黃花蒿形成不定根的方法，利用冰片處理黃花蒿，誘導(dǎo)其產(chǎn)生不定根，有效提高了黃花蒿不定根的產(chǎn)生，不但提高生根率，而且還提高單株不定根的數(shù)量，縮短了生根的時(shí)間。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種用冰片高效誘導(dǎo)黃花蒿形成不定根的方法，該方法是先將冰片溶解于二甲基亞砜中，配制成100g/L的冰片母液；再于MS固態(tài)培養(yǎng)基中加入冰片母液制成含2-6mg/L冰片的固態(tài)MS培養(yǎng)基；然后將黃花蒿無菌芽頭在該固態(tài)MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)3-5周，培養(yǎng)條件每天1 光照，他黑暗，2600-3000 Ix光照，溫度M_26°C，相對濕度60-70% ；上述冰片和二甲基亞砜皆為分析純。上述黃花蒿無菌芽頭是將黃花蒿種子加入質(zhì)量濃度為0. 5-1 %的次氯酸鈉溶液中浸泡消毒18-20min，次氯酸鈉溶液以淹蓋住種子為宜，并滴加吐溫20，使吐溫20體積終濃度為0.01%，浸泡過程中不斷晃動(dòng)，然后取出種子，用無菌水沖洗4次后移至1/2MS固態(tài)培養(yǎng)基中，1周后轉(zhuǎn)置MS固態(tài)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5周得到，種子在1/2MS固態(tài)培養(yǎng)基和MS固態(tài)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的條件為每天16h光照，8h黑暗，2600-3000 Ix光照，溫度M_26°C，相對濕度 60-70%。上述黃花蒿無菌芽頭也可以是將黃花蒿芽頭加入質(zhì)量濃度為0. 5-1%的次氯酸鈉溶液中浸泡消毒18-20min，次氯酸鈉溶液以淹蓋住芽頭為宜，并滴加吐溫20，使吐溫20體積終濃度為0. 01 %，浸泡過程中不斷晃動(dòng)，然后取出芽頭，用無菌水沖洗4次后，在無菌條件下，將消毒后的芽頭保留3-4cm得到。本發(fā)明采用的另一種技術(shù)方案是一種用冰片高效誘導(dǎo)黃花蒿形成不定根的方法，該方法是先將冰片溶解于二甲基亞砜中，配制成100g/L的冰片母液；再于MS液態(tài)培養(yǎng)基中加入冰片母液制成含80-110mg/L冰片的液態(tài)MS培養(yǎng)基；然后將黃花蒿枝條在上述液態(tài)MS培養(yǎng)基中浸泡10-20min之后扦插在營養(yǎng)土中培養(yǎng)2_4周，培養(yǎng)條件每天1 光照， 8h黑暗，2600-3000 Ix光照，溫度M_26°C，相對濕度60_70%。上述黃花蒿枝條是選取生長旺盛的黃花蒿主枝或側(cè)枝，傾斜剪切成15-30cm的黃花蒿枝條。上述提及的冰片和二甲基亞砜(DMSO)為市售產(chǎn)品；所述的冰片分子式為CltlH18O, 又名龍腦、2-莰醇。所述的MS固態(tài)培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)用的標(biāo)準(zhǔn)MS培養(yǎng)基，并經(jīng)過高溫滅菌 (120°C，20min)，在凝固前加入冰片母液配成含相應(yīng)濃度冰片的固態(tài)MS培養(yǎng)基；所述的MS 液態(tài)培養(yǎng)基也是植物組織培養(yǎng)用的標(biāo)準(zhǔn)MS液態(tài)培養(yǎng)基，不需要滅菌。所述的1/2MS固態(tài)培養(yǎng)基是現(xiàn)有常用培養(yǎng)基。如此，本發(fā)明利用冰片處理黃花蒿，誘導(dǎo)其產(chǎn)生不定根，能有效地提高黃花蒿組培苗不定根的發(fā)生率和單株黃花蒿不定根的數(shù)量，且根系發(fā)育良好，移栽成活率高，且操作簡單，不使用激素，安全無殘留，無環(huán)境污染，有效降低黃花蒿無性繁殖的生產(chǎn)成本，提高黃花蒿無性繁殖速度和效率。為大量生產(chǎn)黃花蒿組培再生植株以及黃花蒿的扦插繁殖奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，對大面積推廣高產(chǎn)黃花蒿優(yōu)異種質(zhì)資源具有重要意義，同時(shí)對其他難生根的植物組培苗的培養(yǎng)也具有重要參考價(jià)值。


圖1是采用本發(fā)明方法誘導(dǎo)黃花蒿枝條產(chǎn)生的不定根圖一。圖2是采用本發(fā)明方法誘導(dǎo)黃花蒿無菌芽頭產(chǎn)生的不定根的圖二。
具體實(shí)施例方式下面，本發(fā)明將用實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步的說明，但是它并不限于這些實(shí)施例的任一個(gè)或類似實(shí)例。實(shí)施例1 將黃花蒿種子置于1. 5mL離心管中，加入質(zhì)量濃度為0. 5%的次氯酸鈉溶液浸泡消毒20min，次氯酸鈉溶液以淹蓋住種子為宜，并滴加吐溫20，使吐溫20終濃度為0. 01 % (體積濃度)，浸泡過程中不斷晃動(dòng)，然后倒掉次氯酸鈉溶液，將種子用無菌水沖洗4次，將無菌種子轉(zhuǎn)移至1/2MS固態(tài)培養(yǎng)基，1周后轉(zhuǎn)置MS固態(tài)培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)5周，取生長出的芽頭轉(zhuǎn)置含2mg/L冰片的固態(tài)MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。結(jié)合參見圖2，4周后96%的芽頭生根，繼續(xù)在該固態(tài)MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周，將生根的黃花蒿苗移栽至土壤中，2周后97%的移栽苗成活。培養(yǎng)條件均為每天16h光照，8h黑暗，2600 3000 Ix光照，溫度M ^°C， 相對濕度60 70%。實(shí)施例2:將黃花蒿種子置于1. 5mL離心管中，加入質(zhì)量濃度為1 %的次氯酸鈉溶液浸泡消毒18min，次氯酸鈉溶液以淹蓋住種子為宜，并滴加吐溫20，使吐溫20終濃度為0. 01 % (體積濃度)，浸泡過程中不斷晃動(dòng)，然后倒掉次氯酸鈉溶液，將種子用無菌水沖洗4次，將無菌種子轉(zhuǎn)移至1/2MS固態(tài)培養(yǎng)基，1周后轉(zhuǎn)置MS固態(tài)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5周，取長出的芽頭轉(zhuǎn)置含 4mg/L冰片的固態(tài)MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。2周后93%以上的芽頭生根，繼續(xù)在該固態(tài)MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周，將生根的黃花蒿苗移栽至土壤中，2周后98%的移栽苗成活。培養(yǎng)條件均為每天16h光照，8h黑暗，2600 3000 Ix光照，溫度M ，相對濕度60 70%。實(shí)施例3 將黃花蒿種子播種于土壤中，定期澆水，進(jìn)行常規(guī)的田間管，2個(gè)月后將黃花蒿芽頭剪切下來，加入質(zhì)量濃度為0. 8%的次氯酸鈉溶液浸泡消毒19min，次氯酸鈉溶液以淹蓋住芽頭為宜，并滴加吐溫20，使吐溫20終濃度為0. 01 % (體積濃度)，浸泡過程中不斷晃動(dòng)，然后取出芽頭，用無菌水沖洗4次，在無菌條件下，將消毒后的芽頭的下端切去一部分， 保留34cm，然后轉(zhuǎn)至含6mg/L冰片的固態(tài)MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。4周后97%的芽頭生根， 繼續(xù)在該固態(tài)MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周后移栽至土壤中，2周后97%的移栽苗成活。芽頭在固態(tài)MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)的條件每天16h光照，8h黑暗，2600 3000 Ix光照，溫度M ， 相對濕度60 70%。實(shí)施例4 將黃花蒿種子置于1. 5mL離心管中，加入質(zhì)量濃度為0. 5%的次氯酸鈉溶液浸泡消毒20min，次氯酸鈉溶液以淹蓋住種子為宜，并滴加吐溫20，使吐溫20終濃度為0. 01 % (體積濃度)，浸泡過程中不斷晃動(dòng)，然后倒掉次氯酸鈉溶液，將種子用無菌水沖洗4次后轉(zhuǎn)移至1/2MS固態(tài)培養(yǎng)基，1周后轉(zhuǎn)置MS固態(tài)培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)5周，從黃花蒿植株中選取生長旺盛的主枝或側(cè)枝，傾斜剪切成15-30cm黃花蒿枝條，浸泡在含80mg/ml冰片的液體MS 培養(yǎng)基中20min，扦插上述冰片處理后的黃花蒿枝條于營養(yǎng)土中，并進(jìn)行生根期間的溫度、 濕度和營養(yǎng)管理(生根期間的溫度、濕度和營養(yǎng)管理為現(xiàn)有常用技術(shù)，在此不再贅述)。3 周后96%的扦插枝條生根，將已生根的側(cè)枝移栽至大田，移栽后定期澆水，進(jìn)行常規(guī)的田間管理，2周后100%的移栽苗成活。培養(yǎng)條件均為每天IMi光照，他黑暗，2600 3000 Ix 光照，溫度M 洸°C，相對濕度60 70 %。實(shí)施例5 將黃花蒿種子播種于土壤中，2月后從黃花蒿植株中選取生長旺盛的主枝或側(cè)枝， 傾斜剪切成15-30cm黃花蒿枝條，浸泡在含100mg/ml冰片的液體MS培養(yǎng)基中15min，扦插上述冰片處理后的黃花蒿枝條于營養(yǎng)土中，并進(jìn)行生根期間的溫度、濕度和營養(yǎng)管理。結(jié)合參見圖1，2周后98%的枝條生根，將已生根的側(cè)枝移栽至大田，移栽后定期澆水，進(jìn)行常規(guī)的田間管理，2周后100%的移栽苗成活。冰片處理后的黃花蒿枝條扦插在營養(yǎng)土中的培養(yǎng)條件每天16h光照，8h黑暗，2600 3000 Ix光照，溫度M ，相對濕度60 70%。
實(shí)施例6 將黃花蒿種子播種于土壤中，2月后從黃花蒿植株中選取生長旺盛的主枝或側(cè)枝， 傾斜剪切成15-30cm黃花蒿枝條，浸泡在含110mg/ml冰片的MS液體培養(yǎng)基中l(wèi)Omin，扦插上述冰片處理后的黃花蒿枝條于營養(yǎng)土中，并進(jìn)行生根期間的溫度、濕度和營養(yǎng)管理。4周后98%的枝條生根，將已生根的側(cè)枝移栽至大田，移栽后定期澆水，進(jìn)行常規(guī)的田間管理，2 周后100%的移栽苗成活。冰片處理后的黃花蒿枝條扦插在營養(yǎng)土中的培養(yǎng)條件每天16h 光照，8h黑暗，2600 3000 Ix光照，溫度M ，相對濕度60 70%。
權(quán)利要求
1.一種用冰片高效誘導(dǎo)黃花蒿形成不定根的方法，其特征在于該方法是先將冰片溶解于二甲基亞砜中，配制成100g/L的冰片母液；再于MS固態(tài)培養(yǎng)基中加入冰片母液制成含 2-6mg/L冰片的固態(tài)MS培養(yǎng)基；然后將黃花蒿無菌芽頭在該固態(tài)MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)3_5周， 培養(yǎng)條件每天16h光照，8h黑暗，2600-3000 Ix光照，溫度M_26°C，相對濕度60-70% ；上述冰片和二甲基亞砜皆為分析純。
2.如權(quán)利要求1所述的用冰片高效誘導(dǎo)黃花蒿形成不定根的方法，其特征在于所述黃花蒿無菌芽頭是將黃花蒿種子加入質(zhì)量濃度為0. 5-1 %的次氯酸鈉溶液中浸泡消毒18-20min，次氯酸鈉溶液以淹蓋住種子為宜，并滴加吐溫20，使吐溫20體積終濃度為 0.01%,浸泡過程中不斷晃動(dòng)，然后取出種子，用無菌水沖洗4次后移至1/2MS固態(tài)培養(yǎng)基中，1周后轉(zhuǎn)置MS固態(tài)培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)5周得到，種子在1/2MS固態(tài)培養(yǎng)基和MS固態(tài)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的條件為每天16h光照，8h黑暗，2600-3000 Ix光照，溫度M_26°C，相對濕度 60-70%。
3.如權(quán)利要求1所述的用冰片高效誘導(dǎo)黃花蒿形成不定根的方法，其特征在于所述黃花蒿無菌芽頭是將黃花蒿芽頭加入質(zhì)量濃度為0. 5-1 %的次氯酸鈉溶液中浸泡消毒18-20min，次氯酸鈉溶液以淹蓋住芽頭為宜，并滴加吐溫20，使吐溫20體積終濃度為 0.01%,浸泡過程中不斷晃動(dòng)，然后取出芽頭，用無菌水沖洗4次后，在無菌條件下，將消毒后的芽頭保留34cm，即得。
4.一種用冰片高效誘導(dǎo)黃花蒿形成不定根的方法，其特征在于該方法是先將冰片溶解于二甲基亞砜中，配制成100g/L的冰片母液；再于MS液態(tài)培養(yǎng)基中加入冰片母液制成含80-110mg/L冰片的液態(tài)MS培養(yǎng)基；然后將黃花蒿枝條在上述液態(tài)MS培養(yǎng)基中浸泡 10-20min之后扦插在營養(yǎng)土中培養(yǎng)2_4周，培養(yǎng)條件每天16h光照，8h黑暗，2600-3000 Ix光照，溫度M_26°C，相對濕度60-70 %。
5.如權(quán)利要求4所述的用冰片高效誘導(dǎo)黃花蒿形成不定根的方法，其特征在于所述黃花蒿枝條是選取生長旺盛的黃花蒿主枝或側(cè)枝，傾斜剪切成15_30cm的黃花蒿枝條。
全文摘要
一種用冰片高效誘導(dǎo)黃花蒿形成不定根的方法，是先配制冰片母液；再于MS固態(tài)培養(yǎng)基或MS液態(tài)培養(yǎng)基中加入冰片母液制成含冰片的固態(tài)MS培養(yǎng)基或液態(tài)MS培養(yǎng)基；然后將黃花蒿無菌芽頭在該固態(tài)MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，或者將黃花蒿枝條在該液態(tài)MS培養(yǎng)基中浸泡后扦插在營養(yǎng)土中培養(yǎng)。本發(fā)明通過冰片處理黃花蒿枝條，能有效地提高不定根的發(fā)生頻率和單株黃花蒿不定根的數(shù)量，操作簡單，不使用激素，安全無殘留，無環(huán)境污染，有效降低黃花蒿無性繁殖的生產(chǎn)成本，提高黃花蒿無性繁殖速度和效率，對大面積推廣高產(chǎn)黃花蒿優(yōu)異種質(zhì)資源有重要意義。
文檔編號A01H4/00GK102524072SQ20121001606
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月18日
發(fā)明者劉仲華, 劉碩謙, 田娜, 黃建安 申請人:劉碩謙