專利名稱：一種巨尾桉轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種桉樹轉(zhuǎn)化方法，特別是巨尾桉轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
桉樹是桃金娘科Myrtaceae桉屬Eucalyptus植物的統(tǒng)稱,常綠喬木,為世界三大速生造林樹種之一。桉樹原產(chǎn)于澳洲，廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，具有速生豐產(chǎn)、適應(yīng)性廣等特點。在我國，桉樹主要分布于海南、福建及兩廣地區(qū)，是我國南方應(yīng)用最廣的造林及經(jīng)濟樹種。然而，在中亞熱帶地區(qū)，低溫凍害是按樹引種、擴大栽培與速生豐產(chǎn)的主要限制因子。因此，按樹的抗寒品種選育，尤其選擇適合我國既耐寒、經(jīng)濟價值又高的優(yōu)良按樹種/種源向北推移，擴大引種栽培范圍，加快按樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展就成為育種的重要目的之一。1991年Teulieres C等首次在岡尼桉(Eucalyptus gunnii)原生質(zhì)體上、轉(zhuǎn)化報告基因，目前已對岡尼桉、朽1檬桉(E. citriodora)、藍(lán)桉(E. globulus)、赤桉(E. camaldulensis)、巨桉(E. grandis)、尾葉桉(E. urophylla)等進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化的研究。另外，近年來桉樹高效再生體系的建立、高密度基因圖譜構(gòu)建以及分子標(biāo)記的快速發(fā)展為桉樹轉(zhuǎn)基因研究提供了條件和依據(jù)。傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法在桉樹的轉(zhuǎn)基因研究中是比較有效的方法之一，目前通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法已經(jīng)對巨桉、鄧恩桉、亮果桉、赤桉、巨尾桉和尾巨桉等10幾種桉樹中進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因研究。但它仍舊面臨著轉(zhuǎn)化效率較低、再生技術(shù)的限制(只在赤桉、巨桉等少數(shù)幾個種中有轉(zhuǎn)基因植株的報道，在其它桉樹品種中報道較少)、外源基因表達(dá)的時空調(diào)控、轉(zhuǎn)基因植株對環(huán)境的生物安全性等諸多問題。因此，探索改良新的轉(zhuǎn)化體系，提高轉(zhuǎn)化效率成為桉樹轉(zhuǎn)基因技術(shù)是否可以將理論研究付諸于造林應(yīng)用的一個重要內(nèi)容。甘露糖磷酸異構(gòu)酶(phosphomannose isomerase,PMI)基因在自然界中廣泛存在，而除肉桂(Cinnamomum cassia)和一些豆類外，自然界的植物中大都沒有編碼PMI的基因。因而以甘露糖為篩選劑的正向篩選系統(tǒng)在包括桉樹在內(nèi)的絕大多數(shù)植物的遺傳轉(zhuǎn)化中都是可用的。PMI作為一種正向篩選標(biāo)記，其本身對植物是無害的。當(dāng)培養(yǎng)基中加入適當(dāng)比例的甘露糖/蔗糖時，轉(zhuǎn)化植株可以將甘露糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖，作為碳源供植株生長；而非轉(zhuǎn)化植株則會因為碳源的缺乏呈現(xiàn)出相對的生長劣勢，繼而與轉(zhuǎn)基因植株區(qū)分開來。另夕卜，與以住的除草劑、抗生素相比，PMI標(biāo)記基因的生物安全性得以保障，這一點對于作為造林樹種的桉樹尤為重要。而且，將安全性標(biāo)記基因PMI應(yīng)用于桉樹的研究目前國內(nèi)國際均未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種安全高效的巨尾桉遺傳轉(zhuǎn)化方法，以便解決現(xiàn)有技術(shù)中所述農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化桉樹所遇到的問題。本發(fā)明通過構(gòu)建以安全性標(biāo)記基因PMI (6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶)為篩選標(biāo)記的表達(dá)載體，通過大量的組培試驗及對遺傳轉(zhuǎn)化方法的改進(jìn)，最終將目的基因AmCBLl成功轉(zhuǎn)入巨尾桉中。該目的基因來源于超旱生植物沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus (Maxim.) Cheng f.),由其特異性啟動子 AmCBLlP 所驅(qū)動，該
啟動子功能已經(jīng)驗證。本發(fā)明的目的是通過如下方式實現(xiàn)的一種巨尾桉轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟(I)將目的基因連入含有6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)的表達(dá)載體pCAMBIA1301上，將所述載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105 ；
(2)將所述農(nóng)桿菌于含有100mg/mL卡那霉素和50mg/mL利福平的YEB培養(yǎng)基中，28°C, 180轉(zhuǎn)/分鐘，避光搖至OD值為O. 4 O. 6 ；8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，沉淀收集菌體；(3)使用含有乙酰丁香酮(Acetosyringone,以下簡稱AS) 50mg/L、2-(N_嗎啡啉)乙磺酸150mg/L和半乳糖I. 8g/L的無鹿糖MS液體培養(yǎng)基懸浮菌體,懸浮后的菌液OD值仍調(diào)至0. 4 0. 7 ;(4)取巨尾桉組培苗莖段，剪為0. 5厘米左右，接種于預(yù)培養(yǎng)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度為25±2°C的培養(yǎng)室中，暗培養(yǎng)I天，進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)；(5)取懸浮后的菌液侵染經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的巨尾桉莖段，侵染時間為4 7分鐘；侵染后接種至共培養(yǎng)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度為25±2°C的培養(yǎng)室中，暗培養(yǎng)3天中，進(jìn)行共培養(yǎng);(6)將共培養(yǎng)后的莖段轉(zhuǎn)接至篩選階段的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度為25±2°C的培養(yǎng)室中，暗培養(yǎng)40 45天，進(jìn)行選擇性培養(yǎng)；(7)統(tǒng)計選擇性培養(yǎng)后的愈傷組織誘導(dǎo)率，將產(chǎn)生的愈傷組織接至篩選階段的分化培養(yǎng)基中，在光照強度為1500 2000勒克斯、光周期為18小時/天、溫度為25±2°C的培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行芽分化培養(yǎng)；(8)約25 30天后，將分化得到的芽編號，并移入新的篩選階段的分化培養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行分化培養(yǎng)；(9)取分化培養(yǎng)中高約2厘米左右的小芽，接入篩選階段的生根培養(yǎng)基中，在光照強度為1500 2000勒克斯、光周期為18小時/天、溫度為25±2°C的培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行生根培養(yǎng)，40 45天后將生根巨尾桉幼苗移入土中；(10)取經(jīng)篩選培養(yǎng)得到的巨尾桉株系葉片進(jìn)行氯酚紅檢測，轉(zhuǎn)化成功的株系的檢測液產(chǎn)生變色反應(yīng)；用轉(zhuǎn)化成功的株系提取DNA，以AmCBLl基因正向引物AmCBLl-I和反向引物AmCBLl-2為引物，經(jīng)PCR反應(yīng)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因鑒定，確定這些株系的DNA中是否獲得了目的基因。其中，所述目的基因是AmCBLl基因，所述目的基因來源于超旱生植物沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus (Maxim.) Cheng f.)，該基因由其特異性啟動子 AmCBLlP所驅(qū)動。所述懸浮后的菌液OD值優(yōu)選仍調(diào)至0. 5 0. 6。所述侵染時間優(yōu)選為5 6分鐘。所述預(yù)培養(yǎng)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基是含苯基噻二唑脲(Thidiazuron,以下簡稱TDZ)0. 5mg/L、蔡乙酸(1-naphthlcetic acid,以下簡稱 NAA)0. lmg/L、鹿糖 30g/L 和瓊脂7g/L的MS培養(yǎng)基。
所述共培養(yǎng)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基是含羧芐青霉素(Carbenicillin，以下簡稱Car) 200mg/L、TDZ O. 5mg/L、NAA O. lmg/L、蔗糖 30g/L 和瓊脂 7g/L 的 MS 培養(yǎng)基。所述篩選階段的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基是含有Car 200mg/L、TDZ O. 5mg/L、NAA O. lmg/L、蔗糖19g/L、甘露糖llg/L和瓊脂7g/L的MS培養(yǎng)基。所述篩選階段的分化培養(yǎng)基中是含有Car 200mg/L、蔗糖19g/L、甘露糖llg/L和瓊脂7g/L的MS培養(yǎng)基。 所述篩選階段的生根培養(yǎng)基是含有Car 200mg/L、IBA O. 5mg/L、NAA O. 5mg/L、蔗糖19g/L、甘露糖llg/L和瓊脂7g/L的1/2MS培養(yǎng)基。AmCBLl 基因正向引物 AmCBLl-I 的序列為ATGGGGTGCT TCAACTCTAA反向引物AmCBLl-2 為引物的序列為TCAAGCAGCA ACTTCATCC組培基礎(chǔ)I.巨尾桉的愈傷誘導(dǎo)敏感性試驗為獲得巨尾桉愈傷組織誘導(dǎo)所最適宜的生根培養(yǎng)基配方，本實驗選用TDZ與NAA，按以下激素配比配制愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基表I培養(yǎng)基莖段葉片
TDZ(mg/L)NAA(mg/L)愈傷_^^_
0.1正常4/10無
0.10.1發(fā)紅3/10無
0.1_03_ML_1/10_^_
0.3正常4/10無
0.30.1正常1/10無 0.3_03_M_1/10_^_
0.5好1/10無
0.50.1好8/10無
0.5_03_M_7/10_^_
0.6正常1/10無
0.60.1不好3/10無
0.6_03_W_2/10_^_
0.7正常2/10無
0.70.1不好無無
0.7_03_W_^^_
0.8正常無無
0.80.1紅1/10無
0.8_03_^_3/10_^_
0.9 紅 1/10 無0.9 0.1 紅 1/10 無
0.9_03_^_2/10_^_
1.0好1/10無
1.00.1稍紅3/10無
1.0_03_IMl_3/10_^_
1.5好無無
1.50.1稍紅無無
1.5_03_IMl_1/10_^_由表I可知，巨尾桉葉片幾乎沒有愈傷組織的分化，而莖段分化愈傷組織的能力要明顯好于葉片。另外，TDZ對巨尾桉的愈傷組織誘導(dǎo)均具有顯著的影響。TDZ的濃度取
O.5mg/L最為適宜，過低濃度的TDZ會使愈傷組織發(fā)紅，而過高濃度的TDZ則導(dǎo)致愈傷組織的芽分化率明顯降低。NAA對對巨尾桉的愈傷組織誘導(dǎo)影響不甚顯著，但適當(dāng)濃度的NAA會增加芽的分化率。因此，最終選擇的最佳愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+TDZa5mg/L+NAA0. lmgA。

注培養(yǎng)基中加入蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，調(diào)至PH7。操作方法剪取長度約Icm桉樹莖段(無側(cè)枝)，及長寬均約O. 5cm的桉樹葉片，于25°C組培室，先黑暗培養(yǎng)30天后光照培養(yǎng)，統(tǒng)計愈傷生長情況。2.巨尾桉的生根培養(yǎng)試驗為獲得巨尾桉生根培養(yǎng)所最適宜的生根培養(yǎng)基配方，本實驗選用NAA與IBA，按以下激素配比配制生根培養(yǎng)基

表 權(quán)利要求
1.一種巨尾桉轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟 (1)將目的基因連入含有6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)的表達(dá)載體PCAMBIA1301上，將所述載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105 ； (2)將所述農(nóng)桿菌于含有100mg/mL卡那霉素和50mg/mL利福平的YEB培養(yǎng)基中，28°C，180轉(zhuǎn)/分鐘，避光搖至OD值為O. 4 O. 6 ；8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，沉淀收集菌體； (3)使用含有乙酰丁香酮50mg/L、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸150mg/L和半乳糖I.8g/L的無蔗糖MS液體培養(yǎng)基懸浮菌體，懸浮后的菌液OD值仍調(diào)至O. 4 O. 7 ; (4)取巨尾桉組培苗莖段，剪為O.5厘米左右，接種于預(yù)培養(yǎng)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度為25±2°C的培養(yǎng)室中，暗培養(yǎng)I天，進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)； (5)取懸浮后的菌液侵染經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的巨尾桉莖段，侵染時間為4 7分鐘；侵染后接種至共培養(yǎng)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度為25 ± 2°C的培養(yǎng)室中，暗培養(yǎng)3天中，進(jìn)行共培養(yǎng)； (6)將共培養(yǎng)后的莖段轉(zhuǎn)接至篩選階段的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度為25±2°C的培養(yǎng)室中，暗培養(yǎng)40 45天，進(jìn)行選擇性培養(yǎng)； (7)統(tǒng)計選擇性培養(yǎng)后的愈傷組織誘導(dǎo)率，將產(chǎn)生的愈傷組織接至篩選階段的分化培養(yǎng)基中，在光照強度為1500 2000勒克斯、光周期為18小時/天、溫度為25±2°C的培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行芽分化培養(yǎng)； (8)約25 30天后，將分化得到的芽編號，并移入新的篩選階段的分化培養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行分化培養(yǎng)； (9)取分化培養(yǎng)中高約2厘米左右的小芽，接入篩選階段的生根培養(yǎng)基中，在光照強度為1500 2000勒克斯、光周期為18小時/天、溫度為25±2°C的培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行生根培養(yǎng)，40 45天后將生根巨尾桉幼苗移入土中； (10)取經(jīng)篩選培養(yǎng)得到的巨尾桉株系葉片進(jìn)行氯酚紅檢測，轉(zhuǎn)化成功的株系的檢測液產(chǎn)生變色反應(yīng)；用轉(zhuǎn)化成功的株系提取DNA，以AmCBLl基因正向引物AmCBLl-I和反向引物AmCBLI-2為引物，經(jīng)PCR反應(yīng)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因鑒定，確定這些株系的DNA中是否獲得了目的基因。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述目的基因來源于超旱生植物沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus (Maxim.) Cheng f.)，該基因由其特異性啟動子AmCBLlP所驅(qū)動。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述懸浮后的菌液OD值仍調(diào)至O.5 O. 6。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述侵染時間為5 6分鐘。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述預(yù)培養(yǎng)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基是含苯基噻二唑服(Thidiazuron,以下簡稱 TDZ)0. 5mg/L、萘乙酸(1-naphthlcetic acid,以下簡稱NAA) 0. lmg/L、蔗糖30g/L和瓊脂7g/L的MS培養(yǎng)基。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述共培養(yǎng)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基是含羧芐青霉素(Carbenici 11 in,以下簡稱 Car) 200mg/L> TDZ 0. 5mg/L、NAA 0. lmg/L、鹿糖 30g/L 和瓊脂7g/L的MS培養(yǎng)基。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述篩選階段的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基是含有Car200mg/L、TDZ 0. 5mg/L、ΝΑΑ0. lmg/L、蔗糖 19g/L、甘露糖 llg/L 和瓊脂 7g/L 的 MS 培養(yǎng)基。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述篩選階段的分化培養(yǎng)基中是含有Car200mg/L、蔗糖19g/L、甘露糖llg/L和瓊脂7g/L的MS培養(yǎng)基。
9.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述篩選階段的生根培養(yǎng)基是含有Car200mg/L、IBA O. 5mg/L、NAA O. 5mg/L、蔗糖 19g/L、甘露糖 llg/L 和瓊脂 7g/L 的 1/2MS 培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種安全高效的巨尾桉遺傳轉(zhuǎn)化方法，以便解決現(xiàn)有技術(shù)中所述農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化桉樹所遇到的問題。本發(fā)明通過構(gòu)建以安全性標(biāo)記基因PMI(6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶)為篩選標(biāo)記的表達(dá)載體，通過大量的組培試驗及對遺傳轉(zhuǎn)化方法的改進(jìn)，最終將目的基因AmCBL1成功轉(zhuǎn)入巨尾桉中。該目的基因來源于超旱生植物沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus(Maxim.)Cheng f.)，由其特異性啟動子AmCBL1P所驅(qū)動。
文檔編號A01H5/00GK102660575SQ201210019229
公開日2012年9月12日 申請日期2012年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月20日
發(fā)明者夏新莉, 尹偉倫, 龐濤 申請人:北京林業(yè)大學(xué)