專利名稱：一種高黃酮含量馬棘的培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種馬棘的培育方法，尤其是提高黃酮含量的馬棘的培育方法。
背景技術(shù)：
我國新農(nóng)村建設(shè)的首要任務(wù)是不斷提高農(nóng)民收入，發(fā)展效益農(nóng)業(yè)是有效途徑之一。因此，在繼續(xù)重視高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和抗病農(nóng)作物傳統(tǒng)育種的同時(shí)，發(fā)展以功能型為特征的農(nóng)作物成為育種新方向，有助于提高農(nóng)產(chǎn)品的附加值，實(shí)現(xiàn)效益農(nóng)業(yè)與農(nóng)民增收有機(jī)結(jié)合， “以用促種”保障農(nóng)村經(jīng)濟(jì)持續(xù)穩(wěn)定長效機(jī)制的形成。馬棘(Indigofera pseudotinctoria Mats)系豆科木藍(lán)屬多年生小灌木,具有耐熱、耐旱、耐瘠、適應(yīng)性廣的特點(diǎn)，適合綠化荒山、護(hù)坡固坎、保持水土，也是牛和羊等草食性動(dòng)物的優(yōu)質(zhì)青飼料。我國為多山、多丘陵的國家，馬棘尤其適宜種植于廣大貧瘠干旱的堤坡緩地，這對山區(qū)生態(tài)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。生物總黃酮系一大類天然產(chǎn)物，廣泛存在于植物界，是許多中草藥的有效成分具有如下重要的生理功能消除疲勞、保護(hù)血管、防動(dòng)脈硬化、擴(kuò)張毛細(xì)血管、疏通微循環(huán)、活化大腦及其他臟器細(xì)胞的功能、抗脂肪氧化、抗衰老。黃酮醇合成酶基因FLS是黃酮生物合成中關(guān)鍵調(diào)控酶，可以二氫黃酮醇為底物， 高效調(diào)控合成槲皮素、山萘酚、楊梅素等黃酮醇。

發(fā)明內(nèi)容
正是在上述背景下，本發(fā)明的目的是提出一種高黃酮含量馬棘的培育方法，以獲得高黃酮含量馬棘，進(jìn)行類黃酮的開發(fā)，用于食品、醫(yī)藥、飼料和化工等領(lǐng)域。本發(fā)明的高黃酮含量馬棘的培育方法，包括以下步驟
I)取馬棘的成熟種子為外植體，接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在25±1°C、光強(qiáng)3000勒克司光條件下誘導(dǎo)形成愈傷組織；
2)將誘導(dǎo)形成3周的愈傷組織，轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)至愈傷組織進(jìn)入成倍增
殖期；
3)將成倍增殖的愈傷組織，在25±1°C避光的黑暗條件下進(jìn)行受體愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)
2天；
4)將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織，在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡15分鐘，之后棄去菌液，用無菌濾紙吸干，接種于共培養(yǎng)基上，在25±1°C避光的黑暗條件下共培養(yǎng)2天；
5)將上述共培養(yǎng)愈傷組織，洗凈、晾干后，轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基，在25± I °C避光的黑暗條件下培養(yǎng)6周，收集新長出的抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)移至新的篩選培養(yǎng)基上，再進(jìn)行連續(xù)2輪繼代篩選，每隔3周轉(zhuǎn)繼I次；
6)取3輪篩選后的抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基，在25±1°C、光強(qiáng)3000勒克司光條件下誘導(dǎo)分化成苗，對抗性植株進(jìn)行組織化學(xué)染色和分子檢測，選留含目的基因插入序列的的轉(zhuǎn)基因植株，所說的目的基因插入序列是指目的基因黃酮醇合成酶基因/ &標(biāo)記基因葡糖苷酸酶基因GUS和篩選基因抗潮霉素基因HPT的插入序列，目的基因黃酮醇合成酶基因片段長821bp ；
7)取入選的轉(zhuǎn)基因植株，田間種植后收獲種子，測定葉片內(nèi)黃酮含量，選留黃酮含量高于3%的轉(zhuǎn)基因植株；
8)繼續(xù)種植步驟7)篩選的轉(zhuǎn)基因株系，評價(jià)黃酮含量的表達(dá)穩(wěn)定性，繁殖黃酮含量穩(wěn)定高于3%的優(yōu)良株系，為培育的高黃酮含量馬棘。本發(fā)明中，所說的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加2，4-D1. 5mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g, pH滅菌前5. 8。本發(fā)明中，所說的繼代培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加2，4-D Img蔗糖30g和瓊脂粉
6.8g, pH 滅菌前 5. 8。本發(fā)明中，所說的共培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加2，4-D lmg、乙酰丁香酮2mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH滅菌前5. 8。本發(fā)明中，所說的篩選培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加2，4-D lmg、潮霉素25mg、羧卞 200 mg、鹿糖30g和瓊脂粉6. 8g, pH滅菌前5. 8。本發(fā)明中，所說的分化培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加6-BA1. Omg、NAAlmg、KTI. 5mg、 羧卞200mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH滅菌前5. 8。上述的N6 基本培養(yǎng)基為 KNO3 2830mg、(NH4)2SO4 463mg、CaCl2 2H20 166mg、 MgSO4 7H20 185mg、KH2PO4 400mg、MnSO4 4H20 4. 4mg、ZnSO4 7H20 I. 5mg、FeSO4 7H20 27. 8mg、Na2-EDTA 2H20 37. 3mg、H3BO3 I. 6mg、肌醇 lOOmg、煙酸 0. 5mg、維生素 B6 0. 5mg、 維生素BI 0. 5mg和甘氨酸2mg。本發(fā)明中，所說的農(nóng)桿菌的菌株為EHA105，內(nèi)含質(zhì)粒pCAM1305，pCAM1305的T-DNA 區(qū)域攜帶目的基因插入序列，包括目的基因黃酮醇合成酶基因/ &標(biāo)記基因葡糖苷酸酶基因GUS和篩選基因抗潮霉素基因HPT的插入序列。目的基因黃酮醇合成酶基因片段長 821bp，與35S和nos終止子共同構(gòu)成表達(dá)框架。菌株為EHAlO方便購買或贈(zèng)送獲得，在一般植物遺傳實(shí)驗(yàn)室均有保存，參見文獻(xiàn)吳關(guān)庭等，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38 (12) :2395-2402。上述的標(biāo)記基因葡糖苷酸酶基因⑶S的組織化學(xué)染色方法參見Rueb和Hensgens. Rice Genetics Newsletters, 1989, (6): 168-169,篩選基因抗潮霉素基因 HPT 的分子檢測方法參見文獻(xiàn)吳關(guān)庭等，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38 (12) :2395-2402。本發(fā)明中，所說的黃酮含量檢測方法，以蘆丁為標(biāo)樣的比色法在波長510nm處測定，參見文獻(xiàn)楊美華，盧充偉，匡巖巍，等.柱色譜-紫外分光光度法測定廣金錢草中總黃酮的含量.中草藥，2004，35(6) : 688 690。上述的穩(wěn)定性是指入選馬棘中黃酮含量在不同年份間(2年以上)、季節(jié)間(2季以上)以及地點(diǎn)間(2個(gè)地點(diǎn)以上)的含量變化不顯著。本發(fā)明培育的高黃酮含量的馬棘，具有以下優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明首先利用黃酮醇合成酶基因FLS，作為黃酮生物合成中的關(guān)鍵中間調(diào)控酶，調(diào)控合成槲皮素、山萘酚、楊梅素等黃酮醇，培育出高黃酮含量馬棘，進(jìn)行高效生物提取，發(fā)展新型保健食品添加劑和營養(yǎng)強(qiáng)化劑，用于食品、醫(yī)藥飼料和化工等領(lǐng)域。


圖I是本發(fā)明所用的黃酮醇合成酶基因插入序列的載體構(gòu)建示意圖。
具體實(shí)施例方式以下通過具體實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例I :
以取馬棘品系“ZJJ01”的成熟種子為外植體，接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在25±1°C、光強(qiáng) 3000勒克斯光條件下誘導(dǎo)形成愈傷組織；
取誘導(dǎo)形成3周的愈傷組織，轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)至愈傷組織進(jìn)入成倍增殖
期；
取成倍增殖的愈傷組織，在25±1°C、避光的黑暗條件下進(jìn)行受體愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)2
天;
取經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織(約500個(gè)培養(yǎng)皿，含5000塊以上的愈傷組織)，在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡15分鐘，之后棄去菌液，用無菌濾紙吸干，接種于共培養(yǎng)基上，在25 ± I °C、避光的黑暗條件下共培養(yǎng)2天；
取上述共培養(yǎng)愈傷組織，洗凈、晾干后，轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基，在25土 1°C、避光的黑暗條件下培養(yǎng)6周，收集新長出的抗性愈傷組織(約450塊愈傷組織)，轉(zhuǎn)移至新的篩選培養(yǎng)基上，再進(jìn)行連續(xù)2輪繼代篩選，每隔3周轉(zhuǎn)繼I次；
取3輪篩選后的抗性愈傷組織(約90塊愈傷組織)，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基，在25±1°C、光強(qiáng)3000勒克斯光條件下誘導(dǎo)分化成苗83株，對抗性植株進(jìn)行標(biāo)記基因GUS組織化學(xué)染色和篩選基因HPT分子檢測，選留含目的基因黃酮醇合成酶基因插入序列的轉(zhuǎn)基因植株 21株(目的基因插入序列的載體構(gòu)建如圖I所示)。取入選的轉(zhuǎn)基因植株，田間種植后收獲種子，進(jìn)行葉片內(nèi)黃酮含量檢測，選留黃酮含量高于3%的轉(zhuǎn)基因植株9株，繼續(xù)種植轉(zhuǎn)基因株系；
2008-2010連續(xù)3年，分別在浙江杭州、臨安、富陽三地三季評價(jià)總黃酮含量的表達(dá)穩(wěn)定性，繁殖總黃酮含量穩(wěn)定高于10%的優(yōu)良株系，最終培育高黃酮含量馬棘4個(gè)，T-MJ-U T-MJ-2、T-MJ-3和T-MJ-4，其葉片內(nèi)總黃酮含量分別為5. 1%、4. 6%、3. 7%、3. 2%，而原馬棘的總黃酮含量僅為0. 82%。
權(quán)利要求
1.一種高黃酮含量馬棘的培育方法，包括以下步驟I)取馬棘的成熟種子為外植體，接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在25±l°c、光強(qiáng)3000勒克司光條件下誘導(dǎo)形成愈傷組織；2)將誘導(dǎo)形成3周的愈傷組織，轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)至愈傷組織進(jìn)入成倍增殖期；3)將成倍增殖的愈傷組織，在25±1°C避光的黑暗條件下進(jìn)行受體愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)2天；4)將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織，在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡15分鐘，之后棄去菌液，用無菌濾紙吸干，接種于共培養(yǎng)基上，在25±1°C避光的黑暗條件下共培養(yǎng)2天；5)將上述共培養(yǎng)愈傷組織，洗凈、晾干后，轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基，在25± I °C避光的黑暗條件下培養(yǎng)6周，收集新長出的抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)移至新的篩選培養(yǎng)基上，再進(jìn)行連續(xù)2輪繼代篩選，每隔3周轉(zhuǎn)繼I次；6)取3輪篩選后的抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基，在25±1°C、光強(qiáng)3000勒克司光條件下誘導(dǎo)分化成苗，對抗性植株進(jìn)行組織化學(xué)染色和分子檢測，選留含目的基因插入序列的的轉(zhuǎn)基因植株，所說的目的基因插入序列是指目的基因黃酮醇合成酶基因/ &標(biāo)記基因葡糖苷酸酶基因GUS和篩選基因抗潮霉素基因HPT的插入序列，目的基因黃酮醇合成酶基因片段長821bp ；7)取入選的轉(zhuǎn)基因植株，田間種植后收獲種子，測定葉片內(nèi)黃酮含量，選留黃酮含量高于3%的轉(zhuǎn)基因植株；8)繼續(xù)種植步驟7)篩選的轉(zhuǎn)基因株系，評價(jià)黃酮含量的表達(dá)穩(wěn)定性，繁殖黃酮含量穩(wěn)定高于3%的優(yōu)良株系，為培育的高黃酮含量馬棘。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高黃酮含量馬棘的培育方法，其特征在于所說的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加2，4-D1. 5mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH滅菌前5. 8。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高黃酮含量馬棘的培育方法，其特征在于所說的繼代培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加2，4-D lmg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH滅菌前5. 8。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高黃酮含量馬棘的培育方法，其特征在于所說的共培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加2，4-D lmg、乙酰丁香酮2mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH滅菌前5. 8。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高黃酮含量馬棘的培育方法，其特征在于所說的篩選培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加2，4-D lmg、潮霉素25mg、羧卞200 mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH 滅菌前5. 8。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高黃酮含量馬棘的培育方法，其特征在于所說的分化培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加6-BA1. Omg、NAAlmg、KTI. 5mg、羧卞200mg、鹿糖30g和瓊脂粉6. 8g, pH滅菌前5. 8。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6所述的高黃酮含量馬棘的培育方法，其特征在于所說的N6基本培養(yǎng)基為 KNO3 2830mg、(NH4)2SO4 463mg、CaCl2 · 2H20 166mg、MgSO4 · 7H20 185mg、KH2PO4 400mg、MnSO4 · 4H20 4. 4mg、ZnSO4 · 7H20 I. 5mg、FeSO4 · 7H20 27. 8mg、Na2-EDTA · 2H20 37. 3mg,H3BO3 I. 6mg、肌醇 lOOmg、煙酸 0. 5mg、維生素 B6 0. 5mg、維生素 BI 0. 5mg 和甘氨酸2mg。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高黃酮含量馬棘的培育方法，步驟包括取馬棘的成熟種子為外植體，誘導(dǎo)愈傷組織，繼代培養(yǎng)至成倍增殖期，暗條件預(yù)培養(yǎng)，進(jìn)行農(nóng)桿菌共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基進(jìn)行3輪篩選，取抗性愈傷組織誘導(dǎo)分化成苗，對抗性植株進(jìn)行標(biāo)記基因組織化學(xué)染色和篩選基因分子檢測，鑒定含目的基因黃酮醇合成酶基因FLS插入序列的分化小苗，對入選的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行葉片內(nèi)黃酮含量檢測，選留黃酮含量高于3%的轉(zhuǎn)基因植株，繼續(xù)種植評價(jià)黃酮含量的表達(dá)穩(wěn)定性，繁殖黃酮含量穩(wěn)定高于3%的優(yōu)良株系。本發(fā)明的高黃酮含量馬棘，可以進(jìn)行黃酮生物提取發(fā)展新型保健食品添加劑和營養(yǎng)強(qiáng)化劑。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102577950SQ201210028270
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月9日
發(fā)明者葉紅霞, 吳殿星, 張寧, 沈曉霞, 舒小麗 申請人:浙江大學(xué)