專利名稱：一種短小芽孢桿菌、益生菌制劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一種具高酶活性和抑弧菌活性的短小芽孢桿菌，及利用其作為活性成份的益生菌制劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著規(guī)?；?、集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，水產(chǎn)養(yǎng)殖病害頻繁發(fā)生，為了控制疾病，一些抗生素藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛使用和濫用，不僅造成環(huán)境中藥物殘留、細(xì)菌耐藥性增加，而且由于水體環(huán)境的流動(dòng)性，耐藥基因更容易水平轉(zhuǎn)移，造成更多耐藥株的出現(xiàn)。 為了應(yīng)對(duì)耐藥性，養(yǎng)殖中不得不加大用量并不斷更換藥物種類(lèi)，進(jìn)而造成惡性循環(huán)。另一方面藥物的大量使用，藥物在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)殘留造成的食品安全問(wèn)題也日益引起關(guān)注。為了應(yīng)對(duì)這些問(wèn)題，采用替代的生物防治措施成為當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖的熱點(diǎn)，其中益生菌的應(yīng)用在水產(chǎn)養(yǎng)殖中越來(lái)越受到重視，它們不僅具有抑制細(xì)菌性病原的作用，還具有促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)、改善免疫等作用。市場(chǎng)上水產(chǎn)用益生菌產(chǎn)品，名目繁多，層出無(wú)窮，但是概括起來(lái)存在以下問(wèn)題(1) 絕大多數(shù)產(chǎn)品的益生菌直接來(lái)源于人類(lèi)和陸生動(dòng)物的益生菌種類(lèi)。這些陸源益生菌是否能長(zhǎng)期存活于水體環(huán)境或水生動(dòng)物的腸道則幾乎無(wú)相關(guān)的報(bào)道。Panigrahi等(2004)則直接認(rèn)為那些借鑒畜禽思路所研制的水產(chǎn)益生菌存在難定植的不足，不能在水產(chǎn)動(dòng)物消化道內(nèi)存留并大量繁殖。(2)水產(chǎn)益生菌產(chǎn)品以水質(zhì)調(diào)節(jié)劑為主，飼用添加劑為次要。一些益生菌產(chǎn)品標(biāo)示其既可作水質(zhì)調(diào)節(jié)劑也可作為飼用添加劑，顯然違背了微生物生長(zhǎng)環(huán)境存在差異的規(guī)律。(3)作為飼用添加劑的益生菌產(chǎn)品以枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌為常見(jiàn)，少見(jiàn)其它類(lèi)型的芽孢桿菌，而上述三種芽孢桿菌并非海洋環(huán)境的常見(jiàn)菌群。(4)水產(chǎn)益生菌產(chǎn)品中菌株的酶活效果不明確、抑菌效果不明確，而這二項(xiàng)指標(biāo)是評(píng)價(jià)飼用益生菌的效果的核心指標(biāo)。以當(dāng)前水產(chǎn)益生菌使用最多的芽孢桿菌為例，目前已經(jīng)報(bào)道的芽孢桿菌抗菌素有169種，這些抗菌素主要是肽類(lèi)，多作用于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。人和陸生動(dòng)物的腸道主要病原菌是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，因此對(duì)于人和陸生動(dòng)物而言，芽孢桿菌是比較合適的益生菌。但是對(duì)于海洋水產(chǎn)動(dòng)物而言，主要的病原菌是革蘭氏陰性菌，如弧菌。芽孢桿菌對(duì)于這些來(lái)自水產(chǎn)動(dòng)物的革蘭氏陰性菌的抑制效果還少見(jiàn)報(bào)道。因此不可照搬挪用，需要針對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的特點(diǎn)篩選對(duì)弧菌等革蘭氏陰性菌有抑制效果的芽孢桿菌等。結(jié)合上述問(wèn)題， 我們迫切需要從水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)的土著環(huán)境和腸道中分離益生菌株，并且以酶活性和抑菌活性作為篩選和評(píng)價(jià)效果的主要指標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種分離自健康凡納濱對(duì)蝦腸壁粘膜且具有高酶活性和抑弧菌活性的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149，該菌于2011年11月23日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)CCTCC NO :M2011411。本發(fā)明所述的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) LV149分離自健康凡納濱對(duì)奸腸壁粘膜。短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149的生物學(xué)特征如下I、菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)特征菌株在LB瓊脂培養(yǎng)基和2216E培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為乳白色、扁平、表面較濕、不透明、褶皺、邊緣不整齊，培養(yǎng)24小時(shí)菌落直徑2-4_。桿狀， 芽孢橢圓形，中性或偏端生。2、生理生化特征菌株生長(zhǎng)適宜鹽度范圍5_35%。，7%以上NaCl不生長(zhǎng)，生長(zhǎng)適宜pH范圍為5-9。革蘭氏陽(yáng)性，接觸酶(_)，氧化酶(+)，V-P試驗(yàn)(_)，硝酸鹽還原(_)，淀粉水解 (+)，明膠液化(+)，能發(fā)酵D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇、D-葡萄糖，發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣，苯丙氨酸脫氨酶(_)，檸檬酸鹽利用(+)，卵磷脂酶(_)，吲哚試驗(yàn)(_)，酪素水解(+)，酪氨酸水解(_)。常規(guī)方法提取短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149基因組DNA并做16S rRNA 基因序列測(cè)定，其序列如SEQ ID NO. I所示。經(jīng)BLAST比對(duì)，其與公布的多株短小芽孢桿菌 (Bacillus pumilus)的16S rRNA基因一致度100%，與其它芽孢桿菌一致度為99%以下。 因此，分子鑒定該細(xì)菌為短小芽孢桿菌。參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第九版)所列的方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行常規(guī)的生理和生化鑒定。其與標(biāo)準(zhǔn)株的相似度為100%，屬短小芽孢桿菌，此結(jié)果與分子鑒定的結(jié)果一致。因此該菌屬于短小芽孢桿菌，命名為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149，該菌于2011年11月23日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)CCTCC NO :M2011411。對(duì)短小芽孢桿菌LV149和LV479進(jìn)行了隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA(RAPD)擴(kuò)增，以檢測(cè)二者指紋圖譜的差別。由圖2可見(jiàn)，采用的7條隨機(jī)引物均能給出二株短小芽孢桿菌的指紋圖譜，并且每條引物均能顯示出二者明顯的差別，這個(gè)結(jié)果表明短小芽孢桿菌LV149和短小芽孢桿菌LV479雖然屬同一個(gè)種，但是遺傳差異較大，導(dǎo)致其有不同的表型特征。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),本發(fā)明的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149能同時(shí)產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，并且這三種酶具有高的活性。短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) LV149對(duì)哈氏弧菌E385、副溶血弧菌E154、副溶血弧菌E347、副溶血弧菌E346、輪蟲(chóng)弧菌 E231、哈氏弧菌E379、哈氏弧菌E345、弗尼斯弧菌E341、創(chuàng)傷弧菌11758、溶藻弧菌E333、溶藻弧菌A056和溶藻弧菌E066等弧菌具有廣泛的抑制性，且不具有溶血活性。進(jìn)一步的將短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，干燥粉碎制備得到含短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149的短小芽孢桿菌益生菌制劑,用其添加到飼料中飼喂凡納濱對(duì)蝦，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著養(yǎng)殖周期增長(zhǎng)，投喂添加了短小芽孢桿菌益生菌制劑的飼料的實(shí)驗(yàn)組與不添加益生菌制劑的對(duì)照組相比，體重增加逐漸明顯，肝體指數(shù)降低逐漸明顯。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦的平均體重與對(duì)照組相比差異明顯，增加了 11. 7% ;實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦的肝體指數(shù)與對(duì)照組相比差異明顯，降低了 10. 2%;計(jì)算后餌料系數(shù)降低了 12. 1%。由此說(shuō)明，在對(duì)蝦的養(yǎng)殖中使用短小芽孢桿菌益生菌制劑可以明顯地降低餌料系數(shù)，促進(jìn)對(duì)蝦生長(zhǎng)，從而縮短養(yǎng)殖周期，減少養(yǎng)殖成本和風(fēng)險(xiǎn)。短小芽孢桿菌益生菌制劑的使用也明顯改善了對(duì)蝦的商品品質(zhì)，增加了出肉率。此外，這個(gè)結(jié)果結(jié)合溶血實(shí)驗(yàn)也表明短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) LV149具有生物安全性。本發(fā)明將對(duì)蝦分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦投喂添加有短小芽孢桿菌益生菌制劑的商品對(duì)蝦飼料，對(duì)照組則只投喂商品對(duì)蝦飼料。將對(duì)蝦在含哈氏弧菌的水中浸泡24小時(shí)后，正常換水、投喂，觀察對(duì)蝦的攝食表現(xiàn)并統(tǒng)計(jì)死亡率，結(jié)果表明采用添加有短小芽孢桿菌益生菌制劑的飼料喂養(yǎng)對(duì)蝦5天，對(duì)蝦即表現(xiàn)出對(duì)哈氏弧菌具有一定的抵抗力，死亡率低于對(duì)照組；投喂10天、15天后，對(duì)蝦死亡率明顯低于對(duì)照組，投喂20天后，實(shí)驗(yàn)組的對(duì)蝦的死亡率只有5%，由此表明在養(yǎng)殖應(yīng)用中，短小芽孢桿菌 (Bacillus pumilus) LV149可以抑制哈氏弧菌，堅(jiān)持使用短小芽孢桿菌益生菌制劑10天以上，可以大大降低對(duì)蝦弧菌病的患病率，長(zhǎng)期使用基本可以杜絕弧菌病的發(fā)生。因此，本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149在制備抑制弧菌微生態(tài)制劑中的應(yīng)用。所述的弧菌病原為哈氏弧菌E385、副溶血弧菌E154、副溶血弧菌E347、副溶血弧菌E346、輪蟲(chóng)弧菌E231、哈氏弧菌E379、哈氏弧菌E345、弗尼斯弧菌E341、創(chuàng)傷弧菌11758、 溶藻弧菌E333、溶藻弧菌A056和溶藻弧菌E066。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種短小芽孢桿菌益生菌制劑，其特征在于，以短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149作為活性成份。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種短小芽孢桿菌益生菌制劑的制備方法，其特征在于，以短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149作為發(fā)酵菌株，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵，烘干粉碎后而制得。所述的短小芽孢桿菌益生菌制劑的制備方法，其優(yōu)選具體步驟為將短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) LV149接種到LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)制成種子培養(yǎng)液，再以5% 10%的接種量接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵時(shí)間為20 48小時(shí)，發(fā)酵溫度為30°C，發(fā)酵物于烘箱中50°C烘干，烘干物粉碎過(guò)60目篩，即為短小芽孢桿菌益生菌制劑，所述的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基由料和水組成，所述的料按總質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%計(jì)，包括米糠5 20%、麩皮10 30%、 豆柏20 40%、玉米粉20 40%、脫脂奶粉I 5%、蔗糖I 5%、酵母提取物0. I 2%,NaCl 0. I 1%和飼用多礦0. I 0.5% (廣州國(guó)信飼料科技有限公司，產(chǎn)品名稱為 江豐多礦，貨號(hào)為JC1000)，料水比為I : I I. 3。本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供短小芽孢桿菌益生菌制劑作為飼料添加劑的應(yīng)用。將本發(fā)明的短小芽孢桿菌益生菌制劑與對(duì)蝦成品飼料按重量比0. I 1%的比例混合均勻， 吸附10 60分鐘，即可投喂對(duì)蝦，不僅可以抑制對(duì)蝦腸道病原弧菌生長(zhǎng)、減少對(duì)蝦弧菌病的發(fā)生，同時(shí)促進(jìn)對(duì)蝦生長(zhǎng)、降低餌料系數(shù)、提高商品品質(zhì)、縮短養(yǎng)殖周期，從而減少養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)、降低養(yǎng)殖成本，且生物安全性高。所述的飼料優(yōu)選為對(duì)蝦飼料，進(jìn)一步優(yōu)選短小芽孢桿菌益生菌制劑按對(duì)蝦飼料重量的0. I 1%添加。綜上所述,本發(fā)明的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149對(duì)弧菌具有廣泛的抑制性，且不具有溶血活性。以此菌作為發(fā)酵菌株，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵、干燥粉碎制得以短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149作為活性成分的短小芽孢桿菌益生菌制劑，將其添加到對(duì)蝦飼料中，飼喂對(duì)蝦，不僅可以起到抑制對(duì)蝦腸道病原弧菌生長(zhǎng)、減少對(duì)蝦弧菌病的發(fā)生， 同時(shí)促進(jìn)對(duì)蝦生長(zhǎng)、降低餌料系數(shù)、提高商品品質(zhì)、縮短養(yǎng)殖周期，從而減少養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)、降低養(yǎng)殖成本，且生物安全性高，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有廣泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149于2011年11月23日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)CCTCC NO:M2011411。


圖I是短小芽孢桿菌LV149三種酶活性檢測(cè)圖，其中I :淀粉酶活性；2 :脂肪酶活性；3 :蛋白酶活性；圖2是短小芽孢桿菌LV149與短小芽孢桿菌LV479的RAPD分子指紋圖譜比較。其中1，3，5，7，9，11，13分別為上海生工隨機(jī)引物39，S10, Sll, S12，S13，S14，S15對(duì)短小芽孢桿菌LV149的RAH)擴(kuò)增結(jié)果；2，4，6，8，10，12，14分別為上海生工隨機(jī)引物59，510，511， S12，S13，S14，S15 對(duì)短小芽孢桿菌 LV479 的 RAI3D 擴(kuò)增結(jié)果;M，DNA 分子 Marker DL 15000 ；圖3是短小芽孢桿菌抑弧菌活性典型檢測(cè)圖。其中(I):短小芽孢桿菌LV448(指示菌)；(2):短小芽孢桿菌LV149 ;圖4是短小芽孢桿菌LV149與對(duì)照細(xì)菌溶藻弧菌A056的溶血性檢測(cè)圖，其中(I) 短小芽孢桿菌LV149 ； (2):溶藻弧菌A056 (指示菌)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。所用方法及技術(shù)， 如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法和技術(shù)。實(shí)施例I :短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149的篩選與分離(I)腸道粘附細(xì)菌分離分別于不同時(shí)間和不同市場(chǎng)購(gòu)得健康凡納濱對(duì)蝦5批，每批30尾，從中挑取個(gè)體大、體色亮、光滑、無(wú)損傷、肝臟褐色的個(gè)體5尾，平均體長(zhǎng)12cm。用體積分?jǐn)?shù)75%的酒精消毒對(duì)蝦體表，再用無(wú)菌海水沖洗，解剖后取其腸道于無(wú)菌錫箔紙上，用注射器吸取滅菌海水，迅速?zèng)_洗掉腸道內(nèi)的糞便，每條腸道沖洗2-3次，以肉眼觀察腸道內(nèi)不殘留內(nèi)容物為止。于無(wú)菌勻漿器中加無(wú)菌生理鹽水將腸道勻漿。取0.5mL勻漿液用無(wú)菌生理鹽水(1% NaCl)按10倍系列稀釋即為腸道粘附細(xì)菌懸液。將腸道粘附細(xì)菌懸液涂布對(duì)蝦飼料培養(yǎng)基。對(duì)蝦飼料培養(yǎng)基成分按總質(zhì)量分?jǐn)?shù) 100%計(jì)，包括對(duì)蝦飼料打碎粉(過(guò)100目篩)10%，NaCl 1%，瓊脂2%，其余為水，然后再滅菌倒平板。30°C培養(yǎng)24 48小時(shí)后，挑取菌落，進(jìn)一步在LB培養(yǎng)基進(jìn)行劃線分離和純化?？傆?jì)獲得對(duì)蝦腸道粘附細(xì)菌500株。(2)三種酶活性腸道粘附細(xì)菌篩選按常規(guī)方法檢測(cè)腸道粘附細(xì)菌的蛋白酶活性、脂肪酶活性、淀粉酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn) 500株細(xì)菌中能同時(shí)產(chǎn)生三種胞外酶的菌株共有90株。(3)高酶活性腸道粘附細(xì)菌中篩選抑菌活性株采用平板濾紙片擴(kuò)散法對(duì)上述獲得的高酶活性腸道粘附細(xì)菌進(jìn)行篩選，目的是獲得具有抑制水產(chǎn)動(dòng)物病原弧菌能力且高酶活性的菌株。所用培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，指示菌為溶藻弧菌A056、哈氏弧菌E385、副溶血弧菌E154。受試菌與指示菌均事先用LB培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)。將指示菌液采用滅菌1% NaCl適當(dāng)稀釋后涂布LB平板，LB平板上帖濾紙片，直徑 5mm，每個(gè)濾紙片滴加受試菌液20ii L，30°C培養(yǎng)12-24小時(shí)，觀察抑菌圈的出現(xiàn)，并測(cè)量抑菌圈的直徑。結(jié)果表明90株具有高酶活性腸道粘附細(xì)菌中只有一株細(xì)菌LV149同時(shí)對(duì)三種弧菌具有抑制作用。(4)高酶活性腸道粘附細(xì)菌分子鑒定和生化鑒定從90株具酶活性的細(xì)菌中挑選生長(zhǎng)較快、易于培養(yǎng)的69株細(xì)菌進(jìn)行了基于 16S rRNA 基因的分子鑒定。PCR 擴(kuò)增引物27F :5' -AGAGTT TGATC(C/A) TGG CTCAG-3'； 1492R:5' -TACGG(C/T)TAC CTT GTT ACG ACT T-3'。陽(yáng)性擴(kuò)增片段直接遞交 Invitrogen 公司純化、測(cè)序。結(jié)果表明它們分別屬于不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、芽孢桿菌屬 (Bacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)、利斯頓氏菌屬(Listonella)和莫拉氏菌屬(Moraxella)。其中數(shù)量最多是芽胞桿菌屬，占鑒定細(xì)菌總數(shù)的53. 62%。細(xì)菌LV149的16S rRNA基因序列，其序列如SEQ ID NO. I所示。經(jīng)BLAST比對(duì)， 其與公布的多株短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的16S rRNA基因一致度100%，與其它芽孢桿菌一致度為99%以下。因此，分子鑒定該細(xì)菌為短小芽孢桿菌。參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第九版)所列的方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行常規(guī)的生理和生化鑒定。其與標(biāo)準(zhǔn)株的相似度為100%，屬短小芽孢桿菌，此結(jié)果與分子鑒定的結(jié)果一致。因此該菌屬于短小芽孢桿菌， 命名為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149，于2011年11月23日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)=CCTCC NO :M2011411。盡管69株高酶活性腸道粘附細(xì)菌中有芽孢桿菌占多數(shù)，其中包括其它短小芽孢桿菌株，但只有一株短小芽孢桿菌LV149對(duì)三種弧菌有明顯抑制作用。這表明在對(duì)腸道中， 具有高酶活性且具有抑制弧菌的芽孢桿菌株出現(xiàn)的比率非常低。短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149的三種胞外酶均具有高的活性,三種酶活檢測(cè)圖見(jiàn)圖I。(5)短小芽孢桿菌LV149的分子指紋圖譜特征采用上海生工的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)隨機(jī)引物S9-S15分別對(duì)短小芽孢桿菌LV149和LV479進(jìn)行了 RAPD擴(kuò)增，以檢測(cè)二者指紋圖譜的差別。RAPD擴(kuò)增程序93°C預(yù)變性 2min ；93°C lmin,36°C lmin,72°C 7min，共進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸 7min。RAPD 產(chǎn)物以0. 8 %的瓊脂糖電泳30min，紫外成像，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，采用的7條隨機(jī)引物均能給出二株短小芽孢桿菌的指紋圖譜，并且每條引物均能顯示出二者明顯的差別，這個(gè)結(jié)果表明LV149和LV479雖然屬同一個(gè)種，但是遺傳差異較大，導(dǎo)致其有不同的表型特征。 短小芽孢桿菌的RAPD指紋圖譜可用于區(qū)分同種類(lèi)的不同株，因此一定程度上可以防偽，并防止非法的產(chǎn)品剽竊。實(shí)施例2 :短小芽孢桿菌LV149的抑制弧菌譜分析及溶血性分析采用來(lái)自9個(gè)不同種的13株弧菌對(duì)短小芽孢桿菌LV149的抑制弧菌譜進(jìn)行了分析。同樣采用上述的平板濾紙片擴(kuò)散法。根據(jù)抑菌圈的大小判定抑菌能力的強(qiáng)弱，抑菌譜分析結(jié)果見(jiàn)表I :表I :短小芽孢桿菌LV149的抑制弧菌活性分析
權(quán)利要求
1.短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)LV149，保藏編號(hào)CCTCC NO M2011411o
2.權(quán)利要求I所述的短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus) LV149在制備抑制弧菌微生態(tài)制劑中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的弧菌為哈氏弧菌E385、副溶血弧菌 E154、副溶血弧菌E347、副溶血弧菌E346、輪蟲(chóng)弧菌E231、哈氏弧菌E379、哈氏弧菌E345、弗尼斯弧菌E341、創(chuàng)傷弧菌11758、溶藻弧菌E333、溶藻弧菌A056或溶藻弧菌E066。
4.一種短小芽孢桿菌益生菌制劑，其特征在于，以權(quán)利要求I所述的短小芽孢桿菌 (Bacillus pumilus)LV149 作為活性成份。
5.一種權(quán)利要求4所述的短小芽孢桿菌益生菌制劑的制備方法，其特征在于，以短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149作為發(fā)酵菌株，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵，烘干粉碎后而制得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，具體步驟為將短小芽孢桿菌 (Bacillus pumilus)LV149接種到LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)制成種子培養(yǎng)液，再以5% 10%的接種量接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵時(shí)間為20 48小時(shí)，發(fā)酵溫度為30°C，發(fā)酵物于烘箱中50°C烘干，烘干物粉碎過(guò)60目篩，即為短小芽孢桿菌益生菌制劑，所述的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基由料和水組成，所述的料按總質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%計(jì)，包括米糠5 20%、麩皮10 30%、豆柏20 40%、玉米粉20 40%、脫脂奶粉I 5%、蔗糖I 5%、酵母提取物O. I 2%、 NaCl O. I 1%和飼用多礦O. I O. 5%，料水比為I : I L 3。
7.權(quán)利要求4所述的短小芽孢桿菌益生菌制劑作為飼料添加劑應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的飼料為對(duì)蝦飼料。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，短小芽孢桿菌益生菌制劑按對(duì)蝦飼料重量的O. I 1%添加。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種短小芽孢桿菌、益生菌制劑及其制備方法和應(yīng)用。短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149于2011年11月23日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)CCTCC NOM2011411。本發(fā)明的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149具有強(qiáng)的胞外蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，對(duì)弧菌具有廣泛的抑制性，且不具有溶血活性。以此菌作為發(fā)酵菌株，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵、干燥粉碎制得以短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149作為活性成分的短小芽孢桿菌益生菌制劑，將其添加到對(duì)蝦飼料中，飼喂對(duì)蝦，不僅可以起到抑制對(duì)蝦腸道病原弧菌生長(zhǎng)、減少對(duì)蝦弧菌病的發(fā)生，同時(shí)促進(jìn)對(duì)蝦生長(zhǎng)、降低餌料系數(shù)、提高商品品質(zhì)、縮短養(yǎng)殖周期，從而減少養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)、降低養(yǎng)殖成本，且生物安全性高，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A23K1/16GK102586144SQ20121002920
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月9日
發(fā)明者任春華, 江海英, 王艷紅, 羅鵬, 胡超群 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所