專利名稱：控制水稻穗大小基因、其突變體及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及控制水稻穗大小基因SSPl (Small and Sheathed Panicle I)和突變體sspl基因，以及它們?cè)谡{(diào)控植物株高、葉夾角和穗型等方面的作用機(jī)理。本發(fā)明還涉及控制水稻穗大小基因SSPl和突變體sspl基因在降低株高提高抗倒能力、減小葉夾角提高光合效率、改變赤霉素響應(yīng)抑制種子穗發(fā)芽等育種方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
“農(nóng)以種為先”，提高產(chǎn)量一直是作物遺傳育種研究的主要目標(biāo)。水稻株型由株高、分蘗數(shù)目、分蘗角度葉片夾角以及穗型等構(gòu)成，也是影響水稻產(chǎn)量的重要因素之一。上世紀(jì)60年代以株型改良為特征的矮化育種使得小麥和水稻的產(chǎn)量大幅度提高，而水稻“綠色革命”就是利用了半矮桿sdl基因。SDl編碼赤霉素(Gibberellin，GA)合成基因，其突變使得水稻體內(nèi)有活性的赤霉素含量下降，導(dǎo)致株高降低，提高植株抗倒伏能力，進(jìn)而提高產(chǎn)量。目前研究表明，赤霉素促進(jìn)植物生長發(fā)育是通過降解DELLA蛋白而實(shí)現(xiàn)的。在植物體內(nèi)，GA首先與赤霉素受體GIDl蛋白結(jié)合，活化的GA-GIDl能與DELLA蛋白相結(jié)合，促進(jìn)GID1-GA-DELLA復(fù)合體與GID2 (F-Box)蛋白結(jié)合，被泛素化后的DELLA蛋白經(jīng)由26S蛋白酶解途徑降解，解除了 DELLA蛋白的阻遏作用來促進(jìn)植物生長的(Jiang and Fu，2007)。小麥的“綠色革·命”基因是赤霉素信號(hào)途徑的關(guān)鍵元件一DELLA蛋白。目前在黃淮海平原大部分小麥新品種單產(chǎn)可達(dá)500公斤/畝，部分品種具有超過600公斤/畝產(chǎn)量的潛力。但在全國范圍的大面積生產(chǎn)中，小麥的平均單產(chǎn)遠(yuǎn)低于350公斤/畝。據(jù)統(tǒng)計(jì)近30年來，小麥產(chǎn)量提高速度緩慢，平均年增長僅為0.7%左右。而根據(jù)預(yù)測(cè)，到2020年，我國小麥單產(chǎn)平均年增加2%以上才能基本滿足需求。因此，要實(shí)現(xiàn)小麥自給，必須進(jìn)一步提高小麥產(chǎn)量潛力，培育出高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的小麥新品種。同樣，水稻的產(chǎn)量自上世紀(jì)60年代水稻“綠色革命”即矮化育種使得中國水稻單產(chǎn)比原有高桿品種提高20-30%。70年代成功采用以雜種優(yōu)勢(shì)利用為手段的雜交稻育種，使水稻單產(chǎn)在矮桿品種的基礎(chǔ)上再增產(chǎn)20%左右，實(shí)現(xiàn)水稻產(chǎn)量上的飛躍，為解決我國13億人口的吃飯問題做出了巨大貢獻(xiàn)。然而，目前水稻生產(chǎn)中所應(yīng)用的矮桿基因都是sdl，來源相當(dāng)狹窄。矮桿基因利用單一化以及矮桿基因遺傳隱性化，導(dǎo)致了水稻品種遺傳背景單一和狹窄，影響了水稻品種特別是雜交水稻組合的產(chǎn)量潛力進(jìn)一步挖掘和提高。所以發(fā)掘和利用新型矮桿基因十分重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及控制水稻穗大小基因SSPl基因和突變體sspl基因，以及它們?cè)谡{(diào)控植物株高、葉夾角和穗型等方面的作用及其作用機(jī)制。本發(fā)明還涉及控制水稻穗大小基因SSPl和突變體sspl在植株半矮化提高抗倒能力、減小葉夾角提高光合效率、改變赤霉素響應(yīng)抑制種子穗發(fā)芽等育種方面的應(yīng)用。本發(fā)明人在中國水稻所收集的水稻資源材料中發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)材料具有植株矮化、包穗等表型，通過遺傳雜交，確定這個(gè)性狀是受一個(gè)顯性基因控制的。進(jìn)一步遺傳回交，構(gòu)建了近等基因系，對(duì)近等基因系的比較分析發(fā)現(xiàn)，該基因除了控制株高外(降低株高對(duì)農(nóng)作物抗倒伏，利于農(nóng)作物密植增產(chǎn))，還控制水稻的劍葉和葉夾角的大小，劍葉變短、葉夾角也變小的性狀對(duì)提高作物光合效率很重要，控制水稻的穗部性狀(包穗且穗也變小)。根據(jù)穗部的突出表型，本發(fā)明人將這個(gè)突變體命名為水稻穗型突變體sspl (Small andSheathed Panicle I)。sspl穗部性狀不是農(nóng)業(yè)直接應(yīng)用的優(yōu)良性狀，但是它的株型和葉型性狀對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)非常有利:1)，降低株高，可提高農(nóng)作物的抗倒伏能力；2)，株型緊湊，可密植；3)，葉片深綠色，本身光合效率較高；4)，葉夾角變小，可提高群體光合效率；5)，改變赤霉素應(yīng)答反應(yīng)，可用于抑制種子穗發(fā)芽遺傳改良。本發(fā)明人的研究工作正是針對(duì)上述五個(gè)優(yōu)良性狀開展的。產(chǎn)量是由復(fù)雜數(shù)量性狀位點(diǎn)QTL(Quantitative Trait Loci)和環(huán)境互作所控制，并最終通過調(diào)節(jié)單位面積的穗粒數(shù)和粒重來影響產(chǎn)量。穗型(包括穗長、枝梗數(shù)、穗粒數(shù)、籽粒大小和結(jié)實(shí)率等)是影響水稻產(chǎn)量的重要因素之一，而株高和葉片夾角對(duì)提高水稻種植密度、提高光能轉(zhuǎn)換效率和耐肥抗倒性以及提高產(chǎn)量非常重要。水稻穗型突變體sspl表現(xiàn)為植株半矮化和葉片直立等特征，屬典型的nl類矮化類型。為了弄清該突變體矮化株型的遺傳控制基礎(chǔ)，我們利用圖位克隆的方法，克隆了SSPl基因(Small and Sheathed Panicle I)。該基因編碼一個(gè)GRAS蛋白，它與水稻SLRl蛋白(水稻中的DELLA蛋白)C端氨基酸序列有較高的相似性。突變的sspl是由2個(gè)氨基酸置換突變?cè)斐傻?參見SEQ ID NO:4)。SSPl基因幾乎在水稻不同發(fā)育階段的各個(gè)器官和組織部位都有表達(dá)，尤其在穗部和穗下節(jié)的居間分生組織中表達(dá)量最高。轉(zhuǎn)基因水稻植株中SSPl-GFP融合蛋白定位于細(xì)胞核中。赤霉素誘導(dǎo)糊粉層細(xì)胞α -淀粉酶活性實(shí)驗(yàn)表明突變的sspl蛋白能抑制赤霉素應(yīng)答反應(yīng)，表明sspl參與GA信 號(hào)傳導(dǎo)過程，是赤霉素信號(hào)傳導(dǎo)中的一個(gè)關(guān)鍵元件。進(jìn)一步的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,突變的sspl和野生的SSPl蛋白均不能與赤霉素受體GIDl蛋白相互作用，這說明sspl/SSPl是一個(gè)參與赤霉素信號(hào)途徑但不依賴于GIDl功能的新的負(fù)調(diào)控因子。sspl和SSPl蛋白也不能與參與DELLA蛋白降解的F-Box蛋白(GID2)和U-Box蛋白互作，說明sspl/SSPl蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控機(jī)制與DELLA蛋白SLRl的降解途徑不同。另外，比較氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，SSPl蛋白與另外一個(gè)參與油菜素內(nèi)酯(BR)的調(diào)控因子DLT相似性較高。當(dāng)利用外源油菜素內(nèi)酯BR處理sspl突變體時(shí)，sspl突變體的第二葉鞘長度和葉夾角能夠恢復(fù)到野生型對(duì)照植株接近的水平。在sspl突變體背景下，DLT表達(dá)量被明顯上調(diào)，而另外一個(gè)油菜素內(nèi)酯信號(hào)途徑的關(guān)鍵基因BUl表達(dá)量略有下調(diào)。這表明SSPl基因也參與調(diào)控油菜素內(nèi)酯的應(yīng)答反應(yīng)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，SSPl可能既參與赤霉素信號(hào)傳導(dǎo)，又參與油菜素內(nèi)酯信號(hào)傳導(dǎo)，是兩激素互作的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控元件。具體地，本發(fā)明包括下述方面:1.鑒定了水稻穗型突變體sspl的表型。水稻sspl突變體表現(xiàn)為包穗(抽穗不完全)、葉片直立，是一個(gè)赤霉素不敏感的半矮桿突變體。遺傳分析表明，植株矮化(抽穗不完全)是受一對(duì)顯性基因控制的。樹脂切片實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，sspl突變體倒一節(jié)莖桿的細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞伸長都受到明顯抑制，表明sspl抑制莖桿的細(xì)胞分裂和細(xì)胞伸長；同時(shí)，sspl突變體葉夾角明顯變小，外源施加油菜素內(nèi)酯能使葉夾角表型恢復(fù)到野生型水平，這說明，SSPl基因參與油菜素內(nèi)酯的應(yīng)答反應(yīng)。2.克隆了 SSPl基因。sspl突變體分別與南京6號(hào)(NJ6，一種秈稻)和中花11號(hào)(ZH11，一種粳稻)雜交，構(gòu)建了 SSPl基因的粗(精細(xì))定位群體。通過圖位克隆方法，獲得了 SSPl候選基因。SSPl基因編碼一個(gè)GRAS蛋白，其C端與水稻DELLA蛋白SLRl具有較高的序列保守性。獲得候選基因后，通過以下實(shí)驗(yàn)對(duì)該候選基因進(jìn)行了互補(bǔ)驗(yàn)證:a.遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn):構(gòu)建自身啟動(dòng)子+sspl cDNA+3’UTR的載體(pSSPl: sspl-3’UTR)并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到日本晴(一種粳稻)中，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為sspl突變體的表型，具體為:株高變矮、倒一節(jié)明顯縮短、葉夾角變小和對(duì)外源赤霉素處理不敏感；b.過量表達(dá)實(shí)驗(yàn):構(gòu)建過表達(dá)載體p35S: sspl,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到日本晴中。表型分析發(fā)現(xiàn),過量表達(dá)sspl的轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)更為明顯的矮化，且矮化程度與該基因表達(dá)水平呈正相關(guān)。通過以上實(shí)驗(yàn)確定了該候選基因是目的基因。3.獲得了近等基因系NIL-sspl和NIL-SSP1。構(gòu)建粳稻(日本晴)和秈稻(南京6號(hào))兩個(gè)不同遺傳背景的近等基因系:NIL-sspl和NIL-SSPl。遺傳分析表明，sspl基因在秈稻和粳稻中均表現(xiàn)為顯性遺傳。4.SSPl/sspl基因表達(dá)分析。利用RT-PCR方法分析了 SSPl基因在各個(gè)發(fā)育階段和不同組織器官中的表達(dá)情況，包括:花、葉、鞘、葉枕、根、穗下莖節(jié)(從下到上0-3cm(居間分生組織區(qū))，3-8cm(伸長區(qū))，8cm以上(成熟區(qū)))等組織。結(jié)果表明，SSPl基因幾乎在水稻不同發(fā)育階段的各個(gè)器官組織部位都有表達(dá)，尤其在穗部和穗下節(jié)的居間分生組織中表達(dá)量最高。同SSPl野生型相比，sspl基因表達(dá)模式和表達(dá)量均沒有明顯的變化。5.SSPl-GFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位分析。構(gòu)建了 p35S:HA-SSPl_GFP載體，轉(zhuǎn)化日本晴，利用共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因植株根部的熒光信號(hào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SSPl-GFP融合蛋白定位于細(xì)胞核中。另外，GA處理并沒有觀察到細(xì)胞核中SSPl-GFP或sspl-GFP融合蛋白量的變化，表明SSPl-GFP融合蛋白穩(wěn)定性不受GA影響。6.SSPl參與赤霉素信`號(hào)途經(jīng)，但不依賴于赤霉素信號(hào)傳導(dǎo)途徑中GIDl和DELLA蛋白的功能。在sspl突變體種子糊粉層細(xì)胞中，GA不能誘導(dǎo)淀粉酶活性；其第二葉鞘的生長也不受GA影響。這些結(jié)果表明，SSPl參與GA信號(hào)傳導(dǎo)過程，是赤霉素信號(hào)途徑中的一個(gè)關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子。雖然，從氨基酸序列比較來看，SSPl蛋白與SLRl蛋白具有較高的同源性，但酵母雙雜交結(jié)果顯示，SSPl和sspl蛋白都不能與赤霉素受體GIDl蛋白互作。這些研究表明SSPl在GA信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起作用，卻是一個(gè)不依賴于GIDl功能的調(diào)控因子。同時(shí)，SSPl/sspl蛋白也不能與參與SLRl蛋白降解的U-BOX和F-BOX(GID2)蛋白互作，表明SSPl/sspl蛋白穩(wěn)定性(蛋白降解途徑)的調(diào)控機(jī)制與SLRl不同。sspl突變體中SLRl蛋白水平?jīng)]有明顯改變，而且GA處理也能導(dǎo)致SLRl蛋白的降解，但sspl突變體矮化表型并沒有改變。這些實(shí)驗(yàn)也表明，sspl基因并不依賴于(或影響)DELLA蛋白的功能。7.過量表達(dá)SSPl基因也能導(dǎo)致植株矮化、葉夾角變小和包穗等性狀。構(gòu)建過表達(dá)載體p35S:SSpl/SSPl，將其轉(zhuǎn)化水稻日本晴。轉(zhuǎn)基因水稻表型分析證實(shí)，過量表達(dá)SSPl也能導(dǎo)致類似sspl突變體的表型，包括株高、葉夾角和包穗等性狀。在基因表達(dá)水平相同時(shí)，過量表達(dá)sspl有更強(qiáng)的矮化表型。8.SSPl基因參與油菜素內(nèi)酯(BR)的應(yīng)答反應(yīng)。在sspl突變體背景下，參與油菜素內(nèi)酯信號(hào)途徑的調(diào)控因子，如:DLT、BU1等基因的表達(dá)量都發(fā)生了變化。DLT基因表達(dá)量得到較為明顯的上調(diào)，而BUl的表達(dá)量略有下調(diào)。當(dāng)外源油菜素內(nèi)酯BR處理sspl突變體后，sspl突變體第二葉鞘長度和葉夾角表型等能恢復(fù)到野生型表型。這些實(shí)驗(yàn)表明，SSPl基因也參與了調(diào)控油菜素內(nèi)酯應(yīng)答反應(yīng)。SSPl既參與了赤霉素信號(hào)傳導(dǎo)，又參與了油菜素內(nèi)酯信號(hào)傳導(dǎo)，是兩大激素互作的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控元件。另外，本發(fā)明人在進(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)，控制水稻穗大小基因SSPl基因在農(nóng)作物中非常保守，通過Blast發(fā)現(xiàn)控制水稻穗大小基因突變體sspl基因在小麥、大麥、玉米、高粱、大豆、棉花、油菜、或擬南芥等植物中的同源基因，可以將它們統(tǒng)稱為控制穗大小基因，這些基因的名稱以及它們的cDNA序列編號(hào)可參見表I。根據(jù)本發(fā)明對(duì)控制水稻穗大小基因SSPl及其突變體sspl基因的研究結(jié)果，可以推測(cè)這些同源基因也具有與控制水稻穗大小基因SSPl及其突變體sspl基因相似的功能。表1:控制水稻穗大小基因突變體sspl基因在其它植物中的同源基因
權(quán)利要求
1.控制水稻穗大小基因突變體sspl基因，其編碼的氨基酸序列為SEQID N0:4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制水稻穗大小基因突變體sspl基因，其核苷酸序列為SEQID NO:3。
3.—種重組載體，其包含權(quán)利要求2所述的控制水稻穗大小基因突變體sspl基因。
4.一種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求3所述的重組載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其為下列植物的細(xì)胞:水稻、小麥、大麥、玉米、高粱、大豆、油菜、棉花、或擬南芥。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其為水稻細(xì)胞。
7.控制水稻穗大小基因突變體sspl基因的應(yīng)用，其用于培育具有植株半矮化提高抗倒伏能力、減小葉夾角提高光合效率、改變赤霉素響應(yīng)抑制種子穗發(fā)芽的優(yōu)點(diǎn)的農(nóng)作物。
8.一種培育植株矮化耐倒伏、改良農(nóng)作物穗型和提高葉片光合效率的農(nóng)作物的方法，其包括通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在所述農(nóng)作物中組織特異性啟動(dòng)子過量表達(dá)控制水稻穗大小基因SSPl基因或其突變體sspl基因的步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述農(nóng)作物包括水稻、小麥、大麥、玉米、高粱、大豆、油菜、棉花、或擬南芥。
10.控制水稻穗大小基因突變體sspl基因在小麥、大麥、玉米、高粱、大豆、棉花、油菜、或擬南芥等植物中的同源基因，它們統(tǒng)稱為控制糖大小基因，其cDNA序列為:小麥 TaSSPl-1ikel (Rht-Ala):SEQ ID NO:5 ；大麥 HvSSPl-1ike·:SEQ ID NO:7 ；玉米 ZmSSPl-1ike:SEQ ID NO:9 ；高粱 SbSSPl-1ike:SEQ ID NO:11 ；大豆 GmSSPl-1ike:SEQ ID NO:13 ；棉花 GhSSPl-1ikel:SEQ ID NO:15 ;棉花 GhSSPl-like2:SEQ ID NO:17 ;油菜 BnSSPl-1ikel:SEQ ID NO:19 ；油菜 BrSSPl-like2:SEQ ID NO:21 ；擬南芥 AtSSPl-1ikel:SEQ ID NO:23 ；擬南芥 AtSSPl-like2:SEQ ID NO:25。
全文摘要
本發(fā)明涉及控制水稻穗大小基因SSP1(Small and Sheathed Panicle 1)及其突變基因ssp1，以及它們?cè)谡{(diào)控植物株高、葉夾角和穗大小等方面的作用機(jī)理，其中來源于控制水稻穗大小基因突變體ssp1基因的序列SEQ IDNO3。本發(fā)明還涉及控制水稻穗大小基因突變體ssp1基因在大麥、小麥、玉米、高粱、大豆、棉花、油菜、或擬南芥等植物中的同源基因，它們統(tǒng)稱為控制穗大小基因。本發(fā)明還涉及SSP1基因和突變體ssp1基因在控制植物株高、提高耐倒伏能力、減小葉夾角提高光合效率、改變赤霉素響應(yīng)抑制穗發(fā)芽等育種方面的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01H5/00GK103243107SQ20121003046
公開日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2012年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月10日
發(fā)明者傅向東, 劉正斌, 劉學(xué)英, 吳昆 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所