專利名稱：一種液泡膜定位序列及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術以及植物學領域；更具體地，本發(fā)明涉及一種液泡膜定位序列及其應用。
背景技術：
細胞是各種生命形式的基本組成單位，形形色色的蛋白質根據其自身的特性有序地分布在細胞的每個分區(qū)中行使相應的生物學功能(Cavalier-Smith，2009)。植物細胞的主要分區(qū)包括質膜和其它內膜系統(tǒng)、細胞核、細胞質以及位于其中的線粒體、葉綠體、高爾基體、內質網、核糖體、過氧化物酶體、液泡等各種細胞器。這些構成細胞的微小結構或分區(qū)統(tǒng)稱為亞細胞結構。在植物細胞中，每個亞細胞結構上都分布著多種具有生物活性的蛋白質。蛋白質亞細胞定位的研究對于系統(tǒng)地理解植物形態(tài)建成、生長發(fā)育以及對環(huán)境的適應等方面都是必不可少的環(huán)節(jié)，不僅已成為功能基因組學的重要研究內容，而且具有生物工程上的實際應用價值。植物中各種蛋白質都是依據其自身基因編碼的氨基酸序列所包含的定位信息，通過各種精確的分子機制定位到細胞特定的亞細胞部位的。人們通過各種定位技術，對各亞細胞結構中蛋白質的分布情況了解的越來越多。質膜和細胞內膜是一個蛋白質種類較多的區(qū)域，膜上的蛋白質主要有載體蛋白、通道蛋白、離子轉運蛋白和蛋白受體等，還分布著一些重要的酶以及某些植物逆境相關蛋白；細胞質中分布著各種代謝活動所需的相關酶類；線粒體是有氧呼吸的主要場所，主要含有與有氧呼吸相關的酶類；葉綠體是植物光合作用的場所，因此也是光合作用所需酶類的主要存在部位；細胞核中也含有種類繁多的蛋白質，包括控制遺傳信息合成、復制、代謝的酶與一些核定位信號相關的蛋白質
坐寸ο液泡是細胞質中由單層膜包圍的充滿水溶液的泡狀結構，是植物細胞中普遍存在并具有多種功能的重要 細胞器(Wink M(1993)The plant vacuole:a multifunctioncompartment.J Exp Bot 44:231-246)。大部分植物細胞沒有液泡就難以存活。植物液泡的形成起源于內質網-高爾基體-反式高爾基網絡等內膜系統(tǒng)，通過生物合成、分泌途徑的運輸以及自體吞噬形成植物細胞特有的中央大液泡(Zouhar J, Rojo E(2009)Plantvacuoles:where did they come from and where are they heading Curr Opin PlantBiol 12:677-684)。隨著細胞生物學與分子生物學研究的深入，人們逐漸認識到液泡不僅僅是簡單的物料儲藏室或者蛋白降解庫，它參與調節(jié)細胞代謝與生長發(fā)育，控制細胞內物質累積和運輸，維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定性，并提高植物適應環(huán)境變化和的生命活力。一般認為蛋白質在內質網上加工后通過分泌與內吞途徑(secretory and endocytic pathways)運輸到液泡內。在分泌途徑的早期，高爾基體的分泌出芽點就已經將定位于液泡中的可溶性蛋白和膜蛋白與即將運送到細胞表面的蛋白質區(qū)分開來。液泡可溶性蛋白需要一類特殊的定位信號(vacuolar sorting determinant, VSD)加以標記，以便離開高爾基體后被相應的分揀受體蛋白VSR或類受體蛋白RMR等受體識別，從而順利地向液泡進行運輸。液泡分揀信號VSD主要包括序列特異性信號(ssVSD)、C-末端定位信號(CtVSD)和結構定位信號(psVSD)這三種類型。它們可以單獨或者共同起作用。例如，在大豆IlS球蛋白中，多種VSD共同決定了它液泡定位的特性。盡管目前人們對蛋白的液泡定位機制有一定的認識，然而目前對于液泡膜上蛋白的亞細胞定位決定因子的研究非常缺乏，國際上也罕有相關報道。液泡膜具有較為復雜的結構，其上的蛋白數量也很多，在擬南芥蛋白質組的研究中鑒定出有195種不同的蛋白整合在液泡膜上(Carter C, Pan S, Zouhar J, Avila EL, Girke T,Raikhel NV(2004)The vegetative vacuole proteome of Arabidopsis thaliana revealspredicted and unexpected proteins.Plant Cell 16:3285-3303)。液泡膜上的蛋白不僅參與膜電位平衡與滲透調節(jié)，還負責運輸儲存營養(yǎng)元素，調控代謝過程并參與細胞的信號轉導。本領域目前尚未有報道表明在植物中分離到決定液泡膜定位的專一性信號序列。因此，迫切需要找到一種液泡膜的專一性信號序列，以填補本領域的空白。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種液泡膜定位序列及其應用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的多肽(液泡膜定位多肽)，其是:(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的多肽；(b)氨基酸序列如SEQ ID NO:3中第I (20-50)位所示的多肽；(c)氨基酸序列如SEQ ID NO:5中第I (20-50)位所示的多肽；(d)將(a)多肽經過一個或多個(如1-5個；較佳地1-4個；更佳地1_3個；更佳地1-2個)氨基酸殘基的取代或添加而形成的，且具有液泡膜定位功能的多肽；(e)將(b)或 (C)多肽經過一個或多個(如1-5個；較佳地1-4個；更佳地1_3個；更佳地1-2個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有液泡膜定位功能的多肽；或(f)與(a)或(b)或(C)多肽的氨基酸序列相同性高于50% (較佳地高于60%;更佳地高于70% ;更佳地高于80% ;更佳地高于90% ;更佳地高于95% ;更佳地高于99% )，且具有液泡膜定位功能的多肽。在一個優(yōu)選例中，(b)中，所述的多肽是氨基酸序列如SEQ ID NO:3中第I (20-28)位(如第1-21位，第1-22位，第1-23位，第1-24位，第1-25位，第1-26位，第1-27位)所示的多肽；或(c)中，所述的多肽是氨基酸序列如SEQ ID NO:5中第I (20-28)位(如第1-21位，第1-22位,第1_23位,第1_24位,第1_25位,第1_26位,第1_27位)所不的多妝。在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的多核苷酸(液泡膜定位核酸)，其編碼所述的多肽。在一個優(yōu)選例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中第I (57-150)位所示的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于引導目的蛋白定位到細胞的液泡膜(即:用于目標蛋白的液泡膜亞細胞定位)。在一個優(yōu)選例中，所述的多肽用于減少或防止目的蛋白表達于細胞的液泡膜以外的其它部位(包括細胞器)。
在本發(fā)明的另一方面，提供一種表達構建物，其中含有所述的多核苷酸。在一個優(yōu)選例中，所述的表達構建物不含有全長的編碼SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:5的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述的表達構建物中，所述的多核苷酸(液泡膜定位核酸)的5'端和/或3'端，還包括多克隆位點(限制性內切酶位點)，用于連接編碼目的蛋白的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述的表達構建物中還含有與所述的多核苷酸操作性連接的編碼目的蛋白的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述的目的蛋白是外源蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的目的蛋白是可溶性蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的目的蛋白是結構蛋白、調控蛋白、轉錄因子等任何需要定位于液泡膜的蛋白(如植物品質、性狀、抗性或代謝相關的蛋白)。在另一優(yōu)選例中，所述的編碼目的蛋白的多核苷酸位于所述的多核苷酸(液泡膜定位核酸)的下游，且與所述的多核苷酸的間隔小于500bp ;優(yōu)選的，小于300bp ;更優(yōu)選的，小于200bp ;更優(yōu)選的，小于IOObp ;更優(yōu)選的，小于50bp ;更優(yōu)選的，小于30bp。在另一優(yōu)選例中，所述的表達構建物是表達載體。在另一優(yōu)選例中，所述編碼目的蛋白的多核苷酸位于所述的多核苷酸(液泡膜定位核酸)的5'端和/或3'端。在本發(fā)明的另一方面，提供一種遺傳工程化的宿主細胞，所述的細胞:含有外源的所述的多核苷酸；或含有所述的表達構建物。在一個優(yōu)選例中，所述的宿主細胞為不能簡單地借助光合作用，以水、二氧化碳和無機鹽等無機物合成碳水化合物、蛋白質來維系生存的細胞。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細胞為非植物繁殖材料。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的表達構建物的用途，用于在細胞的液泡膜上表達目的蛋白。在本發(fā)明的另一方面，提供一種在細胞的液泡膜上表達目的蛋白的方法，包括:(I)提供所述的表達構建物；(2)將(I)的表達構建物轉化細胞。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備轉基因植物的方法，所述植物的細胞的液泡膜上特異表達目的蛋白，所述方法包括:將所述的表達構建物轉入植物中。在一個優(yōu)選例中，通過農桿菌轉化的方法將所述的表達構建物轉入植物中。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1、擬南芥CBL2與CBL3蛋白的亞細胞定位。(A) CBL2與CBL3在擬南芥原生質體中的亞細胞定位；(B)轉基因擬南芥植株35S:CBL2_YFP的亞細胞定位；
(C)轉基因擬南芥植株35S:CBL3_YFP的亞細胞定位(Bar = 10 μ m)。圖2、CBL2的N端前16個氨基酸是其亞細胞定位所必需的。圖3、CBL2的N端前19個氨基酸(TTS序列)能夠決定蛋白的液泡膜定位。圖4、TTS序列在融合蛋白中的位置不影響其決定的液泡膜亞細胞定位。圖5、TTS序列引導目標蛋白(CBL5，CIPK14，eIF4A，SND2)定位于植物細胞液泡膜應用實例。
具體實施例方式本發(fā)明人致力于細胞或組織專一性信號序列的研究，經過廣泛的研究，分離到一段細胞液泡膜專一'I"生定位的信號序列(1noplast Targeting Sequence, TTS),該序列可引導蛋白精確高效地定位于細胞內液泡膜上。利用該序列可進行目的蛋白的定位改造，減少或阻止目的蛋白表達于液泡膜以外的其它部位(包括液泡膜以外的其它細胞器)。術語所述的“氨基酸”為同時含有一個或多個氨基和羧基的脂肪族有機酸，其根據氨基和羧基的位置，有α氨基酸和β氨基酸等類型。氨基酸是構成蛋白質的基本單位，賦予蛋白質特定的分子結構形態(tài)，使它的分子具有生化活性。參與蛋白質合成的常見氨基酸是20種L-α -氨基酸。如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷 酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。所述的“液泡”包括植物細胞中的各種類型液泡，如中央大液泡、水解液泡、儲藏液泡、囊泡狀小液泡等。植物“液泡”也涵蓋不同細胞類型與植物不同發(fā)育時期中的各種液泡。所述的“液泡膜”是指細胞質與液泡相隔的界面上存在的一層生物膜。它的組成和特性與細胞的質膜相同，主要由蛋白質和磷脂組成，其中磷脂形成磷脂雙分子層，是膜的基本骨架，蛋白質分子以各種方式分布于其中，在功能上具有選擇透過性。這里的液泡膜包括植物細胞中所有類型的液泡外層的生物膜。本發(fā)明中，所述的“植物(或作物)”沒有特別的限制，只要其適合進行基因的轉化操作，如各種農作物、花卉植物、或林業(yè)植物等。所述的植物比如可以是(不限于):雙子葉植物、單子葉植物、或裸子植物。更具體地，所述的植物包括(但不限于):小麥、大麥、黑麥、水稻、玉米、高梁、甜菜、蘋果、梨、李、桃、杏、櫻桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罌粟、齊墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫蘆、黃瓜、西瓜、棉花、亞麻、大麻、黃麻、柑桔、梓檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、蘆笑、洋白菜、大白菜、小白菜、胡蘿卜、洋蔥、土豆、西紅柿、青椒、鱷梨、桂皮、樟腦、煙葉、堅果、咖啡、茄子、甘蔗、茶葉、胡椒、葡萄樹、蠔麻草、香蕉、天然橡膠樹和觀賞植物等。作為一種優(yōu)選方式，所述的“植物”包括但不限于:十字花科、禾本科、薔薇科。比如，所述的“植物”包括但不限于:十字花科蕓薹屬的大白菜、小白菜，十字花科鼠耳芥屬植物如擬南芥，禾本科的水稻、小麥、玉米等，此外還包括煙草、瓜果、蔬菜、油菜等等。如本文所用，所述的“目的蛋白”是指生物工程操作中的對象蛋白，包括任何可由本發(fā)明的液泡膜定位蛋白引導表達于液泡膜的蛋白。只要能夠與所述的液泡膜定位蛋白相融合、結合或偶聯(lián)的蛋白均可作為目的蛋白。例如，所述的目的蛋白包括但不限于:改良植物品質、性狀、抗性或代謝相關的基因。較佳地，所述的目的蛋白是可溶性蛋白。所述的目的蛋白本身也可以是一種融合蛋白。所述的“可溶性蛋白”指可以以小分子狀態(tài)溶于水或其他溶劑的蛋白，這里也代表生物體內具有生物活性的親水性蛋白。如本文所用，“外源的”或“異源的”是指來自不同來源的兩條或多條核酸或蛋白質序列之間的關系。例如，如果TTS序列與目的蛋白序列的組合通常不是天然存在的，則TTS序列對于該目的基因來說是外源的。特定序列對于其所插入的細胞或生物體來說是“外源的”。如本文所用，術語“專一性定位”、“專一性表達”、“特異性定位”、“特異性表達”是指目的蛋白在特定的細胞器(如液泡膜)上表達。通常，如果在某組織或器官(如液泡膜)中蛋白量比在其它組織或器官中高至少5倍，優(yōu)選至少高10倍，更優(yōu)選至少高100倍，最優(yōu)選至少高1000倍，則該蛋白被認為是組織或器官專一性定位的。液泡膜定位多肽(TTS)本發(fā)明提供一種液泡膜定位多肽，其是:(a)氨基酸序列如 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO:2 (MSQCIDGFKHVCSS FFRCF，如圖 2下圖CBL3前19位)所 示的多肽；(b)氨基酸序列如SEQ ID NO:3中第I (20-50)位所示的多肽；(c)氨基酸序列如SEQ ID NO:5中第I (20-50)位所示的多肽。其中，氨基酸序列如SEQ ID NO:3(或SEQ ID NO:5)中第I (20-50)位指定了一系列的序列，所述序列起始于SEQ ID N0:3(或SEQ ID NO:5)中第I位，終止于SEQ IDNO:3(或SEQ ID NO:5)中第20位至第50位中的任一位的氨基酸。本發(fā)明的TTS多肽(蛋白)可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選的是重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還包括TTS的衍生物和類似物(如TTS的保守性變異多肽)。如本文所用，術語“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的TTS相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據本文的定義這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。TTS的衍生物和類似物包括(但并不限于):若干個(通常為1-5個，較佳地1-4個，更佳地1-3個，最佳地1-2個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一個或數個(如50個以內，較佳地為30個以內，較佳地為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或減少一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。氨基酸的取代或替換最好根據表I進行。表I
權利要求
1.一種分離的多肽，其是 (a)氨基酸序列如SEQID NO :1或SEQ ID NO : 2所示的多肽； (b)氨基酸序列如SEQID NO :3中第I (20-50)位所示的多肽； (c)氨基酸序列如SEQID NO 5中第I (20-50)位所不的多妝； (d)將(a)多肽經過一個或多個氨基酸殘基的取代或添加而形成的，且具有液泡膜定位功能的多肽； (e)將(b)或(C)多肽經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有液泡膜定位功能的多肽；或 (f)與(a)或(b)或(C)多肽的氨基酸序列相同性高于50%，且具有液泡膜定位功能的多肽。
2.如權利要求I所述的多肽，其特征在于，(b)中，所述的多肽是氨基酸序列如SEQIDNO :3中第I (20-28)位所示的多肽；或 (c)中，所述的多肽是氨基酸序列如SEQ ID NO :5中第I (20-28)位所示的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其編碼權利要求I或2所述的多肽。
4.權利要求1-2任一所述的多肽的用途，用于引導目的蛋白定位到細胞的液泡膜。
5.—種表達構建物,其中含有權利要求3所述的多核苷酸。
6.如權利要求5所述的表達構建物，其特征在于，其中還含有與權利要求3所述的多核苷酸操作性連接的編碼目的蛋白的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，所述的細胞 含有外源的權利要求3所述的多核苷酸；或 含有權利要求5-6任一所述的表達構建物。
8.權利要求5或6所述的表達構建物的用途，用于在細胞的液泡膜上表達目的蛋白。
9.一種在細胞的液泡膜上表達目的蛋白的方法，包括 (1)提供權利要求6所述的表達構建物； (2)將(I)的表達構建物轉化細胞。
10.一種制備轉基因植物的方法，所述植物的細胞的液泡膜上特異表達目的蛋白，所述方法包括將權利要求6所述的表達構建物轉入植物中。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種液泡膜定位序列及其應用。本發(fā)明人首次分離到一段細胞液泡膜專一性定位的信號序列(Tonoplast Targeting Sequence，TTS)，該序列可引導蛋白精確高效地定位于細胞內液泡膜上。利用該序列可進行目的蛋白的定位改造，減少或阻止目的蛋白表達于液泡膜以外的其它部位。
文檔編號A01H5/00GK103254293SQ20121003434
公開日2013年8月21日 申請日期2012年2月15日 優(yōu)先權日2012年2月15日
發(fā)明者張洪霞, 唐仁杰 申請人:中國科學院上海生命科學研究院