專利名稱：鈉通道調(diào)制劑BmK I的新應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鈉通道調(diào)制劑BmK I的新應(yīng)用。
背景技術(shù)：
電壓門控鈉離子通道(Voltage Gates of Sodium Channels, VGSCs)在神經(jīng)元和其他可興奮細(xì)胞動作電位形成和傳導(dǎo)過程中有非常重要的作用。目前，鈉離子通道的研究主要還是依賴于之前的一部分知識積累，這些信息能夠提供對于鈉通道功能重要性以及可興奮細(xì)胞的功能紊亂等的的更深理解。以及鈉通道呈現(xiàn)出的亞型多樣性，為理解鈉通道在生理 /病理下的功能特性及其動態(tài)平衡調(diào)控帶來了復(fù)雜性，同時，也正在引發(fā)通道藥理與毒理基因組學(xué)研究的挑戰(zhàn)性。由于鈉通道在細(xì)胞興奮性中的基礎(chǔ)性作用，它的任何改變都將對機體的生理功能造成復(fù)雜的影響。Navl. UNavl. 2,Navl. 3和Navl. 6的改變將會導(dǎo)致眾多神經(jīng)系統(tǒng)性疾病的產(chǎn)生。電壓門控鈉通道生理學(xué)特性的改變被認(rèn)為是導(dǎo)致癲癇、疼痛、先天性肌肉強直癥等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要因素，一直是研究的熱點。目前臨床上癲癇、神經(jīng)病理性痛等的治療藥物通常以鈉通道為靶器，但由于其選擇性不高，可能產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。因此，開拓對不同通道亞型具有特異選擇性作用的配體/調(diào)制劑并解析新型通道亞型的基因編碼特征，不僅有利于各亞型生理功能的闡明與藥理價值的評估，同時也為鈉通道關(guān)聯(lián)的臨床疾病治療藥物研制提供理論的可行性和新分子先導(dǎo)物。帕金森病(Parkinson’ s disease, PD)是常見的一種以運動障礙為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病，帕金森病的主要病理改變?yōu)檫M行性的中腦黑質(zhì)致密部(substantia nigra pars compacta, SNc)多巴胺能神經(jīng)元的喪失以及由此而產(chǎn)生的多巴胺衰竭。造成帕金森病運動障礙可能與黑質(zhì)-紋狀體環(huán)路多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)減少所致基底神經(jīng)節(jié)環(huán)路功能障礙。另外，在很多神經(jīng)退行性疾病(如帕金森病、阿爾茨海默病)中，膜離子通道(例如電壓門控鈉離子通道VGSCs)在這些患者的病理生理學(xué)機制中扮演著重要的角色。對于帕金森病人和動物模型的電生理研究顯示蒼白球和丘腦底核神經(jīng)元放電活動增加，呈現(xiàn)為同步有節(jié)律的高頻脈沖式放電。蒼白球和丘腦底核神經(jīng)元自發(fā)性放電主要依賴電壓門控鈉離子通道產(chǎn)生的鈉電流驅(qū)動，研究顯示電壓門控鈉離子通道阻斷劑TTX能夠抑制基底神經(jīng)節(jié)的自發(fā)性放電活動以及閾下膜電位震蕩。在成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，鈉離子通道除了在細(xì)胞和組織分布上的差異， 其在發(fā)育過程中的表達(dá)以及亞細(xì)胞的定位也是不同的。在成年期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中， Navl. 6是分布最豐富的鈉通道類型。Navl. 6主要在顆粒細(xì)胞中表達(dá)，高豐度表達(dá)于外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)有髓鞘神經(jīng)元的郎飛氏節(jié)處，在無髓神經(jīng)元的軸突以及皮層錐體神經(jīng)元和小腦Purkinje細(xì)胞的樹突也有分布。綜合比較相關(guān)文獻(xiàn)可發(fā)現(xiàn)，迄今沒有一篇文獻(xiàn)就全腦掃片描述Navl. 6在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中膠質(zhì)細(xì)胞的亞細(xì)胞定位，以及在6-0HDA單側(cè)腦損毀的帕金森大鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的Navl. 6的分布改變。鈉通道在維持細(xì)胞的興奮性和正常生理功能上起著重要的作用，同時它還是許多藥物作用的靶點。目前國際上已經(jīng)有研究者應(yīng)用包括蝎毒素在內(nèi)的一些鈉離子通道調(diào)制劑進行帕金森病發(fā)病機制以及治療的報道，如Mlthun-Lassalle等的研究顯示鈉離子通道調(diào)制劑Veratridine (藜蘆定)以及α-ScTx對培養(yǎng)中的原代神經(jīng)元有神經(jīng)保護作用； Schiavon的研究顯示β類蝎毒素Cn2能夠誘發(fā)出Navl. 6通道的復(fù)活電流，并提出Cn2可以作為帕金森病研究中的先導(dǎo)化合物。東亞鉗蝎(^zifel5Karsch，BmK)是我國傳統(tǒng)的中醫(yī)藥經(jīng)常采用的名貴藥材，被用于治療各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。現(xiàn)代生化和藥理研究表明，東亞鉗蝎粗毒中富含多種膜離子通道特異性的天然肽類調(diào)制劑，尤其是一些電壓門控鈉離子通道調(diào)制劑。BmK I是由東亞短鉗蝎中提取分離純化而得到的一類鈉通道特異性靶向藥物，是一個由60-70個氨基酸組成的長鏈肽類，能夠作用于鈉通道受體位點3，改變鈉通道的電生理特征，顯著延緩其失活過程。其機理是由于鈉通道由一個形成孔道的功能性α亞基，一個或數(shù)個輔助β亞基組成。α亞基是鈉通道行使功能的關(guān)鍵亞基，由四個高度同源的結(jié)構(gòu)域(DI-DIV)組成，每個結(jié)構(gòu)域含有六個跨膜α螺旋片段(S1-S6)。在其結(jié)構(gòu)上目前已經(jīng)鑒定了至少七個通道靶向藥物的受體位點，而本發(fā)明的鈉通道靶向藥物BmK I能夠與鈉通道上受體位點3結(jié)合。 受體位點 3 由 VGSCs 的 DI/S5-S6、DIV/S5-S6、以及 DIV/S3-S4 組成，其中 DIV/S3-S4 這段序列中的氨基酸對通道與位點3靶向藥物結(jié)合至關(guān)重要。鈉離子通道調(diào)制劑α類蝎毒素BmK I作為Navl. 6 一種可能的藥物作用靶標(biāo)，具有成為一種工具藥在帕金森病研究中的前景，以及在帕金森病發(fā)病機制和治療措施研究中存在的潛在前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一根據(jù)對正常大鼠及6-0HDA單側(cè)腦損毀的帕金森大鼠的全腦掃片，顯示Navl.6在腦內(nèi)的分布情況和表達(dá)豐度，提供一種鈉通道調(diào)制劑BmK I作為藥物靶標(biāo)在建立帕金森疾病模型中的應(yīng)用。本發(fā)明通過對正常大鼠及6-0HDA單側(cè)腦損毀的帕金森大鼠進行Navl. 6全腦掃片，觀察Navl. 6在腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞中的分布及亞細(xì)胞定位。結(jié)果證明，Navl. 6 不論在神經(jīng)元還是在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，都有高豐度的表達(dá)。在正常大鼠腦內(nèi)，在大腦皮層呈現(xiàn)彌散性分布，在神經(jīng)元聚集的區(qū)域高度表達(dá)在神經(jīng)元的軸突上，在神經(jīng)纖維富集的大腦腳、胼胝體有大量表達(dá)，另外，在星形膠質(zhì)細(xì)胞上也有大量分布。在6-0HDA單側(cè)腦損毀的帕金森大鼠全腦腦片免疫熒光結(jié)果顯示，在損毀側(cè)的胼胝體、海馬CA4區(qū)、海馬齒狀回、丘腦后側(cè)核區(qū)、黑質(zhì)網(wǎng)狀部較之未損毀側(cè)有不同程度表達(dá)量的升高，在胼胝體和丘腦后側(cè)核區(qū)表達(dá)的Navl. 6可以和GFAP-標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞共標(biāo)，在海馬CA4區(qū)、中腦紅核的主要表現(xiàn)為神經(jīng)元胞體形態(tài)，在海馬齒狀回主要聚集在神經(jīng)元軸突出聚集表達(dá)。在大腦皮層和海馬區(qū)，存在一些胞外Navl. 6聚集的斑塊狀(Plaque)形態(tài)存在。本發(fā)明中，還利用了人神經(jīng)瘤母細(xì)胞SH-SY5Y作為體外模型，在驗證了經(jīng)過維甲酸誘導(dǎo)后的SH-SY5Y可以表達(dá)Navl. 6 的前提下，在施加500nM的BmK I后，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)態(tài)激活曲線向超極化方向移動5個毫伏左右，而對激活曲線的斜率沒有顯著影響。表明在BmK I的作用下，通道變得更易激活。并且發(fā)現(xiàn) 500nM的BmK I也可以使快失活曲線向超極化方向偏移9mV，并且增大了失活曲線的K值， 使得曲線變緩，表明BmK I針對SH-SY5Y表達(dá)的中樞型電壓門控鈉通道有調(diào)制作用。
本發(fā)明在驗證正常大鼠和6-0HDA單側(cè)腦損毀的帕金森大鼠全腦的Navl. 6表達(dá)分布檢測的基礎(chǔ)上，又探討了 BmK I對人神經(jīng)瘤母細(xì)胞SH-SY5Y的電生理的改變。為鈉離子通道調(diào)制劑BmK I作為藥物靶標(biāo)提供了可靠的理論基礎(chǔ)，為研究帕金森病的細(xì)胞分子機制以及治療策略提供了研究載體，為其新型治療藥物的研究提供豐富的理論和實驗依據(jù)。同時也為研發(fā)新型治療神經(jīng)退行性疾病藥物提供了可靠的篩選平臺。


圖1為正常大鼠腦內(nèi)Navl. 6的分布。A 外側(cè)中央前區(qū)(Prcl) ；B 前嗅核(Aop)， 后部；C:扣帶前皮質(zhì)(ACd)，背側(cè)部；D 外側(cè)嗅束(LOT)和梨狀前皮質(zhì)(PCa)，前部(10X)。 圖2 正常大鼠腦內(nèi)Navl. 6陽性細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP共標(biāo)。A，B, C為乳頭體 (MMP) ；D, E，F(xiàn)為外側(cè)中央前區(qū)(Prcl) ；A, D為Nav 1. 6陽性細(xì)胞；B, E為GFAP陽性細(xì)胞； C，F(xiàn)為Merge圖。(紅色為Nav 1. 6陽性細(xì)胞，綠色為GFAP陽性細(xì)胞)。圖3為帕金森大鼠腦內(nèi)Navl. 6陽性細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP共標(biāo)。A，B， C為丘腦腹后外側(cè)核(Vpl);D，E，F(xiàn)為胼胝體壓部(SCC)(Anti-NaV1.6紅色；Anti-GFAP綠色)；A, D為Nav 1. 6陽性細(xì)胞；B, E為GFAP陽性細(xì)胞；C, F為Merge圖。圖4帕金森大鼠腦內(nèi)Navl. 6陽性細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP共標(biāo)。A，B，C 為丘腦腹后外側(cè)核(Vpl) ;D，E，F(xiàn)為胼胝體壓部(SCC) (Anti-Navl. 6紅色；Anti-GFAP綠色)；A, D為Nav 1. 6陽性細(xì)胞；B, E為GFAP陽性細(xì)胞；C, F為Merge圖。(紅色為Nav 1. 6 陽性細(xì)胞，綠色為GFAP陽性細(xì)胞)
圖5為分別使用ΙΟΟΟηΜ，500nM, 250nM, 125nM不同濃度的BmK I處理維甲酸誘導(dǎo)三天的SH-SY5Y細(xì)胞。圖6為維甲酸誘導(dǎo)后的SH-SY5Y細(xì)胞Nav 1.6的表達(dá)情況。圖7為膜片鉗記錄到IOOnM的TTX可以完全阻斷SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)向納電流。圖8為維甲酸誘導(dǎo)SH-SY5Y六天以后的穩(wěn)態(tài)激活曲線。圖9為維甲酸誘導(dǎo)SH-SY5Y六天以后的穩(wěn)態(tài)失活曲線。圖10為維甲酸誘導(dǎo)SH-SY5Y六天以后的快失活曲線。圖11為維甲酸誘導(dǎo)SH-SY5Y六天以后的慢失活曲線。
具體實施例方式實施例一正常大鼠腦內(nèi)Navl. 6的分布情況和表達(dá)豐度
正常大鼠麻醉后，開胸灌流，生理鹽水去血以及4%多聚甲醛固定，斷頭取腦，4°C條件下繼續(xù)在4%多聚甲醛后固定過夜，20%、30%的蔗糖溶液梯度脫水。用恒冷箱切片機(MICR0M HM525型)，_22°C進行大鼠全腦冰凍冠狀切片，片厚18 μ m。切片直接貼覆于經(jīng)明膠-硫酸鉻鉀處理的載玻片上，置于_20°C冰箱保存。各腦區(qū)腦切片進行免疫熒光雙標(biāo)實驗。切片，回溫處理。5% Goat Serum封閉，室溫 lh。加兔抗 Navl.6 抗體(1 500，abcam，USA)，4°C孵育過夜。0. OlM PBS CpH 7. 4)沖洗10 min，重復(fù)3次。加山羊抗兔Cy3標(biāo)記熒光二抗(紅色標(biāo)記，1 :800，millipore，USA)室溫下置濕盒中孵育2h (或者4°C過夜)。0. 05M甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH 2.4)30 min終止反應(yīng)。5% donkey Serum 封閉，室溫 lh。加小鼠抗 GFAP 抗體(1 300，cell signaling,USA)。加用0. OlM羊抗鼠FITC標(biāo)記熒光二抗(綠色標(biāo)記，1 :200，santa cruz，Europe)室溫下置濕盒中孵育池(或者4°C過夜)。50%甘油封片。每步驟之間均用0. OlM PBS CpH 7. 4) 沖洗10 min，重復(fù)3次。圖1為正常大鼠腦內(nèi)Navl. 6的分布。A 外側(cè)中央前區(qū)(Prcl) ；B 前嗅核(Aop)， 后部；C:扣帶前皮質(zhì)(ACd)，背側(cè)部；D 外側(cè)嗅束(LOT)和梨狀前皮質(zhì)(PCa)，前部(10X)。圖2為正常大鼠腦內(nèi)Navl. 6陽性細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP共標(biāo)。A，B，C 為乳頭體(MMP) ；D, E，F(xiàn)為外側(cè)中央前區(qū)(Prcl) ；A, D為Nav 1. 6陽性細(xì)胞；B, E為GFAP陽性細(xì)胞；C, F為Merge圖。(紅色為Nav 1. 6陽性細(xì)胞，綠色為GFAP陽性細(xì)胞)。圖1顯示的結(jié)果明顯表示，在正常大鼠腦內(nèi)，Navl. 6不論在大腦皮層還是大腦白質(zhì)都有表達(dá)。在正常大鼠腦內(nèi)，在大腦皮層呈現(xiàn)彌散性分布，在神經(jīng)元聚集的區(qū)域高度表達(dá)在神經(jīng)元的軸突上，在神經(jīng)纖維富集的大腦腳、胼胝體有大量表達(dá)，另外，在星形膠質(zhì)細(xì)胞上也有大量分布。故后續(xù)實驗進行了 Navl. 6和GFAP免疫熒光雙標(biāo)的實驗。在圖2顯示的結(jié)果中，Navl. 6陽性能夠和GFAP陽性較好程度的共標(biāo)，同時也存在少量顆粒彌散狀的分布。結(jié)果顯示，在正常大鼠腦內(nèi)，Navl. 6的陽性主要有GFAP標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞所貢獻(xiàn)， 同時彌散性的分布也表示，在腦內(nèi)，Navl. 6的陽性并不僅僅由星形膠質(zhì)細(xì)胞所提供。該結(jié)果為進一步深入了解腦內(nèi)Navl. 6的研究提供了新的實驗依據(jù)。實施例二 6_0HDA單側(cè)腦損毀的帕金森大鼠腦內(nèi)Navl. 6的分布情況和表達(dá)豐度 6-0HDA單側(cè)腦損毀的帕金森大鼠進行腦灌注、固定、脫水、冰凍切片、免疫染片。具體實
驗步驟參照實施例一所述。圖3 帕金森大鼠腦內(nèi)Navl. 6陽性細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP共標(biāo)。A，B，C 為丘腦腹后外側(cè)核(Vpl) ;D，E，F(xiàn)為胼胝體壓部(SCC) (Anti-Navl. 6紅色；Anti-GFAP綠色)；A, D為Nav 1. 6陽性細(xì)胞；B, E為GFAP陽性細(xì)胞；C, F為Merge圖。(紅色為Nav 1. 6 陽性細(xì)胞，綠色為GFAP陽性細(xì)胞)。圖4:Nav 1. 6在帕金森大鼠模型不同腦區(qū)的分布。A，B為海馬齒狀回(DG_CA4);C， D為胼胝體壓部(SCC);E，F(xiàn)為黑質(zhì)網(wǎng)狀部(Snr);G，H為紅核(Red nucleus)； Contralteral sections代表對照側(cè)，Ipsilateral sections代表損毀側(cè)。在圖3的6-0HDA單側(cè)腦損毀的帕金森大鼠全腦腦片免疫熒光結(jié)果顯示，在PD大鼠模型的腦內(nèi)，不論以丘腦腹側(cè)核為代表的基底神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元區(qū)，還是以胼胝體壓部為代表的大腦白質(zhì)神經(jīng)纖維富集區(qū)，都顯示了 Navl. 6和GFAP明顯共標(biāo)。在圖4中，Navl. 6單標(biāo)結(jié)果中，顯示了在海馬CA4區(qū)、中腦紅核的主要表現(xiàn)為神經(jīng)元胞體形態(tài)，在海馬齒狀回主要聚集在神經(jīng)元軸突出聚集表達(dá)。在大腦皮層和海馬區(qū)，存在一些胞外Navl. 6聚集的斑塊狀(Plaque)形態(tài)存在。圖3、4結(jié)論表示，在PD大鼠腦內(nèi)，特別在大腦白質(zhì)區(qū)域，Navl. 6的陽性貢獻(xiàn)者也主要是由星形膠質(zhì)細(xì)胞所提供，而在大腦皮層區(qū)域、海馬區(qū)域或者神經(jīng)核團等區(qū)域，Navl. 6的陽性主要在神經(jīng)元胞體和軸突上表達(dá)，另外，還存在部分胞外Navl. 6聚集的斑塊狀(Plaque)形態(tài)存在。在圖4，顯示的Nav 1. 6和GFAP雙標(biāo)的實驗結(jié)果，在PD模型大鼠的腦內(nèi)，損毀側(cè)與未損毀側(cè)，Navl. 6在一些腦區(qū)存在著明顯的差異。在損毀側(cè)的胼胝體、海馬CA4區(qū)、海馬齒狀回、丘腦后側(cè)核區(qū)、黑質(zhì)網(wǎng)狀部較之未損毀側(cè)有不同程度表達(dá)量的升高。以上的結(jié)果，為了解PD大鼠腦內(nèi)Navl. 6的改變提供了實驗數(shù)據(jù)，為進一步的深入研究PD腦內(nèi)電壓門控鈉離子通道的平衡，研究帕金森病發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。實施例三不同濃度的BmK I不能降低SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞活性
參見圖5，圖5為使用MTS法測細(xì)胞活性統(tǒng)計圖。在均勻鋪板的96孔板上，利用不同濃度的 BmK I (125nM, 250nM, 500nM, IOOOnM)處理 SH-SY5Y —天，再分別加入 MTS 溶液顯色 4 小時，在波長490nm下檢測吸光度，統(tǒng)計作圖。結(jié)果顯示不同濃度的BmK I不能降低SH-SY5Y的細(xì)胞活性。提示BmK I作為特異性鈉通道的調(diào)制劑，并沒有明顯的細(xì)胞毒性。實施例四維甲酸(RA)誘導(dǎo)后的SH-SY5Y細(xì)胞表達(dá)Nav 1. 6
SH-SY5Y細(xì)胞用維甲酸分別誘導(dǎo)3天組、6天組和不誘導(dǎo)組三組，利用免疫熒光化學(xué)的方法Navl. 6的表達(dá)。細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，含l%Triton-X的PBS處理30分鐘后PBS洗三遍，5%的羊血清孵育1小時，直接上一抗(Rabbit polyclonal to Nav 1. 6, abeam, UK), 4° C 冰箱過夜。二抗(Goat anti Rabbit CY3. conjugated, Millpore, USA)，孵育兩小時， PBS洗四遍，必要時可以鏡檢一下熒光顆粒有沒有洗干凈。DAPI，5分鐘，PBS洗凈后甘油封片。參見圖6，圖6為鈉通道亞型Navl. 6在SH-SY5Y的表達(dá)情況。CT3標(biāo)記為Navl. 6， DAPI標(biāo)記細(xì)胞核。Con組為不加一抗的空白對照，標(biāo)尺為10 μ m。經(jīng)過維甲酸誘導(dǎo)的SH-SH5Y細(xì)胞，3天與6天都檢測到Navl. 6的表達(dá)，表達(dá)豐度沒有明顯差別。而沒有RA誘導(dǎo)的細(xì)胞，也有Navl.6的表達(dá)，但是信號并不強烈。根據(jù)這一結(jié)果，以下膜片鉗記錄均采用維甲酸誘導(dǎo)六天的SH-SY5Y細(xì)胞進行實驗。實施例五BmK I對維甲酸誘導(dǎo)六天后的SH-SY5Y細(xì)胞系的調(diào)制作用
按照Hamill等報道的方法，在室溫(21 V -25 °C )下利用EPC-9放大器(德國，HEKA Eletronik)進行全細(xì)胞電壓膜片鉗實驗。通過PC-IO拉制儀(日本，Narishige)將玻璃毛細(xì)管拉制成尖端阻抗為2-3 ΜΩ的膜片鉗電極。利用Pulse/PusleFit 8.3軟件(德國， HEKA Eletronik)來采樣和制定刺激方案。電容電流由系統(tǒng)補償。串聯(lián)電阻誤差由系統(tǒng)補償75%，串聯(lián)電阻高于15 ΜΩ的細(xì)胞不可用。線型漏電流采用P/4的方法由系統(tǒng)給予補償。數(shù)據(jù)的采樣頻率為20 kHz，低通濾波頻率為10 kHz。采用重力灌流系統(tǒng)進行換液，不同濃度的NaCl溶液在20 s內(nèi)約更換95%。SH-SY5Y 細(xì)胞膜片鉗實驗中，細(xì)胞內(nèi)液(mM) :CsF 120, HEPES 10, EGTA 10, NaCl 10，CsCl 10，CaCl2 (以 CsOH 調(diào)整 pH 至 7. 3)。細(xì)胞外液(mM) :NaCl 135，HEPES 10，MgCl2 4，Glucose 10，KCl 5, Tetraethylammonium 10，EGTA 1 (以 NaOH 調(diào)整 pH 至 7. 4)。內(nèi)液和外液的滲透壓分別用蔗糖矯正為觀5-四0和四5-300 mOsm。毒素溶于含1 mg/ml牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的細(xì)胞夕卜液中。穩(wěn)態(tài)激活曲線利用電導(dǎo)公式和波爾茲曼方程擬合(圖8);穩(wěn)態(tài)失活曲線、快慢失活曲線直接利用波爾茲曼方程擬合(圖9，10，11)。擬合后參數(shù)半數(shù)激活(失活)電壓/2，電壓常數(shù)K分別統(tǒng)計后制成表一。1 . SH-SY5Y細(xì)胞系表達(dá)TTX敏感的鈉通道
參見圖7，IOOnM的TTX可以完全阻斷SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)向納電流。
2 .BmK I可使SH-SY5Y的穩(wěn)態(tài)激活曲線向超極化方向偏移
參見圖8，圖8為維甲酸誘導(dǎo)SH-SY5Y六天以后的穩(wěn)態(tài)激活曲線，圓點黑線代表對照組(n=24)，三角灰線代表加BmK I后10分鐘之后的穩(wěn)態(tài)激活曲線(n=24)。通過給予一系列脈沖刺激后誘發(fā)納電流，統(tǒng)計后得到SH-SY5Y細(xì)胞電流穩(wěn)態(tài)激活曲線。在施加500nM的BmK I后，可以使曲線向超極化方向移動5個毫伏左右，參見圖9。 而對穩(wěn)態(tài)激活曲線的斜率沒有顯著影響。參見表1，表1中的Activation表示通道在BmK I的作用下，變得更易激活。表一不同刺激的半數(shù)激活(失活)電壓和電壓常數(shù)K的比較
3. BmK I可以使SH-SY5Y的穩(wěn)態(tài)失活曲線向超極化方向偏移
施加500nM的BmK I下，可以使SH-SY5Y的穩(wěn)態(tài)失活曲線向超級化方向偏移5mV左右， ？ ' KJaL^ 1 Φ steady-State Inactivgitiori。4 BmK I針對SH-SY5Y內(nèi)向納電流的快失活向超極化方向偏移，但對慢失活動力學(xué)的無影響。圖10甲酸誘導(dǎo)SH-SY5Y六天以后的快失活曲線(n=9，15)，圖11為B為同條件下得慢失活曲線(n=7，10)。500nM的BmK I可以使快失活曲線向超極化方向偏移5mV左右， 但是對于慢失活曲線沒有影響(圖11)。表明在SH-SY5Y細(xì)胞系中，BmK I主要調(diào)制了鈉通道快失活的組分，而對慢失活組分調(diào)制沒有顯著性差異。此外500 nM的BmK I可以增大快組分失活曲線的斜率因子，(參見表1，F(xiàn)ast inactivation)，這一結(jié)果提示，BmK I影響到了第四結(jié)構(gòu)域的電壓感受器。
權(quán)利要求
1. 一種鈉通道調(diào)制劑BmK I作為藥物靶標(biāo)在建立帕金森疾病模型中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鈉通道調(diào)制劑BmKI的新應(yīng)用。本發(fā)明在驗證正常大鼠和6-OHDA單側(cè)腦損毀的帕金森大鼠全腦的Nav1.6表達(dá)分布檢測的基礎(chǔ)上，又探討了BmKI對人神經(jīng)瘤母細(xì)胞SH-SY5Y的電生理的改變。為鈉離子通道調(diào)制劑BmKI作為藥物靶標(biāo)提供了可靠的理論基礎(chǔ)，為研究帕金森病的細(xì)胞分子機制以及治療策略提供了研究載體，為其新型治療藥物的研究提供豐富的理論和實驗依據(jù)。同時也為研發(fā)新型治療神經(jīng)退行性疾病藥物提供了可靠的篩選平臺。
文檔編號A01K67/027GK102552878SQ201210046118
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月28日
發(fā)明者馮琦, 吉永華, 吳凌燕, 朱紅艷, 裴虓 申請人:上海大學(xué)