專利名稱：一種基于mypt1基因敲除建立新型高血壓小鼠模型的方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到病理學、生理學，遺傳學，分子生物學領(lǐng)域。本發(fā)明通過基因敲除技術(shù)，降低小鼠內(nèi)源性MYPTl的表達，從而達到使小鼠血壓升高的目的。
背景技術(shù)：
本發(fā)明旨在提供一種建立自發(fā)的、可遺傳的高血壓小鼠模型的方法。高血壓是一種嚴重影響人類健康的疾病，其危害性在于它會導(dǎo)致很多并發(fā)癥，比如心衰，腎衰，腦中風等，從而導(dǎo)致死亡。目前關(guān)于絕大多數(shù)高血壓病的發(fā)病機制并不清楚，這一類疾病被稱為原發(fā)性高血壓。因此，利用動物模型研究高血壓疾病可以為人類高血壓疾病的診斷、治療提供
理論基礎(chǔ)。目前用來研究高血壓動物模型主要有以下幾種1、慢性實驗性高血壓類型；2、神經(jīng)源性高血壓；3、腎源性高血壓；4、內(nèi)分泌性高血壓。這些建立高血壓模型的方法大多要經(jīng)過外源性藥物或其它方法處理，甚至是通過手術(shù)手段，不能完全模擬人類的原發(fā)性高血壓，而遺傳性的高血壓模型可以最大程度的模擬臨床上原發(fā)性的高血壓，也高有利于研究高血壓的發(fā)病機制，治療藥物靶點的設(shè)計。另外，遺傳性高血壓模型個體之間不存在手術(shù)操作或者藥物劑量導(dǎo)致的差異，其背景高度一致，可以作為新藥篩選的有用工具。關(guān)于高血壓的發(fā)生機制目前并不是很清楚。經(jīng)典理論認為，腎臟功能紊亂是引起高血壓關(guān)鍵因素，但是，近幾年的研究表明，血管平滑肌病變也可以直接導(dǎo)致高血壓的產(chǎn)生。因此，研究血管平滑肌收縮機制及其在高血壓發(fā)生中的作用，可以為高血壓的診斷和治療提供有效指導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種高血壓小鼠模型，該動物模型血壓自發(fā)性的升高，穩(wěn)定性強，并且其高血壓性狀是可遺傳的，與人類原發(fā)性高血壓類似。本發(fā)明還提供了一種建立高血壓小鼠模型的方法，即通過在平滑肌組織特異性敲除MYPT1，提高MYPTl底物肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈的磷酸化水平，從而導(dǎo)致血管平滑肌收縮增強，外周血管阻力增大，形成高血壓。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方法實現(xiàn)的(I)建立MYPTl敲除模型；(2)測量小鼠尾動脈壓；(3)通過小動物成像系統(tǒng)檢測小鼠的心功能；(4)用ELISA試劑盒檢測小鼠血清中腎素、血管緊張素、醛固酮的濃度；(5)用肌張力儀測量小鼠阻力血管的收縮張力；(6)用尿素甘油膠電泳分析小鼠阻力血管中肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈磷酸化；(7)尾靜脈注射高血壓藥物后檢測小鼠的尾動脈壓。


圖I為建立MYPTl平滑肌特異性敲除小鼠的策略。
圖2為MYPTl敲除和對照組小鼠的血壓值。㈧成年敲除和對照小鼠的收縮壓、舒張壓以及平均血壓。(B)敲除和對照小鼠的收縮壓隨年齡增長的變化曲線。圖3為ELISA檢測的MYPTl敲除和對照組小鼠的血清中腎素(A)、血管緊張素(B)、 醛固酮(C)的濃度，圖4為MYPTl敲除和對照組小鼠的心功能參數(shù)。圖5為MYPTl敲除和對照組小鼠的心率。圖6為MYPTl敲除后血管在各種刺激下的收縮張力變化，其中包括124mM氯化鉀溶液、IOuM去甲腎上腺素(NE), O. IuM內(nèi)皮素(ETl)、IOuM血管緊張素(AngII)、IuM加壓素 (Vasopressin)、0· IuM 血檢素類似物(U46619)。圖7為MYPTl敲除后血管中的肌球蛋白磷酸化水平變化。(A、C)分別為氯化鉀、 去甲腎上腺素刺激后，腸系膜動脈血管中的RLC的磷酸化檢測的結(jié)果，(B、D)為統(tǒng)計結(jié)果。圖8為利用MYPTl敲除小鼠檢測降壓藥藥效檢測實例。(A)為培哚普利片以 I. 2ug/g小鼠體重尾靜脈注射，連續(xù)五天注射期間小鼠的收縮壓變化。(B)為苯磺酸氨氯地平片以I. 5ug/g小鼠體重尾靜脈注射，連續(xù)五天注射期間小鼠的收縮壓變化。
具體實施例方式本發(fā)明的實施步驟說明如下I.平滑肌特異性敲除MYPTl的小鼠模型的構(gòu)建首先，通過同源重組技術(shù)將MYPTl基因的序列從BAC克隆(bMQ 363i09，從Sanger 研究所訂購)中套取出來的，用來構(gòu)建打靶載體。在MYPTl基因的第一個外顯子兩側(cè)插入兩個IoxP位點后，將構(gòu)建好的打靶載體線性化，然后進行胚胎干細胞電轉(zhuǎn)。通過長片段PCR 和SouthernBlot方法篩選打靶載體與胚胎干細胞基因組發(fā)生重組的克隆，然后將陽性的干細胞克隆注射到B6小鼠的囊胚中。通過將注射后嵌合囊胚移植到代孕母鼠的子宮，生下嵌合小鼠。通過雙IoxP小鼠與平滑肌特異表達的SMA-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配可以得到在平滑肌中敲除MYPTl的小鼠。經(jīng)蛋白免疫印跡實驗證明，在成年的MYPTl敲除的小鼠的血管平滑肌中，MYPTl被全部剔除了。2.小鼠血壓的測量經(jīng)以上步驟得到的小鼠，飼養(yǎng)到三到八個月可以用來進行血壓測量。本發(fā)明中采用的是尾動脈套管法測小鼠血壓，所用儀器為上海奧爾科特的無創(chuàng)血壓儀。在實驗數(shù)據(jù)采集之前，都要對實驗組和對照組小鼠進行為期五天的訓練，具體方法為，在每天上午十到十一點，每只小鼠置于32度恒溫箱中，連續(xù)測十到二十分鐘。待到小鼠血壓測量穩(wěn)定后開始采集數(shù)據(jù)，每只小鼠連續(xù)測五天，取平均值作為這只小鼠的血壓值，敲除組和對照組小鼠各測十只小鼠做統(tǒng)計。3.血管平滑肌張力測定阻力血管的肌張力是通過丹麥DMT儀器公司的四通道肌張力儀記錄的。具體方法為將小鼠的腸系膜二級血管從腸系膜結(jié)締組織中分離出來，剪成I. 4毫米長的血管條，然后用兩根20微米直徑的細鋼絲穿入血管腔，用螺絲固定到連接著傳感器的組織浴槽中。然后將血管條以最放松的狀態(tài)在HEPES-Tyrode (H-T)生理溶液中平衡30分鐘，通過調(diào)節(jié)螺旋測微尺逐步將血管內(nèi)壓調(diào)到體內(nèi)IOOmmHg的張力狀態(tài)，作為初始張力。在調(diào)到基礎(chǔ)張力狀態(tài)后，平衡30分鐘，然后用124mM氯化鉀H-T溶液或者去甲腎上腺素，血管緊張素等激動劑刺激血管，通過張力傳感器實時記錄血管收縮力。4. MYPTl底物肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈的磷酸化水平檢測肌球蛋白輕鏈的磷酸化水平是通過尿素甘油膠電泳然后做蛋白免疫印跡檢測的。 在腸系膜動脈分離出來后，置于H-T溶液中，在37度平衡30分鐘，然后用氯化鉀或者去甲腎上腺素刺激，在規(guī)定的時間內(nèi)迅速用液氮冷凍來，置于含IOmM的二硫蘇糖醇，4%三氯乙酸的丙酮溶液中，然后置于-80度冷藏。樣品提取時，將血管組織取出，換用含10毫摩的二硫蘇糖醇，4%三氯乙酸的水溶液中勻漿，然后4000rpm離心三分鐘，去上清。在用乙醚吹洗蛋白沉淀三次后，晾干，然后溶于樣品溶液中。溶好的蛋白樣品通過尿素甘油膠電泳，轉(zhuǎn)膜， 然后用識別肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈的抗體孵育，通過二抗孵育后，用辣根過氧化物酶顯影。可以檢測到磷酸化的和非磷酸化的肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈的兩條帶。5.腎素血管緊張素系統(tǒng)測定MYPTl敲除組和對照組的小鼠血清中的腎素、醛固酮、血管緊張素是通過商業(yè)化的 ELSIA試劑盒檢測的。具體過程如下首先從視網(wǎng)膜下毛細血管叢采血到加有抗凝劑EDTA 的管中，1000g、4度離心15分鐘，取上清，分裝凍存于-80度冰箱。在做ELISA檢測時，將血清加到有腎素、醛固酮或者血管緊張素的96孔板中，孵育洗滌后用辣根過氧化物酶法顯色，用酶標儀在450nm波長下讀取光吸收值，根據(jù)標準曲線換算出每一個樣本中的腎素、醛固酮或者血管緊張素濃度。6.心功能檢測小鼠的心功能參數(shù)是通過Vevo 770 小動物超聲成像系統(tǒng)檢測的。將小鼠用阿佛汀麻醉后，置于37度加熱臺上，然后用RMV707B探頭檢測胸骨旁短軸切面M型超聲圖像。 讀取M型超聲圖像測量左心室內(nèi)經(jīng)切面，計算出射血分數(shù)、短軸收縮率、左心室內(nèi)經(jīng)參數(shù)。7.部分高血壓藥物檢測為了檢測降壓藥物的藥效，我們通過尾靜脈注射的方法將藥物注射到MYPTl敲除組和對照組的小鼠體內(nèi)，然后測量血壓變化情況。經(jīng)過檢測的藥物有苯磺酸氨氯地平片，培哚普利片。其中，苯磺酸氨氯地平片在MYPTl敲除的小鼠中降壓效果不明顯，而培哚普利片可以使對照和敲除組的小鼠的血壓都降低。
權(quán)利要求
1.一種新的通過MYPTl基因敲除建立高血壓小鼠模型的方法，其特征是通過在平滑肌組織中特異性的降低MYPTl表達來實現(xiàn)血壓升高。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的建立高血壓小鼠模型的方法，其特征是通過增加外周血管阻力，從而建立高血壓小鼠模型。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的建立高血壓小鼠模型的方法，其特征是通過調(diào)節(jié)MYPTl底物肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈(RLC)的磷酸化水平來實現(xiàn)外周血管阻力增大，從而形成高血壓。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的建立高血壓小鼠模型方法，其特征是通過基因敲除技術(shù)在平滑肌中特異性地剔除MYPT1，是通過以下方法實現(xiàn)的首先利用同源重組的技術(shù)構(gòu)建打靶載體，在從BAC中套取出含有MYPTl基因的序列，然后在其第一個外顯子兩側(cè)插入LoxP位點。在構(gòu)建好打靶載體后，線性化載體，電轉(zhuǎn)到小鼠胚胎干細胞中，使其與胚胎干細胞基因組序列重組。通過長片段PCR和Southern Blot篩選，得到發(fā)生重組的陽性克隆。然后將陽性克隆注射到小鼠的囊胚中，移植到代孕母鼠子宮內(nèi)。等到母鼠生下嵌合鼠后，通過嵌合鼠和B6鼠交配，得到雜合子小鼠。雜合鼠和轉(zhuǎn)基因的SMA-Cre小鼠交配，得到的陽性子代再自交一代，可以得到平滑肌特異性敲除MYPTl的小鼠。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種通過MYPT1基因敲除而建立的新型高血壓小鼠模型的方法。這個高血壓小鼠模型是通過在平滑肌中特異性剔除MYPT1基因，提高MYPT1底物肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈(RLC)的磷酸化水平，從而導(dǎo)致外周血管阻力增大，小鼠血壓升高。MYPT1敲除小鼠收縮壓在3月齡時可達到140mmHg，這種高血壓狀態(tài)可十分穩(wěn)定地維持到15月齡。該高血壓小鼠模型是自發(fā)性的、可遺傳的，與人類的高血壓疾病高度類似。該高血壓小鼠是一種研究高血壓疾病發(fā)生機制的理想模型，也可以作為治療高血壓的新藥篩選工具。
文檔編號A01K67/027GK102586223SQ20121005886
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月8日
發(fā)明者喬艷寧, 何偉奇, 朱敏生 申請人:南京大學