專(zhuān)利名稱(chēng)：彩棉無(wú)菌苗的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物的培養(yǎng)方法，具體涉及彩棉無(wú)菌苗的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
彩色棉作為棉花品種的一類(lèi)，是重要的純天然、無(wú)污染綠色紡織產(chǎn)品重要原料之一，隨著人們生活水平的日益提高和紡織工業(yè)的飛速發(fā)展倍受青睞。彩色棉的纖維具有天然的棕、綠、黃、紅等多種顏色，用它進(jìn)行紡織可以不使用對(duì)環(huán)境有害的油劑、漿料、染料和其它后處理劑，避免了化工染料對(duì)人體的毒害作用和對(duì)棉纖維自身優(yōu)良品質(zhì)的破壞。但彩棉一直都受到產(chǎn)量低，缺乏配套加工設(shè)施，種植規(guī)模較小，作為特色棉配料進(jìn)行精紡加工， 生產(chǎn)規(guī)模受制于加工品質(zhì)的制約，選育適合加工的優(yōu)良品質(zhì)彩色棉品種是能否推動(dòng)彩色棉產(chǎn)業(yè)的重要條件之一。利用現(xiàn)有的常規(guī)育種手段難以實(shí)現(xiàn)對(duì)彩色棉品種的高效改良，隨著基因工程和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，棉花轉(zhuǎn)基因研究的成功突破為彩色棉的品種改良和新品種培育提供了實(shí)踐依據(jù)，以常規(guī)育種為基礎(chǔ)，進(jìn)行彩色棉轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)體系研究，可以實(shí)現(xiàn)將外源有益基因?qū)氩噬?，結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，可加快改善彩棉品質(zhì)進(jìn)程，縮短育種年限，提聞選擇效率。棉花的再生一直被公認(rèn)為是組織培養(yǎng)領(lǐng)域較難培育的作物之一，存在實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，重復(fù)性差，對(duì)外界環(huán)境的敏感度高、基因型依賴(lài)性大等障礙因素，能否獲得最佳狀態(tài)的愈傷組織是棉花再生培養(yǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。已有的研究結(jié)果表明下胚軸作為愈傷誘導(dǎo)及其分化的基礎(chǔ)材料和子葉，根等其他部位相比成功率高出許多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了彩棉無(wú)菌苗的培養(yǎng)方法， 為彩棉再生等后續(xù)研究提供了適宜的外植體材料。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為彩棉無(wú)菌苗的培養(yǎng)方法，包括以下步驟I)彩棉種子消毒后，以無(wú)菌水浸泡8-12小時(shí)，得到無(wú)菌彩棉種子，再將無(wú)菌彩棉種子在無(wú)菌環(huán)境下剝?nèi)シN皮并接種于1/2MS發(fā)芽培養(yǎng)基中，在光暗交替條件下進(jìn)行培養(yǎng)， 得到無(wú)菌苗；2)將步驟I)得到的無(wú)菌苗下胚軸在無(wú)菌條件下切為5_8mm小段，并轉(zhuǎn)入愈傷組織培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到彩棉的愈傷組織。上述的彩棉無(wú)菌苗的培養(yǎng)方法，所述步驟I)中，光培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為2000LX。上述的彩棉無(wú)菌苗的培養(yǎng)方法，所述步驟I)中，光暗交替條件為，先在溫度 30-35°C下黑暗培養(yǎng)3-5天，接著在溫度25-28°C下光照培養(yǎng)2-3天，總培養(yǎng)時(shí)間共為5-8天。上述的彩棉無(wú)菌苗的培養(yǎng)方法，所述步驟2)中，愈傷組織培養(yǎng)基為MSB添加有O. lmg/LN6-異戍烯腺嘌呤和O. lmg/L 二氯苯氧乙酸。外植體培養(yǎng)是再生的第一步，無(wú)菌苗的生長(zhǎng)狀態(tài)直接關(guān)系到愈傷組織的誘導(dǎo)情況。因此，本方法是在反復(fù)進(jìn)行了多種暗光周期及所適應(yīng)溫度交替培養(yǎng)的試驗(yàn)，以期得出彩棉無(wú)菌苗的最佳培養(yǎng)方式，為愈傷組織的誘導(dǎo)提供良好的受體材料。彩棉種子的萌發(fā)，前期的黑暗時(shí)間過(guò)短，幼苗生長(zhǎng)矮小，子葉未完全展開(kāi)；黑暗時(shí)間過(guò)長(zhǎng)不予光照，又會(huì)導(dǎo)致苗子過(guò)于弱小，切割后容易致死。因此，通過(guò)適宜的黑暗與光照時(shí)間培養(yǎng)，無(wú)菌苗可保持茁壯生長(zhǎng)?？偱囵B(yǎng)時(shí)間的確定也尤為重要，時(shí)間過(guò)短，幼苗株高較低，下胚軸粗細(xì)不勻，可切割利用的部分過(guò)少；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)又會(huì)造成下胚軸切割時(shí)容易連絲，脫分化能力降低，愈傷組織誘導(dǎo)緩慢。這可能與下胚軸幼嫩度有關(guān)，即外植體愈幼嫩，其細(xì)胞和組織分生能力愈強(qiáng)，脫分化能力強(qiáng)，老化部位脫分化能力較弱。棉花是喜溫作物，棉子發(fā)芽的最低溫度為10. 5_12°C，適宜溫度為28_30°C，本方法中得出彩棉種子發(fā)芽的前期黑暗適宜溫度為30-35°C，后期幼苗光照培養(yǎng)的適宜溫度為 25-280C，盡管在最適溫度基礎(chǔ)上，有溫度愈高種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)愈快的說(shuō)法，但考慮到恒溫箱內(nèi)無(wú)菌瓶?jī)?nèi)的萌發(fā)成長(zhǎng)，溫度過(guò)高易導(dǎo)致瓶?jī)?nèi)水汽過(guò)大，不利于苗子生長(zhǎng)，因此這里我們不提倡高溫促進(jìn)生長(zhǎng)的做法。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明充分考慮了光培養(yǎng)、暗培養(yǎng)和溫度對(duì)彩棉在無(wú)菌條件下的種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)，通過(guò)總培養(yǎng)時(shí)間的確定，暗培養(yǎng)和光照培養(yǎng)各階段時(shí)間及其對(duì)應(yīng)溫度的確定，獲得了一個(gè)適應(yīng)于無(wú)菌苗培養(yǎng)的成熟方法。該方法適應(yīng)于彩棉品種無(wú)菌系的建立，對(duì)彩棉轉(zhuǎn)基因育種具有技術(shù)支撐作用。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案材料中提及的1/2MS發(fā)芽培養(yǎng)基及后期愈傷誘導(dǎo)的MSB培養(yǎng)基， 均為常規(guī)培養(yǎng)基，配置后在高溫滅菌鍋滅菌后備用，MSB的成分如下
組成成分濃度(mg/L)大量元素NH4NO31650KNO,1900CaCl2JH2O440
權(quán)利要求
1.彩棉無(wú)菌苗的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟1)彩棉種子消毒后，以無(wú)菌水浸泡8-12小時(shí)，得到無(wú)菌彩棉種子，再將無(wú)菌彩棉種子在無(wú)菌環(huán)境下剝?nèi)シN皮并接種于1/2MS發(fā)芽培養(yǎng)基中，在光暗交替條件下進(jìn)行培養(yǎng)，得到無(wú)菌苗；2)將步驟I)得到的無(wú)菌苗下胚軸在無(wú)菌條件下切為5-8mm小段，并轉(zhuǎn)入愈傷組織培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到彩棉的愈傷組織。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的彩棉無(wú)菌苗的培養(yǎng)方法，其特征在于；所述步驟I)中，光培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為2000Lx。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的彩棉無(wú)菌苗的培養(yǎng)方法，其特征在于；所述步驟I)中，光暗交替條件為，先在溫度30-35 °C下黑暗培養(yǎng)3-5天，接著在溫度25-28 °C下光照培養(yǎng)2_3天， 總培養(yǎng)時(shí)間共為5-8天。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的彩棉無(wú)菌苗的培養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟2)中，愈傷組織培養(yǎng)基為MSB添加有O. lmg/L N6-異戊烯腺嘌呤和O. lmg/L 二氯苯氧乙酸。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了彩棉無(wú)菌苗的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟1)彩棉種子消毒后，以無(wú)菌水浸泡8-12小時(shí)，得到無(wú)菌彩棉種子，再將無(wú)菌彩棉種子在無(wú)菌環(huán)境下剝?nèi)シN皮并接種于1/2MS發(fā)芽培養(yǎng)基中，在光暗交替條件下進(jìn)行培養(yǎng)，得到無(wú)菌苗下胚軸；2)將步驟1)得到的無(wú)菌苗下胚軸在無(wú)菌條件下切為5-8mm小段，并轉(zhuǎn)入愈傷組織培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到彩棉無(wú)菌苗的愈傷組織。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明充分考慮了光培養(yǎng)、暗培養(yǎng)和溫度對(duì)彩棉在無(wú)菌條件下的種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)，通過(guò)總培養(yǎng)時(shí)間的確定，暗培養(yǎng)和光照培養(yǎng)各階段時(shí)間及其對(duì)應(yīng)溫度的確定，獲得了一個(gè)適應(yīng)于無(wú)菌苗培養(yǎng)的成熟方法。該方法適應(yīng)于彩棉品種無(wú)菌系的建立，對(duì)彩棉轉(zhuǎn)基因育種具有技術(shù)支撐作用。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102577977SQ20121007069
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月16日
發(fā)明者劉新星, 厚毅清, 張敏敏, 李忠旺, 羅俊杰, 陳子萱, 陳玉梁 申請(qǐng)人:甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所