專利名稱：一種綠棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物領(lǐng)域組織培養(yǎng)的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，具體涉及綠棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
棉花是世界性重要經(jīng)濟(jì)作物，彩色棉作為棉花品種的一類，是重要的純天然、無污染綠色紡織產(chǎn)品的重要原料之一，隨著人們生活水平的日益提高和紡織工業(yè)的飛速發(fā)展倍受青睞。彩色棉的纖維具有天然的棕、綠、黃、紅等多種顏色，用它進(jìn)行紡織可以不使用對(duì)環(huán)境有害的油劑、漿料、染料和其它后處理劑，避免了化工染料對(duì)人體的毒害作用和對(duì)棉纖維自身優(yōu)良品質(zhì)的破壞。但彩棉一直都受到產(chǎn)量低、纖維品質(zhì)差、遺傳不穩(wěn)定等因素的限制， 未能大面積示范推廣。棉花轉(zhuǎn)基因育種的突破極大地促進(jìn)了世界棉花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因育種作為傳統(tǒng)育種的重要補(bǔ)充逐漸成為重要育種手段，拓展可再生彩棉品種基因型，尤其是具有重要推廣價(jià)值的特色品種類型，胚性愈傷組織誘導(dǎo)是彩棉轉(zhuǎn)基因研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)， 也是彩棉轉(zhuǎn)基因育種，進(jìn)行彩棉品種改良和品質(zhì)改善的重要途徑和方法，具有重要的研究?jī)r(jià)值和發(fā)展前景。在完成對(duì)棉花品質(zhì)和抗性基因工程改造的同時(shí)，首先要建立一個(gè)高效的棉花再生體系。眾所周知，棉花的再生工程受到基因型的限制很大，棉花的組織培養(yǎng)繼代時(shí)間長(zhǎng)，愈傷組織分化率低，重復(fù)性差。影響棉花體細(xì)胞再生的因素除外植體來源外，主要還有激素組合、培養(yǎng)基、氮源、碳源、無機(jī)鹽、有機(jī)物等。目前仍舊沒有任何一個(gè)體系可以完成對(duì)所有棉花品種的再生建立。目前所能做的就是擴(kuò)展盡可能多得棉花品種來完成再生研究，在一定量的積累上實(shí)現(xiàn)質(zhì)的突破。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，克服了綠棉體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生的困難，提供了一種綠棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為一種綠棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，包括有以下步驟I)綠棉種子以硫酸脫絨后，再經(jīng)過消毒洗滌，得到無菌綠棉種子，再將無菌綠棉種子在無菌環(huán)境下剝?nèi)シN皮并接種于1/2MS固體培養(yǎng)基中，在光暗交替條件下進(jìn)行培養(yǎng)，得到無菌苗下胚軸；2)將步驟I)得到的無菌苗下胚軸在無菌條件下切為5_8mm小段，并置于綠棉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)30天，得到初級(jí)培養(yǎng)綠棉愈傷組織；3)將步驟2)得到的初級(jí)培養(yǎng)綠棉愈傷組織轉(zhuǎn)接至綠棉愈傷組織增殖培養(yǎng)基并繼代培養(yǎng)2次，得到增殖后綠棉愈傷組織；4)將步驟3)得到的增殖后綠棉愈傷組織轉(zhuǎn)入綠棉愈傷組織分化培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)2次，得到胚性愈傷組織；
5)將步驟4)得到的胚性愈傷組織置于綠棉胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，進(jìn)行擴(kuò)
繁培養(yǎng)。上述的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，所述步驟I)中，硫酸脫絨所用的為95%的濃硫酸；消毒洗滌的過程為綠棉種子先以70%乙醇涮洗30s，再用30%過氧化氫浸泡3h， 無菌水沖洗5-8遍,最后用無菌水浸泡8-12h至種子露白；無菌綠棉種子的培養(yǎng)周期為4-8天，光暗交替過稱為黑暗3-5天，關(guān)照1-3天。上述的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，所述步驟2)中，綠棉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為按照以下比例加入了 O. 05-0. 15mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸和O. 05-0. 3mg/L的N6-異戊烯腺嘌呤，或O. 05-0. 15mg/L 2，4_ 二氯苯氧乙酸、O. 05-0. 15mg/L N6-異戊烯腺嘌呤和 O. 1-0. 3mg/L吲哚乙酸的MSB培養(yǎng)基。上述的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，所述步驟3)中，綠棉愈傷組織增殖培養(yǎng)基為按照以下比例加入了 O. 025-0. 075mg/L 2,4- 二氯苯氧乙酸和O. 05-0. 3mg/L N6-異戊烯腺嘌呤，或O. 05-0. 3mg/L N6-異戊烯腺嘌呤和O. 1-0. 3mg/L吲哚乙酸的MSB培養(yǎng)基。上述的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，所述步驟4)中，綠棉愈傷組織分化培養(yǎng)基為按照以下比例加入了 I. 9-3. 8g/L KNO3 和 I. 8-2. 5g/L 凝固劑 gelrite 的 MSB 培養(yǎng)基。上述的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，所述步驟5)中，綠棉胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基為按照以下比例加入了 1.9-3. 8g/L KN03、1. 8-2. Og/L 凝固劑 gelrite,O. 1-0. 5g/L 天冬酰胺和 O. I-ο. 5g/L谷氨酰胺并且原始配方中NH4NO3的加入量減半的MSB培養(yǎng)基。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明提供的綠棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，從外植體的培養(yǎng)到愈傷組織誘導(dǎo)，愈傷組織增殖分化，調(diào)節(jié)和篩選愈傷組織質(zhì)地疏松無硬化、顏色淺綠、灰綠到黃綠的愈傷組織，對(duì)其增殖及分化過程的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終研究得到胚性愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)間可縮短至4-6個(gè)月，愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)100 %，胚性愈傷組織分化率達(dá)10 %-20%,繼代 15天后胚性愈傷組織的增殖倍數(shù)可達(dá)I. 5倍，可有效節(jié)省人力、物力的損耗。外植體培養(yǎng)是再生的第一步，無菌苗的生長(zhǎng)情況直接關(guān)系愈傷組織的誘導(dǎo)。由于采用了暗光交替的培養(yǎng)， 為愈傷組織的誘導(dǎo)提供了分生能力最強(qiáng)時(shí)期的下胚軸。2，4-D在誘導(dǎo)愈傷組織中是必需的， 它啟動(dòng)細(xì)胞分裂速度快，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織頻率高、質(zhì)量好，在棉花組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化中被廣泛應(yīng)用。但2，4-D濃度過高會(huì)導(dǎo)致愈傷組織稀松褐化，且長(zhǎng)期使用不利于后期胚性愈傷組織的產(chǎn)生。因此，在愈傷組織誘導(dǎo)期加入了合適濃度的KT和2，4-D，而在后期愈傷組織增殖繼代中采取去除2，4-D或?qū)ζ溥M(jìn)行減半的方法，以避免對(duì)后期工作的阻礙。愈傷組織分化過程中則采用無激素的培養(yǎng)基更加有利于其分化。此時(shí)，因前期外源激素的累積，后期若再加入激素，可能會(huì)造成外源激素與愈傷組織體內(nèi)激素的沖突，不利于后期培養(yǎng)。關(guān)于胚性愈傷組織的增殖，研究發(fā)現(xiàn)氮源減弱有利于胚性愈傷組織增殖，完全去除和使用全量的氮源都會(huì)影響其增殖。該方法耗時(shí)短，誘導(dǎo)率高，拓展了可再生棉花的基因型。適應(yīng)于彩棉的綠棉品種，對(duì)彩棉轉(zhuǎn)基因育種的發(fā)展壯大具有積極作用。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案材料中所提及的的MSB培養(yǎng)基，是一種常規(guī)培養(yǎng)基，其主要成分及用量如表I所示表I
權(quán)利要求
1.一種綠棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，其特征在于，包括有以下步驟1)綠棉種子以硫酸脫絨后，再經(jīng)過消毒洗滌，得到無菌綠棉種子，再將無菌綠棉種子在無菌環(huán)境下剝?nèi)シN皮并接種于1/2MS固體培養(yǎng)基中，在光暗交替條件下進(jìn)行培養(yǎng)，得到無菌苗下胚軸；2)將步驟I)得到的無菌苗下胚軸在無菌條件下切為5-8_小段，并置于綠棉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)30天，得到初級(jí)培養(yǎng)綠棉愈傷組織；3)將步驟2)得到的初級(jí)培養(yǎng)綠棉愈傷組織轉(zhuǎn)接至綠棉愈傷組織增殖培養(yǎng)基并繼代培養(yǎng)2次，得到增殖后綠棉愈傷組織；4)將步驟3)得到的增殖后綠棉愈傷組織轉(zhuǎn)入綠棉愈傷組織分化培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)2-3 次后，得到胚性愈傷組織；5)將步驟4)得到的胚性愈傷組織置于綠棉胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟I)中，硫酸脫絨所用的為95%的濃硫酸；消毒洗滌的過程為綠棉種子先以70%乙醇涮洗30s，再用30%過氧化氫浸泡3h，無菌水沖洗5-8遍,最后用無菌水浸泡8-12h至種子露白；無菌綠棉種子的培養(yǎng)周期為4-8天，光暗交替過稱為黑暗3-5天，關(guān)照1-3天。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟2)中，綠棉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為按照以下比例加入了 O. 05-0. 15!^/1的2，4-二氯苯氧乙酸和O.05-0. 3mg/L的N6-異戊烯腺嘌呤，或O. 05-0. 15mg/L 2，4- 二氯苯氧乙酸、O. 05-0. 15mg/L N6-異戊烯腺嘌呤和O.1-0. 3mg/L吲哚乙酸的MSB培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟3)中，綠棉愈傷組織增殖培養(yǎng)基為按照以下比例加入了 O. 025-0. 075mg/L 2，4- 二氯苯氧乙酸和O. 05-0. 3mg/L N6-異戊烯腺嘌呤，或O. 05-0. 3mg/L N6-異戊烯腺嘌呤和O. 1-0. 3mg/L吲哚乙酸的MSB培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟4)中，綠棉愈傷組織分化培養(yǎng)基為按照以下比例加入了 I. 9-3. 8g/L KNO3和I. 8-2. 5g/L凝固劑gelrite的 MSB培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟5)中，綠棉胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基為按照以下比例加入了 1.9-3.8g/L KNO3>1.8-2. Og/L凝固劑gelrite、O.l-o. 5g/L天冬酰胺和O. 1-0. 5g/L谷氨酰胺并且原始配方中NH4NO3的加入量減半的MSB 培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種綠棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，包括有以下步驟綠棉種子消毒后剝?nèi)シN皮進(jìn)行培養(yǎng)，得到無菌苗下胚軸；無菌苗下胚軸置于綠棉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；轉(zhuǎn)接至綠棉愈傷組織增殖培養(yǎng)基并繼代培養(yǎng)；轉(zhuǎn)入綠棉愈傷組織分化培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)得到胚性愈傷組織；再進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明提供的綠棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，耗時(shí)短，誘導(dǎo)率高，拓展了可再生棉花的基因型，適應(yīng)于彩棉的綠棉品種，對(duì)彩棉轉(zhuǎn)基因育種的發(fā)展壯大具有積極作用。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102577978SQ201210070699
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月16日
發(fā)明者劉新星, 曲延英, 李忠旺, 羅俊杰, 陳子萱, 陳玉梁 申請(qǐng)人:甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所