專利名稱：可提高水稻生殖期抗旱性的eadt1基因，編碼序列和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在水稻中表達(dá)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白擬々/7基因的克隆，轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建以及在提高水稻耐旱性和結(jié)實(shí)率中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻是我國(guó)最重要的糧食作物，同時(shí)也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中用水最多的作物。干旱嚴(yán)重影響了水稻的產(chǎn)量，如何減少水稻對(duì)水的依賴，使其具有節(jié)水抗旱的特性，對(duì)我國(guó)的糧食、 水和生態(tài)安全具有重要意義。產(chǎn)量的重要決定因素就是水稻在花期的結(jié)實(shí)率。水稻在不同發(fā)育時(shí)期對(duì)于干旱的耐受能力不一樣(Saini & Lalonde，1998; Yang & Siang，2006)。 在營(yíng)養(yǎng)期水分缺乏時(shí)，只要能維持最低需水量，那么在轉(zhuǎn)入生殖生長(zhǎng)期后，水分供給充足的話，往往能夠開花結(jié)實(shí)，不一定會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)。生產(chǎn)實(shí)踐也表明，水稻營(yíng)養(yǎng)期完全可以在半濕潤(rùn)的土地上生長(zhǎng)；但到了生殖生長(zhǎng)期(花期)，田間則需要維持一定水層，因?yàn)榇藭r(shí)水稻需水量最大。如果遭到水分脅迫，花粉粒育性往往會(huì)受到影響，導(dǎo)致結(jié)實(shí)率嚴(yán)重下降(Saini & Lalonde，1998)。在水稻的減數(shù)分裂期，短時(shí)間4天左右的干旱，都會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量嚴(yán)重下降 80% (Sheoran & Saini，1996)。因此，提高干旱脅迫下的水稻育性和結(jié)實(shí)率，對(duì)于提高逆境下的水稻產(chǎn)量有著十分重要的意義。利用分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)進(jìn)行分子育種，將抗旱相關(guān)基因轉(zhuǎn)入優(yōu)良的水稻品種中，改良其抗旱性，培育即抗旱又高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的農(nóng)作物新品種是抗旱育種的有效途徑之一。本研究通過(guò)水稻基因芯片的方法篩選到了一個(gè)在花期受干旱誘導(dǎo)的基因擬々/7，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高這個(gè)基因在體內(nèi)的表達(dá)水平，可以改變水稻花期的抗旱能力，提高結(jié)實(shí)率。EADTl (.Enhance Anthesis Drought Tolerance 7 )基因編碼一個(gè)脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白 (Lipid Transfer Protein, LTP)，LTP是一類具有在膜間轉(zhuǎn)運(yùn)脂類分子活性的小分子蛋白質(zhì)(Kader，1975)。它的分子內(nèi)通常有8個(gè)保守的半胱氨酸殘基，形成4個(gè)穩(wěn)定的二硫鍵，根據(jù)不同的二硫鍵排布方式可以分為L(zhǎng)TPl和LTP2家族，通常LTPl分子量稍大一些，在9_14 kDa之間，本發(fā)明中的擬々77基因就屬于LTPl家族。而LTP2的分子量通常在7 Da左右 (Carvalho & Gomes，2007)；還有一類LTP-like的蛋白質(zhì)，盡管在一級(jí)結(jié)構(gòu)及二硫鍵排布方式上與LTP具有相似性，但分子內(nèi)存在過(guò)多的帶電氨基酸，體外沒有轉(zhuǎn)移脂質(zhì)的活性，目前只在洋蔥種子中發(fā)現(xiàn)(Cammue et al, 1995)。ZTP基因的5’端一般存在編碼信號(hào)肽的順序，在成熟蛋白中這段信號(hào)肽被剪去，故一般認(rèn)為L(zhǎng)TP存在于細(xì)胞壁中。水稻中有一個(gè)龐大的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白家族，由52個(gè)基因編碼(Boutrot et al, 2008)，但這個(gè)家族中的成員，可能具有不同的生理功能(Carvalho & Gomes，2007)。在不同物種中，LTP的功能分化非常多樣，具體報(bào)道包括參與細(xì)胞角質(zhì)層和蠟質(zhì)的合成(Kim et al, 2008; Lee et al, 2009)； 信號(hào)傳導(dǎo)和信號(hào)識(shí)別(Park et al, 2000; Blein et al, 2002);系統(tǒng)獲得性抗性信號(hào)的傳遞(Maldonado et al, 2002)；花粉粒發(fā)育過(guò)程(Li et al, 2006; Zhang et al, 2010)； 抵御病原菌感染(Ge et al, 2003; Lee et al, 2009; Sarowar et al, 2009)等。因此，該基因可能主要參與了植物體內(nèi)一些涉及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的生理過(guò)程，但這些過(guò)程可能各有不同的生理意義。本發(fā)明中的擬々/7基因參與了調(diào)節(jié)干旱脅迫下的雄配子發(fā)育過(guò)程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種受干旱誘導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因擬々77及其編碼序列，并且利用該基因?qū)λ拗髦参镞M(jìn)行遺傳上的改造，提高作物的抗逆性及缺水時(shí)的結(jié)實(shí)率。為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的一方面提供了一個(gè)新的水稻脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白的核苷酸順序，它編碼一個(gè)受干旱誘導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因擬々/7，體外功能是負(fù)責(zé)脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，體內(nèi)功能是增加水稻生殖期的抗旱性，提高產(chǎn)量。水稻擬々/7基因全長(zhǎng)U87bp，開放閱讀框 934bp,內(nèi)含子353bp ；cDNA編碼區(qū)序列長(zhǎng)!348bp。EADTl基因順序和cDNA順序分別如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示；編碼115個(gè)氨基酸，如SEQ ID NO. 3所示。本發(fā)明還提供從水稻mRNA中通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR克隆此脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因擬々77的引物序歹Ij SEQID NO. 4和SEQID NO. 5，順序如下
SEQID NO. 4 (EADTl-F) ATGTCTCAGCTCAAGTCTTCTAG SEQID NO. 5 (EADTl-R) TCAGTGTGGCCAATCAAGTG
本發(fā)明還提供含有上述水稻擬々/7基因載體的宿主。優(yōu)選地，所述宿主為真核細(xì)胞。更優(yōu)選地，所述宿主為水稻。本發(fā)明還提供一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將擬々77的核苷酸序列轉(zhuǎn)化到水稻中，提高它在水稻中的表達(dá)，以增強(qiáng)其生殖期抗旱性和結(jié)實(shí)率的方法，具體步驟如下
(1)將水稻擬々/7基因的編碼區(qū)連接于植物表達(dá)載體，形成含有水稻擬々/7基因的植物過(guò)表達(dá)載體；所用的表達(dá)載體可以為商業(yè)化或者實(shí)驗(yàn)室構(gòu)造的載體，例如PCAMBIA1301U ；
(2)將步驟(1)中的植物過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，將含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌侵染水稻愈傷，(在經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)、除菌、抗生素篩選和分化(大約4個(gè)月的時(shí)間)，獲得 7YMEADTl基因的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。這mkEADTl基因的轉(zhuǎn)基因水稻能夠提高水稻的生殖期的抗旱性和結(jié)實(shí)率。本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻中表達(dá)量的方法，主要利用熒光定量 PCR的方法。具體步驟為取轉(zhuǎn)基因水稻的葉片，用TRIzoI法抽提水稻RNA，并用DNaseI消化DNA，然后反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，以其為模板進(jìn)行熒光定量PCR進(jìn)行分析。熒光定量PCR引物核苷酸序列為SEQID N0. 6和SEQID N0. 7，如下
SEQID NO. 6 (qEADTl-F) CTGCACTGCTGATCTTCCTCCTG SEQID NO. 7 (qEADTl-R) :AGCTTCGGCCCGTCCTTCTC
本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體以及由此改造而來(lái)的其他載體，MEADTi基因編碼序列可操作地連接在表達(dá)調(diào)控序列之后，從而形成擬々77的轉(zhuǎn)基因載體。本發(fā)明中，可用熒光定量PCR技術(shù)分析^基因的表達(dá)，即分析水稻擬々77的 RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和表達(dá)量。本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果
(1)本發(fā)明提供的水稻基因及其編碼蛋白在改善植物抗逆性方面具有明顯的作用，能夠明顯提高水稻在干旱及高鹽條件下的生長(zhǎng)量，具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
(2)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到改良的含有擬々77基因的轉(zhuǎn)化植物在干旱條件下，生長(zhǎng)、 生存狀況及結(jié)實(shí)率明顯優(yōu)于野生型植物，表明了水稻擬々/7基因能夠明顯提高作物在干旱脅迫下的產(chǎn)量。(3)本發(fā)明提供的水稻擬々77基因編碼的蛋白具有在膜間轉(zhuǎn)移脂質(zhì)的活性，具有潛在的的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“擬々77的開放閱讀框”指編碼完整的水稻EADTl蛋白的核苷酸序列，如SEQ NO. 1中的核苷酸及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID NO. 2的核苷酸序列中，有一個(gè)或者多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID NO. 2的核苷酸序列的同源性低至約85%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO. 3所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQID NO. 1中核苷酸序列的同源性至少85%，更佳的90%，最佳的95%的核苷酸序列。術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與天然水稻擬々/7基因相同功能的蛋白質(zhì)的SEQ ID NO. 1 中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但不限于):若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，最佳的1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，最佳的為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。


圖1干旱脅迫條件下基因芯片及qRT-PCR鑒定水稻擬々77的表達(dá)變化。圖2水稻擬々77序列與其它物種中的同源序列的進(jìn)化分析(AT 擬南芥；OS 水稻)。圖3轉(zhuǎn)基因植株DNA水平的鑒定。其中，編號(hào)1，2為不同的過(guò)表達(dá)水稻1#，12#植株；
Rl, R2為RNA干擾植株r40，R853-1。此圖僅說(shuō)明載體已轉(zhuǎn)入宿主植物中。圖4水稻苗在不同脅迫處理(脫落酸、氯化鈉、甘露醇)下在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況。圖5水稻苗在不同脅迫處理(氯化鈉、甘露醇)下在培養(yǎng)基上的相對(duì)生長(zhǎng)速率。其中A 為在含甘露醇培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速率；B為在含氯化鈉培養(yǎng)基中的相對(duì)生長(zhǎng)速率。圖6水稻苗期^過(guò)表達(dá)及^表達(dá)干擾(RNAi)株系在干旱脅迫下的表型。圖7水稻苗期^邊魏及EADTl表達(dá)干擾(RNAi )株系在干旱脅迫下的存活率。
A為兩個(gè)過(guò)表達(dá)株系在干旱脅迫下的存活率；B為兩個(gè)RNA干擾株系在干旱脅迫下的存活率，與野生型相比，變化趨勢(shì)相反。圖8生殖期干旱脅迫下野生型及過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系12#的表型對(duì)比。圖9生殖期干旱脅迫下野生型及過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系12#花粉粒育性碘染分析。圖10生殖期干旱脅迫下野生型及過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系12#花粉粒育性百分比統(tǒng)計(jì)分析。圖11生殖期干旱脅迫后野生型及過(guò)表達(dá)株系12#的結(jié)實(shí)情況分析。圖12生殖期干旱脅迫后野生型及過(guò)表達(dá)株系12#的結(jié)實(shí)率比較。圖13 EADTl蛋白的亞細(xì)胞定位。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，均按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商建議的條件。實(shí)施例1干旱處理時(shí)水稻^基因在水稻品種日本晴生殖發(fā)育期的表達(dá)水平鑒定
1.脅迫處理
水稻日本晴種子催芽后，移到盆栽土中培養(yǎng)，在孕穗期停止?jié)菜?，進(jìn)行干旱處理，待土壤水分降低到30%左右時(shí)，維持一個(gè)禮拜，取不同大小(2 3mm，3^4mm, 4^5mm, 5^7mm)的水稻花，分別收集并編號(hào)，以正常生長(zhǎng)條件下的水稻作為對(duì)照，做三次重復(fù)。2.基因芯片及熒光定量PCR分析干旱條件下基因的表達(dá)
利用安捷倫公司的水稻芯片分析干旱條件下水稻基因的表達(dá)。比較干旱與正常情況下不同花發(fā)育時(shí)期擬々/7基因在水稻品種日本晴花的表達(dá)。結(jié)果顯示擬々77基因在干旱脅迫條件下減數(shù)分裂時(shí)期(3 4mm，Γ5πιπι)的花中上調(diào)。利用熒光定量PCR進(jìn)行表達(dá)水平驗(yàn)證， 得到的結(jié)果與基因芯片結(jié)果的變化趨勢(shì)是一致的(圖1所示)。實(shí)施例2水稻EADTl基因cDNA片段的克隆
1. RNA的提取取干旱處理的水稻花，在研缽中用液氮冷凍后研磨成粉狀，加入盛有1 ml TRIzol試劑(Promega)的EP管，充分振蕩后，室溫放置5分鐘，于4°C，12000 rpm離心 IOmin后，上清液移至新的EP管中，加上200μ1氯仿混成乳狀，室溫靜置5分鐘，12000 rpm 離心lOmin，上清液移至新的EP管中，加入兩倍體積異丙醇沉淀RNA，離心，沉淀干燥后溶解于水，然后在分光光度計(jì)上測(cè)定RNA含量。2.反轉(zhuǎn)錄按照TaKaRa公司的PrimeScript Reverse Transcriptase說(shuō)明書進(jìn)行操作離心管中加入水稻總 RNA 5 μ (5 μδ), Oligo (dT)15 Primer (50 Mmol/L) 1 μ ， dNTP (10 mmol/L) 1 μ ，并用雙蒸水加至10 μ ；瞬時(shí)離心使液體集中于管底，65°C保溫5 min，迅速在冰上冷卻2 min以上。在上述混合物中加入5XPrimeScript Buffer 4 μ ， RNase 抑制劑(40 U/μΙ) 0. 5 μ , PrimeScript Reverse Transcriptase (200 U/μΙ) 0. 5 μ ，雙蒸水加至20 μ ，離心使液體集中于管底，42°C保溫1 h，70°C滅活15 min，冰上冷卻， 得到水稻cDNA第一鏈。3. EADTl cDNA 的克隆
根據(jù)GenBank中水稻數(shù)據(jù)庫(kù)信息中提供的序列信息，設(shè)計(jì)引物(SEQ ID N0. 4)，利用上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，采用PCR方法進(jìn)行cDNA序列擴(kuò)增。通過(guò)RT-PCR得到一個(gè)包含有完整開放讀框的編碼區(qū)，長(zhǎng)度為348bp ；回收，連接到 PMD19-T載體上，并進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果顯示其與水稻注釋基因0sl0g0148000完全匹配。同時(shí)，其核苷酸序列與已知禾本科植物普通小麥的 AK331192. 1有81%同源性，和二穗短柄草的基因XM_003573684. 1有72%同源性，和大麥的基因AK372510. 1有76%同源性，與高粱的基因XM_002467303. 1有68%同源性。實(shí)施例3水稻EADTl的序列信息與同源性分析
擬々77基因編碼區(qū)的長(zhǎng)度為348bp，其序列如SEQ ID N0. 2所示。根據(jù)全長(zhǎng)cDNA推導(dǎo)出水稻EADTl的氨基酸序列，共115個(gè)氨基酸殘基，分子量為12223. 1道爾頓，等電點(diǎn)(pi) 為5. 67，其序列如SEQ NO. 3所示。生物信息學(xué)分析顯示此蛋白為不穩(wěn)定的疏水性蛋白。將此蛋白在GenBank進(jìn)行BLAST比對(duì)，獲得與此蛋白同源的蛋白序列，用Clustal X軟件進(jìn)行比對(duì)，然后用MEGA5軟件根據(jù)鄰近法構(gòu)建進(jìn)化樹(圖2)。實(shí)施例4 EADTl在水稻中過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株鑒定 1.水稻擬々77基因的表達(dá)載體構(gòu)建
根據(jù)水稻基因擬々/7的全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)上下游引物，并引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將水稻基因擬々/7的cDNA克隆至中間載體(pMD19-T載體，TAKARA)，進(jìn)一步克隆到過(guò)表達(dá)載體PCAMBIA1301U上，測(cè)序，在保證閱讀框架正確的前提下再將該過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，并轉(zhuǎn)化水稻日本晴。2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法來(lái)進(jìn)行水稻轉(zhuǎn)基因 A.誘導(dǎo)愈傷組織
1)選取成熟飽滿的種子，去掉內(nèi)外穎殼，用純凈水洗3-4次，再用70%乙醇浸泡2min， 用純凈水洗7-8次，用0. 1%的升汞處理15min，lOOrpm。2)在超凈臺(tái)中棄去升汞，用無(wú)菌水洗數(shù)次，在無(wú)菌干凈濾紙上吸干水分，置于N6D 培養(yǎng)基上，胚朝下或接觸培養(yǎng)基，28°C，暗培養(yǎng)21天。12-15粒/組培瓶。B.繼代培養(yǎng)
將愈傷周圍的胚根、胚芽剝除干凈，愈傷在干凈濾紙上晾一下，轉(zhuǎn)移至N6D繼代培養(yǎng)基上，28 °C，暗培養(yǎng)7-10天。C.前培養(yǎng)
將繼代的愈傷組織轉(zhuǎn)移至前培養(yǎng)基上，28 0C，暗培養(yǎng)3-4天。D.農(nóng)桿菌EHA105的培養(yǎng)
將上一部分實(shí)驗(yàn)中得到的正確克隆的農(nóng)桿菌菌液涂布于YEB三抗平板(鏈霉素、利福平和卡那霉素抗性)上，28°C，暗培養(yǎng)約36小時(shí)。E.侵染與共培養(yǎng)
1)將前培養(yǎng)的愈傷在無(wú)菌濾紙上晾一下，并集中轉(zhuǎn)移至平皿中。2)取滅菌小勺刮取農(nóng)桿菌4-6勺于感染用的液體培養(yǎng)基中，攪拌至懸浮均勻(無(wú)大的菌塊存在)。3)將愈傷轉(zhuǎn)至離心管中，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，靜置15 20min，期間間隔5min混勻一次。4)將菌液倒出，愈傷置于無(wú)菌濾紙上吹干約1.5小時(shí)以上，保證菌液吸干，接至共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，20 0C，暗培養(yǎng)2-3天。F.除菌
1)將共培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至50mL的離心管，用無(wú)菌水清洗3次以上，直至液體比較清亮。2)倒出無(wú)菌水，用含有500mg/L頭孢霉素的N6D液體培養(yǎng)基清洗，每次lOOrpm， 15 20min，3 4 次。3)將愈傷倒在干凈滅菌濾紙上，吸干吹干2小時(shí)以上，保證吸干。4)將干燥的愈傷轉(zhuǎn)至除菌培養(yǎng)基上，28°C，暗培養(yǎng)，7 10天。
G.篩選
將沒有被農(nóng)桿菌污染的愈傷轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基(N6D+50mg/L潮霉素B+250mg/L頭孢霉素)上，28°C，暗培養(yǎng)。每15 20天可以更換一次培養(yǎng)基，篩選時(shí)間不得少于45天。H.分化
將經(jīng)過(guò)篩選新長(zhǎng)出來(lái)的愈傷轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基(MS+ang/L 6-BA+O. 2mg/L NAA+2mg/L KT+0. 2mg/L IAA+ 50mg/L潮霉素+250mg/L頭孢霉素，16小時(shí)光培養(yǎng)。在進(jìn)行分化培養(yǎng)前，可以先將愈傷暗培養(yǎng)幾天以作為預(yù)分化。也需要定期的更換培養(yǎng)基。I.生根
將分化出來(lái)的轉(zhuǎn)基因苗Olcm高)，剝除多余的愈傷組織，并剪去根(留約0. 5cm)，移至 1/2MS培養(yǎng)基中生根。28°C, 16小時(shí)光培養(yǎng)。J.煉苗與移栽
生根結(jié)束后，可以除去生根培養(yǎng)基后，將苗泡于水中數(shù)日進(jìn)行煉苗，然后移栽入土中生長(zhǎng)。3.轉(zhuǎn)基因植株的鑒定
剪取轉(zhuǎn)基因水稻葉片，用CTAB法提取DNA，通過(guò)檢測(cè)潮霉素基因的方法鑒定轉(zhuǎn)基因情況(圖3)。并用TRIzoI法抽取葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA (方法同實(shí)例2)，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行熒光定量PCR分析轉(zhuǎn)基因水稻中擬々77基因的表達(dá)情況，具體操作按照TAKARA公司試劑盒說(shuō)明操作，熒光定量PCR儀為ABI Steponeplus .實(shí)施例5 EADTl過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性鑒定
基因芯片分析表明，EADTl基因在干旱脅迫后的花中表達(dá)明顯提高。對(duì)苗期和孕穗期 EADTl的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系(日本晴)分別進(jìn)行干旱和鹽脅迫等實(shí)驗(yàn)，觀察轉(zhuǎn)基因水稻的抗逆性，與野生型對(duì)比。1.苗期抗旱處理
把日本晴水稻種子和轉(zhuǎn)基因水稻種子，剝?nèi)ネ鈿ず螅?0%次氯酸鈉溶液消毒20分鐘后，播種在含有1/2MS以及分別含有ABA (4uM)、NaCl (150mM)、甘露醇(200mM)的1/2MS培養(yǎng)基中，觀察水稻在ABA、NaCl和甘露醇(作為干旱脅迫的模擬物)脅迫條件下的萌發(fā)及生長(zhǎng)情況。光照培養(yǎng)(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)12天后，測(cè)定水稻的生長(zhǎng)高度，以及在甘露醇中生長(zhǎng)的單株水稻的重量。水稻相對(duì)生長(zhǎng)速率等于不同處理?xiàng)l件下水稻的高度或長(zhǎng)度/正常條件下生長(zhǎng)水稻的高度或長(zhǎng)度。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)擬々/7基因的轉(zhuǎn)基因水稻在脅迫條件下的生長(zhǎng)速率明顯增加，特別是根的生長(zhǎng)速率要明顯的高于對(duì)照(圖4，5)。把5-6棵發(fā)芽的對(duì)照或者轉(zhuǎn)基因植株(日本晴和轉(zhuǎn)基因水稻)種在每個(gè)盆中(黑土 蛭石=7:3)，待水稻長(zhǎng)到5葉期時(shí)停止?jié)菜诖笈镏凶屍渌肿匀徽舭l(fā)，進(jìn)行干旱處理，大約干旱8天后，轉(zhuǎn)基因水稻的葉片的存活程度明顯較高。復(fù)水后3天，轉(zhuǎn)基因水稻變綠存活率也明顯比對(duì)照高。蒽酮法測(cè)定可溶性糖和酸性茚三酮法測(cè)定脯氨酸表明，在干旱條件下，轉(zhuǎn)基因的水稻積累大量的可溶性糖和脯氨酸，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱性(圖6，7)。2.開花前干旱處理
待水稻長(zhǎng)到減數(shù)分裂期時(shí)，實(shí)行水分自然干旱法。水稻種植在含水稻土的方形盆中，待水分蒸發(fā)至含水率15%左右，保持該含水率15天，以后恢復(fù)澆水，過(guò)表達(dá)植株存活的植株遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于對(duì)照組(圖8)，結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)擬々77能有效的提高水稻的抗旱性。3.開花期抗旱處理
孕穗期水稻實(shí)行水分自然干旱法。水稻生長(zhǎng)于方形盆的泥土中，轉(zhuǎn)入生殖生長(zhǎng)后，停止?jié)菜?，待土壤含水率降?5%左右后保持此含水率3天，測(cè)定劍葉的脯氨酸含量，并用 I2-KI進(jìn)行染色觀察水稻花粉的活性取穎殼剛剛打開，但花藥還未開裂的花，采集水稻成熟花藥，將花藥于載玻片上，加1滴蒸餾水，用鑷子將花藥搗碎，使花粉粒釋放。晾干，大約 IOmin ；加1 2滴I2-KI溶液，蓋上蓋玻片，5min ；在顯微鏡下觀察2 3個(gè)玻片，每片取 3-5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)花粉的染色率，其中深紫色的花粉為可育花粉，紅色或者黃色的為不育花粉，花粉粒育性為可育花粉數(shù)除以可育和不育花粉粒的總數(shù)所得到的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)擬々77基因的水稻在干旱條件下花粉粒的育性要明顯高于對(duì)照組的水稻(圖9，10)?；ㄆ诟珊得{迫后恢復(fù)澆水，待種子成熟后統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)率，結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻能夠改善水稻的結(jié)實(shí)率，轉(zhuǎn)基因水稻結(jié)實(shí)率高于照組(圖11，12)。實(shí)施例6煙草中分析水稻EADTl蛋白的亞細(xì)胞定位
把擬々77基因連接到瞬時(shí)表達(dá)載體p35S::EYFP上，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，用微型注射器沿著煙草葉脈把含有表達(dá)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌注射到煙草葉片中，培養(yǎng)3天后，切取注射位置的葉片在共聚焦顯微鏡下觀察并拍照片，結(jié)果顯示此蛋白定位于細(xì)胞膜和核膜周圍(圖13)。
權(quán)利要求
1.一種分離出的水稻基因，其特征在于為一種特定序列的DNA分子，長(zhǎng)1287bp， 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一種從水稻mRNA反轉(zhuǎn)錄而來(lái)的擬々/7 cDNA順序，其特征在于為一種特定序列的DNA 分子，長(zhǎng)348bp，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.—種如權(quán)利說(shuō)明要求1所述的水稻擬々/7基因編碼的蛋白質(zhì)分子，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
4.一種將權(quán)利要求1或2所述的水稻擬々77基因轉(zhuǎn)化到水稻中，增強(qiáng)水稻抗旱性和提高干旱脅迫下水稻結(jié)實(shí)率的方法，其特征在于具體步驟為(1)將編碼具有水稻擬々/7基因的開放閱讀框連接入植物轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)載體 PCAMBIA1301U ；(2 )將步驟(1)中的植物過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，然后侵染水稻愈傷，經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)、除菌、抗生素篩選和分化，獲得水稻擬々/7基因的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。
5.一種用于體外檢測(cè)擬々/7基因在植物中表達(dá)量的方法，其特征在于具體步驟為 取轉(zhuǎn)基因水稻的葉片，用TRIzoI法抽提水稻RNA，并用DNaseI消化DNA，然后反轉(zhuǎn)錄形成 cDNA，以其為模板進(jìn)行熒光定量PCR進(jìn)行分析；熒光定量PCR引物序列為SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。
6.利用如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的核苷酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)基因得到的宿主植物。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種可提高水稻生殖期抗旱性的EADT1基因，編碼序列和應(yīng)用。本發(fā)明涉及在水稻中表達(dá)的植物脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因EADT1的編碼序列，其主要作用是能夠增強(qiáng)水稻生殖期抗旱性(包括但不僅僅限于生殖期)，提高水稻結(jié)實(shí)率。本發(fā)明還包含此基因序列的重組載體，及應(yīng)用此載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。應(yīng)用本發(fā)明所涉及的基因在植物中轉(zhuǎn)化表達(dá)，可以提高轉(zhuǎn)基因水稻在干旱脅迫下的結(jié)實(shí)率，減少農(nóng)作物在干旱等逆境條件下的產(chǎn)量損失。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102533788SQ201210072118
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月19日
發(fā)明者葛曉春, 郭長(zhǎng)奎, 馬紅 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)