專利名稱：楊樹糖基轉移酶基因PtGT1在提高植物木質素含量及促進開花中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種糖基轉移酶基因的應用，尤其涉及一種楊樹糖基轉移酶基因在提高植物木質素含量及促進開花中的應用，屬于基因工程領域。
背景技術：
糖基轉移酶是專門負責催化植物分子進行糖基化修飾反應的酶，它將活性糖基從核苷糖，通常是從尿嘧啶核苷二磷酸-葡萄糖，轉移到激素、次級代謝物、病原菌侵染物以及植物內外源毒性物質等一系列植物小分子化合物受體上。糖基化會改變植物小分子化合物的生物活性、水溶性、穩(wěn)定性、在細胞內和整體植株中的運輸特性、亞細胞定位以及與受體的相互識別與結合特性，另外還能降低/除去內源和外源物質的毒性(Lim和Bowles 2004)。糖基轉移酶具有多種功能和生物活性，其作用底物廣泛，同時糖基化還能產生級聯(lián)效應，因此糖基轉移酶對植物分子的作用影響著植物生長發(fā)育的眾多方面，例如，已有報道糖基轉移酶基因參與植物激素平衡調節(jié)、植物防御反應、植物次生代謝物合成以及植物信號轉導等(Wang and Hou, 2009)。至2012年03月，按照所催化的底物的性質和序列相關性，生物界存在的糖基轉移酶被劃分成94個不同的家族。其中家族1包含的成員數(shù)量最多，與植物的關系最密切。這個家族中的酶所催化的底物是一些親脂性的小分子化合物，一個或多個糖基可以結合在這些分子的-0H、-C00H、-NH2、-SH或C-C基團上(Bowles等2005)。家族1中，有些酶在C端具有一個由44個氨基酸組成的保守序列，這一保守序列稱C末端保守區(qū)或PSPG盒(plant secondary product glycosyl transferase box)。在家族 1 中具有 C 末端保守區(qū)白勺 48%左右，推測這一保守序列可能在糖基化過程中與尿嘧啶核苷二磷酸-糖(UDP-sugar)的結合有關。這些酶的N端序列變異較大，與不同底物的識別有關。楊樹是一種具有重要商業(yè)價值與生態(tài)價值的木本植物。由于其基因組較小，易于轉化，以及生長快速等特點，使得它成為木本植物研究中的理想模型。毛果楊基因組的公布為我們研究木本植物中的糖基轉移酶基因提供了便利條件。2006年，Geisler-Lee等人預測在毛果楊中有1600多個編碼碳酸化合物的基因，其中包括大概840個糖基轉移酶，糖基轉移酶家族1是最大并且種類最多的家族，并且在楊樹中要遠遠多于擬南芥中的，或許是由于要參與木質部的形成等過程。目前為止，許多楊樹中的糖基轉移酶基因的功能已經被鑒定。例如，周功克等人在2007年從楊樹中克隆了兩個糖基轉移酶，/ ^/ ^^/ ^/ ,屬于糖基轉移酶家族8和家族43，發(fā)現(xiàn)它們和次生壁的形成以及葡糖醛酸木聚糖的生物合成有關。盡管楊樹的糖基轉移酶家族1已經在基因組水平上被鑒定，但到目前為止，楊樹糖基轉移酶家族1基因編碼序列和對植物生長發(fā)育的作用知道的很少。經檢索，楊樹糖基轉移酶家族1的基因在提高植物木質素含量及促進開花中的應用目前未見報道。

發(fā)明內容
(1)本發(fā)明的目的
針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的是提供了一種楊樹糖基轉移酶基因在提高植物木質素含量及促進開花中的應用。(2)實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術方案
本發(fā)明所述楊樹糖基轉移酶基因PtGTl在提高植物木質素含量及促進開花中的應用。其中所述糖基轉移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。所述植物是茄科植物，所述茄科植物優(yōu)選是煙草、番茄或茄子。本發(fā)明利用SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的引物序列，通過RT-PCR技術從毛白楊中克隆糖基轉移酶基因，然后利用該基因構建植物過表達載體，進行植物轉基因操作，獲得轉基因植物。檢測表明轉基因植物的木質素含量得到顯著提高，開花時期顯著提
、r -(3)本發(fā)明實施后帶來的有益效果
實驗證實，應用本發(fā)明所述楊樹糖基轉移酶基因PtGTl進行植物轉基因操作，可以顯著提高植物的木質素含量(見附圖2和附圖3)，同時還能促使植物提前開花(見附圖1)。預示本發(fā)明實施后將會創(chuàng)造新型植物，更好地滿足工農業(yè)生產的需要。


圖1.對照煙草與應用糖基轉移酶基因獲得的轉基因煙草開花時間比較。 其中WT為對照煙草，T4和T7為轉基因煙草。結果顯示在相同的光照、濕度、溫度等環(huán)境條件下轉基因煙草比對照煙草早開花。圖2.對照煙草與應用糖基轉移酶基因獲得的轉基因煙草木質素含量比較。其中WT為對照煙草，T4和T7為轉基因煙草。結果顯示T4、T7兩個轉基因煙草株系的木質素含量明顯高于對照煙草。圖3.利用Wiesner染色法檢測對照煙草與應用糖基轉移酶基因獲得的轉基因煙草的木質素含量。其中WT為對照煙草，Τ4和Τ7為轉基因煙草。結果顯示Τ4、Τ7兩個轉基因煙草株系的木質素含量明顯高于對照煙草。
具體實施例方式
實施例1 楊樹糖基轉移酶基因PtGTl的分子克隆 1.楊樹糖基轉移酶基因的克隆
取MS培養(yǎng)基上生長2-3周的楊樹試管苗，利用TRIzoI試劑盒提取其RNA，RT-PCR方法擴增全長基因，獲取其cDNA序列(1446bp)，所用的擴增引物為 GTl-a: 5’ -ATAGGATCCATGCAAAACACAAAACCTCA- 3’ ； GTl-b: 5’ -ATACCCGGGCTAGGCACCTTGAGCCTTTG -3，； 回收擴增的產物備用。2.楊樹糖基轉移酶基因的序列信息與特性分析
基因的編碼區(qū)cDNA為1446bp，編碼481個氨基酸構成的蛋白質，蛋白質分子量為66.4kDa。該基因沒有內含子，為一個連續(xù)編碼基因。序列分析發(fā)現(xiàn)，靠近蛋白質C端有一個由44個氨基酸組成的PSPG保守序列，該序列是植物次生代謝物糖基轉移酶的共同特征，表明該基因可能編碼糖基轉移酶，酶的底物是植物次生代謝的小分子物質。通過ClustalX軟件對毛白楊糖基轉移酶基因和擬南芥中已發(fā)表的40個家族1中的糖基轉移酶基因的cDNA序列進行比對，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白與擬南芥的UGT72E 亞家族的幾個糖基轉移酶相似性最高，具體講與UGT72E1、UGT72E2、UGT72E3的相似性分別達到 75%、73% 和 73%。3.楊樹糖基轉移酶基因的表達分析
取在MS培養(yǎng)基上生長3-4周的楊樹完整試管苗，分為六個部分嫩葉、老葉、上莖(莖的上部)、中莖(莖的中部)、下莖(莖的下部)和根。利用TRIzoI試劑盒分別提取它們的RNA， 應用RT-PCR方法檢測毛白楊基因在不同組織種的特異性表達情況。以WSrRNA基因作為內參基因。結果表明，基因在上莖中表達最強，在其他組織部位表達較弱。
實施例2 楊樹糖基轉移酶基因PtGTl的轉基因應用 1.含有PtGTl編碼區(qū)cDNA表達載體的構建
將帶有植物表達載體酶切位點的基因通過平末端連入feoRV單切的 pBluescriptSK質粒，形成中間載體pSKGTl。將測序正確的基因通過和SmaY從中間載體pSKGTl上切出。然后與feci酶切、補平以及酶切的植物表達載體pBI121進行連接，構成包含目的基因 PtGTl的植物表達載體pBIGTl。2.農桿菌介導得到植物轉化
挑取含載體PBIGTl的農桿菌單菌落于YEB培養(yǎng)基中，內含抗生素50mg/L卡那霉素 (敘11)、501^/1利福平(財￡)，觀1搖床中，200印111培養(yǎng)4 1左右；待菌體搖起后，轉移^il 的菌體到50ml的YEB培養(yǎng)基中，搖床中，200rpm培養(yǎng)。當菌體OD6tltl為0. 6-0. 8左右時，4°C，3500rpm，離心10_15min，收集菌體。沉淀用5_10ml的MS液體培養(yǎng)基懸起后，離心收集，此過程重復兩次。最后用25-30ml的MS液體培養(yǎng)基懸起，用于浸染。將上述制好的農桿菌浸染液倒入無菌培養(yǎng)皿中，把煙草鮮嫩葉片切成大概1平方厘米放入其中，使葉片充分接觸菌液，浸染20min，期間不斷輕輕搖動，利于提高浸染效率。浸染完成后，把葉片移入準備好的無菌濾紙上，充分吸去菌體液，然后移入到煙草生芽培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+0. 2mg/ L IAA+2mg/L 6-BA +30g/L蔗糖+7g/L瓊脂)中，封口，培養(yǎng)室中(25°C )，暗培養(yǎng)2_3天。暗培養(yǎng)結束后，把葉片放入MS液體培養(yǎng)基中，輕輕漂洗，然后用無菌濾紙吸干其上的液體，然后把葉片放入帶有抗生素(500mg/L頭孢霉素，100mg/L Kan)的生芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件25°C，每天光照16h。2-3周后，把生成的小芽移入到帶有相同抗生素的生根培養(yǎng)基(MS 培養(yǎng)基+lOmg/L VB1 +0. 2mg/L NAA +30g/L蔗糖+7g/L瓊脂)中培養(yǎng)。在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3周后，植株大小合適，進行分子鑒定，鑒定后再移入營養(yǎng)土中進行生理指標等分析。3.轉基因植株分子鑒定
取適當大小的轉基因煙草試管苗的葉片，提取其總DNA，進行PCR驗證，初步獲得陽性轉基因煙草株系。提取PCR驗證為陽性的株系的RNA,RT-PCR方法檢測表達量情況。Actin基因作為內參基因。獲得高表達外源基因的兩個轉基因株系T4和T7。
PtGTl基因提高木質素含量和促進開花的功能驗證
木質素含量的測定采用Klason方法和Wiesner染色方法。Klason木質素含量測定方法的操作是待測莖段先切成薄片，放在玻璃器皿中，放入80°C烘箱烘過夜。次日，用液氮磨成細粉后，烘干至恒重。烘干的細粉用有機溶劑甲醇抽提四次，然后用水抽提兩次，放 60-70°C烘箱中過夜，烘干。稱取200mg的烘干物在細1的72%的硫酸中，30°C水解Ih。水解反應完成后，用112ml的水稀釋，然后在沸水浴中放置lh。沸水浴完成后，溶液過濾，用熱水沖洗，至濾液不呈酸性，放入70°C的烘箱中過夜，烘干，最后稱重。由測定結果可知轉基因煙草株系中的木質素含量顯著高于野生型煙草的木質素含量，說明基因具有提高木質素含量的作用(附圖2)。Wiesner染色方法的操作是轉基因煙草與野生型煙草的莖段徒手切片，置于載玻片上，先加一滴(v/v)的間苯三酚，幾秒后，再加一滴6mol/L的鹽酸，數(shù)秒后顯色，解剖鏡下觀察，拍照。由染色結果可知野生型煙草木質部的染色明顯淺于轉基因煙草株系， 說明轉基因煙草株系中的木質素含量多于野生型煙草的木質素含量(附圖3)。植物開花時間的測定方法是-.PtGTl轉基因煙草和普通野生型煙草的每個株系分別在培養(yǎng)室中培養(yǎng)15棵。在相同的溫度，濕度等培養(yǎng)環(huán)境下生長。每棵煙草開花后，統(tǒng)計其開花所需天數(shù)。測定結果表明，在我們的培養(yǎng)條件下，轉基因煙草通常在120天左右開花， 非轉基因的對照煙草通常在70天左右開花，說明PtGTl基因具有促進植物開花的作用(附圖1)。
權利要求
1.楊樹糖基轉移酶基因在提高植物木質素含量及促進開花中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于所述糖基轉移酶基因的核苷酸序列如 SEQ ID No. 1 所示。
3.如權利要求1所述的應用，其特征在于所述植物是茄科植物。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述茄科植物是煙草、番茄或茄子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種楊樹糖基轉移酶基因PtGT1在提高植物木質素含量及促進開花中的應用，其中所述糖基轉移酶基因PtGT1的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其是通過RT-PCR技術從毛白楊中克隆的。本發(fā)明利用基因PtGT1構建植物過表達載體，進行植物轉基因操作，獲得轉基因植物。檢測表明轉基因植物的木質素含量得到顯著提高，同時還能促使植物提前開花，預示本發(fā)明實施后將會創(chuàng)造新型植物，更好地滿足工農業(yè)生產的需要。
文檔編號A01H5/00GK102533849SQ201210081689
公開日2012年7月4日 申請日期2012年3月26日 優(yōu)先權日2012年3月26日
發(fā)明者侯丙凱, 王艷文 申請人:山東大學