專利名稱：滋養(yǎng)節(jié)桿菌Ar13及其作為植物根際促生菌的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及滋養(yǎng)節(jié)桿屬菌株及其應(yīng)用，具體地,涉及滋養(yǎng)節(jié)桿菌(Arthrobacterpascens) Ar 13及其作為植物根際促生菌的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，農(nóng)藥和化肥的大量使用在提高作物產(chǎn)量的同時(shí)也產(chǎn)生了極大的環(huán)境問題，使用植物根際促生菌作為生物肥料，被視為ー種可減少農(nóng)業(yè)化肥的替代品。隨著現(xiàn)代生物科學(xué)技術(shù)的進(jìn)歩，人們對(duì)微生物-植物共生系統(tǒng)給予了高度重視，并在多個(gè)方面有廣泛的研究與應(yīng)用植物根際環(huán)境中的微生物與植物存在共生關(guān)系，表現(xiàn)在植物的生長發(fā)育、營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用、病害控制等方面，通過調(diào)整根際環(huán)境中的有益微生物菌株數(shù)量與質(zhì)量，即可實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)。植物根際促生菌(Plantgrowth-promoting rhizobacteria,簡稱 PGPR),是寄居于植物根際、根表的微生物，能夠直接或間接的促進(jìn)植物的生長和發(fā)育。PGPR以其特有的病害生防潛力和對(duì)生態(tài)環(huán)境的維護(hù)作用，近年來已受到國內(nèi)外越來越多的青睞。傳統(tǒng)的研究主要研究有益菌株的活體應(yīng)用能力，現(xiàn)代研究則趨向于利用生物技術(shù)研究促生和生防機(jī)制，了解其促生功能的本質(zhì)，從而為更加合理有效地應(yīng)用PGPR開辟了更加廣闊的空間。目前，已從土壌中分離的根際細(xì)菌中獲得了大量的植物根際促生菌，尤以熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)在很多植物的根際都占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì),可達(dá)60% -93%的比例。澳大利亞、美國、歐盟合作組織、日本等多個(gè)國家都開展了 PGPR的專項(xiàng)研究，也在促進(jìn)植物生長、増加作物產(chǎn)量，有效地用于植物病害的生物防治方面積累了大量的事實(shí)。有關(guān)植物根際促生菌制劑的研究與應(yīng)用尤為活躍，主要涉及促進(jìn)植物生長和防治作物病蟲害這兩個(gè)方面。促生作用指PGPR合成的次生代謝產(chǎn)物等增強(qiáng)植物對(duì)營養(yǎng)元素、水分的吸收。同吋，PGPR可通過對(duì)病原微生物的生物防治，減輕或抑制有害根際微生物間接促進(jìn)植物生長。PGPR對(duì)病原菌的作用機(jī)制則主要有競(jìng)爭(zhēng)和定殖、產(chǎn)嗜鐵素、抗生作用、系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性等。目前，國內(nèi)外PGPR制劑應(yīng)用廣泛，最早成功地應(yīng)用和商業(yè)化生產(chǎn)的PGPR是枯草芽飽桿菌A13，A13能抑制植物病原菌，促進(jìn)多種植物生長，用A13處理種子，可以提高胡蘿卜產(chǎn)量48%，燕麥產(chǎn)量33%和花生產(chǎn)量37%。商業(yè)化最成功的產(chǎn)品是Agrobacteriumradiobacter K84,目前美國上市的突光假單孢菌類PGPR生物制劑就有8種以上。節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)為革蘭氏陽性菌,在自然界中廣泛存在,模式種為球形節(jié)桿菌(Artrobacter globiformis)。節(jié)桿菌在生活史中細(xì)胞形態(tài)有顯著變化,幼齡菌體完全或大部分是桿狀或不規(guī)則桿狀，老細(xì)胞則縮短為球形或類球形；呼吸代謝，從不發(fā)酵代謝；可利用葡萄糖或其他糖產(chǎn)生少量酸或不產(chǎn)酸；接觸酶陽性；細(xì)胞壁不含有消旋ニ氨基庚ニ酸和阿拉伯糖；專性好氧菌，通常生長在加生物素的簡單培養(yǎng)基中，氧化代謝。最適 生長溫度20 35°C ;節(jié)桿菌屬菌種可應(yīng)用于有機(jī)物污染的土壤修復(fù)、提高植物氮磷鉀營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、可促進(jìn)植物生長提高產(chǎn)量等。該菌屬的部分菌種還可產(chǎn)生黃嘌呤氧化酶、脂肪酶、煙堿脫氫酶和谷胺酰胺合成酶，在エ業(yè)上有較高的應(yīng)用價(jià)值。小麥紋枯病(Rhizoctonia cerealis)又稱立枯病、尖眼斑病,主要發(fā)生在世界各溫帶小麥區(qū)。病田病株率一般為10% -20%，輕者可減產(chǎn)5% -10%，重者減產(chǎn)20% -40%,并造成枯孕穗、枯白穗，更嚴(yán)重的是導(dǎo)致田區(qū)顆粒無收。防治小麥紋枯病主要采用化學(xué)防治技木，即噴灑農(nóng)藥，以三唑類藥劑及井R霉素為主。然而，化學(xué)藥劑雖能有效防治病害，但對(duì)小麥產(chǎn)量仍存在不同程度負(fù)面影響，且化學(xué)藥劑的使用不可避免帶來土壤環(huán)境的污染和藥物殘留問題。國內(nèi)外關(guān)于節(jié)桿菌屬菌株作為PGPR菌株，尤其是作為小麥紋枯病的生防菌株及其表現(xiàn)出的優(yōu)良促生作用的研究幾乎為空白，在菌株的作用機(jī)制及應(yīng)用方面也比較落后，因此該菌屬菌株的研究，尤以其促生防病潛能為開發(fā)和利用生物肥料及農(nóng)藥的理論和應(yīng)用上的支持，具有深遠(yuǎn)的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)、生態(tài)價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー株對(duì)植物具有生物防病和促生作用的滋養(yǎng)節(jié)桿菌及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的菌株Arl3于2012年3月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCCJii :北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5853，分類名為滋養(yǎng)節(jié)桿菌(Arthrobacterpascens)。滋養(yǎng)節(jié)桿菌Arl3為革蘭氏染色陽性，菌株Arl3在NA培養(yǎng)基(牛肉膏5g/l，蛋白胨10g/l，NaCl 5g/l，瓊脂15g/l)上培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中有明顯桿、球狀周期變化。菌體長橢圓形，具有一根極生鞭毛，最適生長溫度28°C，pH中性，其單菌落在NA培養(yǎng)基上為淺白色菌落，發(fā)亮白色光澤。本發(fā)明提供了含有滋養(yǎng)節(jié)桿菌Arl3的菌劑。進(jìn)ー步,本發(fā)明提供了含有滋養(yǎng)節(jié)桿菌Ar 13的生物肥料。本發(fā)明提供滋養(yǎng)節(jié)桿菌Arl3或含有滋養(yǎng)節(jié)桿菌Arl3的菌劑和生物肥料在促進(jìn)植物生長中的應(yīng)用。本發(fā)明提供滋養(yǎng)節(jié)桿菌Arl3或含有滋養(yǎng)節(jié)桿菌Arl3的菌劑和生物肥料在抑制植物病原微生物中的應(yīng)用。其中,所述的植物病原微生物為小麥紋枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、西瓜枯萎菌(Fusarium ox ysporum f. sp. niveum)、桃褐腐病菌(Monilinia Iaxa)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)和/成小長隊(duì)霉菌(Ceratocystis fimbriata)。本發(fā)明提供滋養(yǎng)節(jié)桿菌Arl3或含有滋養(yǎng)節(jié)桿菌Arl3的菌劑在制備植物促生劑中的應(yīng)用。本發(fā)明提供滋養(yǎng)節(jié)桿菌Arl3或含有滋養(yǎng)節(jié)桿菌Arl3的菌劑在制備植物防病劑中的應(yīng)用。 其中，所述的植物為綠豆、大豆和/或小麥。本發(fā)明提供了滋養(yǎng)節(jié)桿菌Arl3或含有滋養(yǎng)節(jié)桿菌Arl3的菌劑在制備生物肥料中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了以滋養(yǎng)節(jié)桿菌Arl3為有效成分的制劑在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的滋養(yǎng)節(jié)桿菌菌株Arl3對(duì)多種植物病原菌具有明顯的抑制作用，同時(shí)對(duì)植物生長具有顯著的促進(jìn)作用，能夠促進(jìn)作物的生長和產(chǎn)量提高，對(duì)平板、溫室小麥紋枯病的防治效果分別為94. 20%,46. 60% ;與清水相比使緑豆根伸長量、鮮重量，莖長伸長量分別增加297%、35. 3%,111% ;溫室中對(duì)小麥、大豆的促生效果均高于井網(wǎng)霉素及植物生長素IAA-10_V g/ml稀釋液。本發(fā)明提供的菌株Arl3及其菌劑在使用過程中無污染，無公害，可廣泛應(yīng)用于植物病害生物防治和促生領(lǐng)域，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。


圖I為Arl3 16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中泳道I為電泳所用的Marker，泳道2為陰性對(duì)照，泳道3為Arl3菌株電泳結(jié)果。圖2為Ar 13菌株的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育地位。圖3為菌株Arl3在脫脂牛奶平板上產(chǎn)蛋白酶檢測(cè)。圖4為菌株Ar 13在CAS平板上產(chǎn)嗜鐵素檢測(cè)。圖5為Arl3對(duì)小麥紋枯病平板防治效果圖，其中A :小麥紋枯病菌；B :陰性對(duì)照；C :20*%井網(wǎng)霉素；D Ar 13圃液。圖6為Arl3對(duì)小麥紋枯病溫室防治效果圖，其中A :小麥紋枯病囷；B :陰性對(duì)照；C :20*%井網(wǎng)霉素；D Ar 13圃液。圖7為滋養(yǎng)節(jié)桿菌Ar 13在DF (+Trp)和DF (-Trp)液體培養(yǎng)基中的產(chǎn)IAA能力圖，其中菱形表示Arl3菌株在DF(+Trp)中產(chǎn)IAA能力，三角形表示Arl3菌株在DF(-Trp)中產(chǎn)IAA能力。圖8為滋養(yǎng)節(jié)桿菌Arl3對(duì)綠豆的促生效果圖，其中從左向右處理依次編號(hào)為1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 ;其中 I :清水、2 =Ar13 菌液的 IAA 稀釋液 10'3 :10べ、4 :10'5 10'6 :10'7 :10'8 :10'9 :10'10 :10'11 :10'12 =IO^1V g/ml 濃度。圖9為滋養(yǎng)節(jié)桿菌Ar 13對(duì)溫室盆栽大豆的促生效果圖，其中A :IAA_10_V g/ml ；B Arl3 ；C :陰性對(duì)照(清水)。圖10為滋養(yǎng)節(jié)桿菌Arl3對(duì)小麥的促生效果圖，其中A :IAA-10_V g/ml ；B Arl3 ；C :陰性對(duì)照(清水)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例I滋養(yǎng)節(jié)桿菌Arl3菌株的培養(yǎng)和鑒定I、菌株的分離和培養(yǎng)從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)桓臺(tái)縣華北集約化農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)試驗(yàn)站小麥實(shí)驗(yàn)田中采集表層6cm土樣,取5g的土溶解到在45ml無菌生理鹽水的三角瓶中，28°C, 120rpm搖床震蕩IOmin后靜止lOmin，取100 u I的上清液加入到裝有900 U I生理鹽水的Eppendorf管中，進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋。分別取以上土壤懸浮液和10_2，IO-3, IO-4倍土壤懸浮液稀釋液100 Ul在NA培、養(yǎng)基(牛肉膏5g/l，蛋白胨10g/l，NaCl 5g/l，瓊脂15g/l)平板上均勻涂板，超凈工作臺(tái)內(nèi)吹干，每個(gè)濃度重復(fù)3次，28°C溫箱內(nèi)培養(yǎng)36h，用無菌牙簽挑取細(xì)菌單菌落劃線純化，將分離的菌株命名為Ar 13。2、菌株的鑒定I. I菌體形態(tài)特征革蘭氏染色陽性，菌株Arl3培養(yǎng)過程中有明顯桿、球狀周期變化。菌體長橢圓形，具有一根極生鞭毛。I. 2生理生化特性將分離純化的菌株Arl3進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果顯示分離菌株為革蘭氏陽性菌，嚴(yán)格好氧，其過氧化酶、氧化酶、葡萄糖氧化產(chǎn)酸產(chǎn)氣、硝酸鹽還原、果糖利用、a -半乳糖酶、明膠液化、卵磷脂酶均稱陽性反應(yīng)，淀粉水解、脲酶利用、反硝化、酯酶、精氨酸雙水解、檸檬酸鹽利用、酒石酸鹽利用、VP測(cè)定均稱陰性反應(yīng)(見表I);可以利用D-半乳糖、松ニ糖、D-棉子糖、D-蜜ニ糖、D-果糖、D-甘露糖、a -環(huán)糊精、L-阿拉伯糖、糊精、吐溫40、吐溫80、a -D-葡萄糖、蔗糖、甲基丙酮酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸、糖原、D-阿洛酮糖18種碳源，對(duì)こ酸、丙酸、甘油、赤藻糖醇等65種碳源不能利用，對(duì)纖維ニ糖、D-海藻糖、腺 苷等12種碳源的利用處于臨界狀態(tài)。表I、Ar 13生理生化特性
權(quán)利要求
1.滋養(yǎng)節(jié)桿菌(Arthrobacterpascens)菌株 Arl3,其保藏編號(hào)為 CGMCC No. 5853。
2.含有權(quán)利要求I所述滋養(yǎng)節(jié)桿菌Arl3的菌劑。
3.含有權(quán)利要求I所述滋養(yǎng)節(jié)桿菌Arl3的生物肥料。
4.權(quán)利要求I所述的滋養(yǎng)節(jié)桿菌Arl3或權(quán)利要求2所述的菌劑或權(quán)利要求3所述的生物肥料在促進(jìn)植物生長中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求I所述的滋養(yǎng)節(jié)桿菌Arl3或權(quán)利要求2所述的菌劑或權(quán)利要求3所述的生物肥料在抑制植物病原微生物中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的植物病原微生物為小麥紋枯病菌(Rhizoctonia cereal i s)、西瓜ネ古妻菌(Fusarium ox ysporum f. sp. niveum ノ 、杉匕 1 腐病菌(Monilinia Iaxa)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)和小長_霉菌(しeratocystis Iimbriataノ。
7.權(quán)利要求I所述的滋養(yǎng)節(jié)桿菌Arl3或權(quán)利要求2所述的菌劑在制備植物促生劑中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求I所述的滋養(yǎng)節(jié)桿菌Arl3或權(quán)利要求2所述的菌劑在制備植物防病劑中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求4-8任一所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的植物為綠豆、大豆和/或小麥。
10.權(quán)利要求I所述的滋養(yǎng)節(jié)桿菌Ar13或權(quán)利要求2所述的菌劑在制備生物肥料中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株滋養(yǎng)節(jié)桿菌Ar13(Arthrobacter pascens)及其作為植物根際促生菌的應(yīng)用。本發(fā)明的菌株Ar13保藏編號(hào)為CGMCC No.5853，該菌株及含有該菌株的菌劑具有促生防病的效果，能夠促進(jìn)作物的生長和產(chǎn)量提高，對(duì)平板、溫室小麥紋枯病的防治效果分別為94.20％、46.60％；與清水相比使綠豆根伸長量、鮮重量，莖長伸長量分別增加297％、35.3％、111％；溫室中對(duì)小麥、大豆的促生效果均高于井岡霉素及植物生長素IAA-10-8μg/ml稀釋液。本發(fā)明提供的菌株Ar13及其菌劑在使用過程中無污染，無公害，可廣泛應(yīng)用于植物病害生物防治和促生領(lǐng)域，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
文檔編號(hào)C05F11/08GK102643766SQ20121010373
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月10日
發(fā)明者吳文良, 夏娜, 孫真, 李磊, 焦子偉, 郭巖彬 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)