專利名稱：一種五爪龍的快速繁殖方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物工程領域，涉及植物組織培養(yǎng)技術，具體地說是一種五爪龍的組織培養(yǎng)方法。
背景技術：
植物是藥物的天然寶庫，人們利用藥用植物的歷史源遠流長，全世界約有75%的人口以植物作為治療預防疾病的藥物來源(邢建民，2001)。人類已經(jīng)從植物中發(fā)現(xiàn)了許多具有高度生理活性的藥物，目前從植物來源的藥物占藥物總量的25%以上(鄭光植， 1987)。我國的傳統(tǒng)中草藥已有數(shù)千年的歷史，至今仍在我國和許多國家和地區(qū)廣為使用。 但由于傳統(tǒng)的中草藥獲取方法是以采集和消耗大量的野生植物資源為代價的，當采集和消耗量超過自然資源的再生能力時，必然會導致物種的瀕危甚至滅絕。同時隨著自然生態(tài)環(huán)境的日益破壞，也進一步導致藥用植物資源的匱乏。生物技術的蓬勃發(fā)展為從根本上改變傳統(tǒng)藥材的生產提供了一個嶄新的方法，植物組織和細胞培養(yǎng)技術則是其中一個重要的手段。我國自1964年羅士韋教授首先報道了人參組織培養(yǎng)獲得成功的研究成果以來，許多科學家先后從事了多種藥用植物的組織培養(yǎng)研究。至今，我國藥用植物的組織培養(yǎng)研究迅速發(fā)展。目前，世界各國對植物的藥用開發(fā)和研究都十分重視，就以美國來說，其成藥中有 47%是以植物為原料制成的(謝啟昆，1986)。為了解決藥用植物的供需矛盾，人們采用人工栽培的方法擴大藥源。但在人工栽培的藥用植物中，有不少名貴藥材等生產周期較長，如人參、黃連，如果以常規(guī)方法育種或育苗，需要花費很長的時間；另有一些藥用植物如貝母、 番紅花等，因繁殖系數(shù)小、耗種量大，導致育種速度很慢，生產成本增加。利用植物的有性繁殖方式對其有效成分含量波動比較大，所以利用植物組織培養(yǎng)技術解決藥用植物的植株再生與繁殖問題迫在眉睫。近年來，國內外在這方面已做了大量工作，已成功離體培養(yǎng)獲得試管植株的藥用植物至少有200種，如云南黑節(jié)草、延齡草、高山紅景天、莪術、水母雪蓮、星花繡線菊、溪黃草、玉葉金花、遼東榴木等；其中包括一些具有抗癌有效成分的珍稀植物，如紅豆杉、艾、黃楊、大戟屬植物、長春花、米仔蘭、狗牙花和香榧等。五爪龍,又名土五加皮、土黃苗,屬于?？?。灌木或小喬木,高2-8m.全株有乳汁； 嫩技中空，枝、葉、葉柄和花序托(榕果)均被金黃色廣展的長硬毛。單葉互生；葉柄粗壯，長 2-7cm;托葉卵狀被針形，長l-3cm，膜質，紅色，被柔毛；葉片多型，卵狀橢圓形、長圓狀被針形或倒卵狀被針形，長8-25cm，寬4-18cm，先端漸尖或短尖，基部狹，渾圓形或心形，邊緣有鋸齒，全線或3-5深裂，葉表面粗糙，疏生短硬毛，下面除金黃色長硬毛外，有時密生柔毛， 基生脈3-7條，側脈5-7對。隱頭花序成對腋生或生于已落葉枝的葉腋，呈球形或橢圓球形， 無柄或近無柄，直徑8-20_，幼時頂部苞片形成臍狀突起，基生苞片卵狀披外形，長l-3cm， 紅色，被長硬毛；雄花、癭花生于同一花序托中，雄花著生近口部，有梗，花被片4，雄蕊2-3 ； 癭花花被片與雄花同數(shù)，子房球形，花柱短，側生；雌花生于另一植株花序托中，球形，花被片4，有梗或無梗。瘦果，表面有小瘤體，花柱側生，柱頭棒狀。花、果期3-11月。主要是其根入藥，根中含有機酸、氨基酸、三萜、香豆精、生物堿等，主要用于祛風除濕；祛瘀消腫。主風濕痿痹；腰腿痛；痢疾；水腫；帶下；瘰疬；跌打損傷；經(jīng)閉；乳少。因此，為了滿足日益增大的藥用需求，種子收獲量小，種子繁殖出苗率極低，種子培育過程煩瑣，生長速度慢，入藥部分主要是根莖，對野生五爪龍破壞嚴重，同時也為了保護五爪龍的野生資源，利用組培快繁技術，實現(xiàn)人工栽培是最好的解決方法。迄今為止，在國內外尚未見關于五爪龍組織培養(yǎng)快繁成功的報道。我們通過大量試驗，終于摸索出一套成熟的方法，成功實現(xiàn)了五爪龍的組培快繁，可以快速培育出大量幼苗，為實現(xiàn)工業(yè)化人工栽培五爪龍?zhí)峁┛赡?。五爪龍的組培快繁技術方法的成功建立，可以為大規(guī)模人工栽培藥用植物五爪龍?zhí)峁┓N苗，為現(xiàn)代科技農業(yè)提供了一種切實可行的開發(fā)項目。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供五爪龍的快速繁殖方法，該方法非常適合工業(yè)化生產，配方效果佳，出芽率高，培養(yǎng)時間短，植株生長旺盛，可操作性強，應用價值高等優(yōu)點。具有投入少，產出高的特點。本發(fā)明所述五爪龍的快速繁殖方法，其具體操作步驟如下I)外植體的選取與滅菌選用五爪龍的莖段作為培養(yǎng)材料，經(jīng)洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗10-30分鐘后，置于75%酒精中處理10-30秒，然后再經(jīng)O. I %的升汞消毒后用無菌水沖洗，切去外植體變色的部分后備用；2)芽體的萌發(fā)將滅菌處理后的莖段接種在LS+6-BA1. 2mg/L+NAA0. 2mg/L培養(yǎng)基上，pH值為5. 8，培養(yǎng)溫度23-27°C，每天光照12小時，光照強度1000LX，接種后6_8天莖段腋芽的萌發(fā)，10天左右形成帶葉的小苗；3)叢生芽誘導和增殖培養(yǎng)將小苗切下轉接于LS+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L培養(yǎng)基上，直至形成叢生芽，PH值為5. 8，培養(yǎng)溫度23-27 °C，每天光照16小時，光照強度 1000LX。30天左右為一個生長周期，以保持高速度遞增，增殖系數(shù)為5以上；4)生根培養(yǎng)選擇 LS+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L+NAA O. 5mg/L 作為生根培養(yǎng)基， pH值為5. 8，培養(yǎng)溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX，生根率達到90%以上， 只需要25天左右形成完整植株；5)試管苗的移栽選取根系生長良好的試管苗，放入清水中把根部的瓊脂清洗干凈，移載到沙土或富養(yǎng)土中，注意保水保溫保濕，移載I個月后，移載成活率達到90%以上；在一個具體實施方案中，步驟I中采用O. I %升汞進行消毒，消毒時間控制優(yōu)選在 7-15分鐘。技術效果(I)利用五爪龍帶芽根莖段為外植體，使得外植體取材較容易，一年四季均可取材，而且數(shù)量多，采用莖段做外植體，保證了遺傳穩(wěn)定性，同時克服了組織培養(yǎng)中，愈傷組織在分化培養(yǎng)基上隨著芽的分化而逐漸停止生長，失去增殖能力的弱點，可防止傷組織繼代培養(yǎng)過程中，隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加，分化出來的苗出現(xiàn)變異的現(xiàn)象。(2)本發(fā)明方法利用外植體建立，增殖生根同步化這一技術路線，僅需30天左右形成完整植株，4-6個月內事獲得大量完整植株，實現(xiàn)五爪龍的大規(guī)模工廠化育苗。(3)本發(fā)明方法獲得的試管苗在移載時所采用的基質利用沙土，方法簡單，而且大大降低了移載成本。本培養(yǎng)方法出芽快，增殖率高，方法簡單，生產成本低，可批量生產，應用價值高。(4)五爪龍的生產可以在人為控制條件下進行，不受季節(jié)、氣候條件與土壤等因素的制約，可排除病蟲害的侵襲和農藥殘留的影響，嚴格控制五爪龍的質量。增殖速度快，生產周期短，設備簡單，占地面積少，能節(jié)省人力、物力等，便于工廠
化生產。(5)使用本發(fā)明提供的組培快繁技術得到的五爪龍幼苗進行人工栽培，可以得到個體差異小，品質均一的五爪龍成品。(6)可以保存五爪龍的種質資源，同時有利于保護五爪龍野生資源，減少對自然資源的破壞。
具體實施例方式下面，本發(fā)明將用實施例進行進一步的說明，但是它并不限于這些實施例的任一個或類似實例。實施例I :取材五爪龍帶腋芽莖段為外植體I、外植體的選取與滅菌采自湖南張家界的五爪龍鮮嫩芽莖段等幼嫩組織，作為培養(yǎng)材料，經(jīng)洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗10-30分鐘后，置于75%酒精中處理 10-30秒，然后再經(jīng)O. I %的升汞消毒10分鐘后用無菌水沖洗，切去外植體變色的部分后備用。2、芽體的萌發(fā)將滅菌處理后的芽體接種在LS+6-BA1. 2mg/L+NAA0. 2mg/L培養(yǎng)基上，pH值為5. 8，培養(yǎng)溫度23-27°C，每天光照12小時，光照強度1000LX ;接種后6_8天芽體的萌發(fā)，10天左右形成帶葉的小苗。3、叢生芽誘導和增殖培養(yǎng)將小苗切下轉接于LS+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L培養(yǎng)基上，直至形成叢生芽，PH值為5. 8，培養(yǎng)溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度 1000LX。30天左右為一個生長周期，以保持高速度遞增，增殖系數(shù)為5以上。4、生根培養(yǎng)選擇 LS+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L+NAA O. 5mg/L 作為生根培養(yǎng)基， pH值為5. 8，培養(yǎng)溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX，生根率達到90%以上， 只需要25天左右形成完整植株。5、試管苗的移栽選取根系生長良好的試管苗，放入清水中把根部的瓊脂清洗干凈，移載到沙土中，注意保水保溫保濕，移載I個月后，移載成活率達到90%以上。6、后期管理4月份左右移植大田后，6-9月份用兩層遮陽網(wǎng)進行覆蓋，并采用滴管方式進行補水，進入11月份后用地膜進行保溫保水，到第二年3月份左右去除地膜，采用以上方式進行五爪龍栽培管理。若發(fā)生黑斑病，用70%甲基托布津濕性粉劑1000倍液噴灑。有時有根結線蟲病危害，用3%呋喃丹顆粒劑灌施盆土。若缺肥時在花后至8月中旬施 I次磷肥。實施例2:取材五爪龍帶芽根莖段為外植體I、外植體的選取與滅菌采自湖南張家界的五爪龍鮮嫩芽莖段等幼嫩組織，作為培養(yǎng)材料，經(jīng)洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗10-30分鐘后，置于75%酒精中處理 10-30秒，然后再經(jīng)O. I %的升汞消毒10分鐘后用無菌水沖洗，切去外植體變色的部分后備用。2、芽體的萌發(fā)將滅菌處理后的芽體接種在LS+6-BA1. 2mg/L+NAA0. 3mg/L培養(yǎng)基上，pH值為5. 8，培養(yǎng)溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX ;接種后7_8天芽體的萌發(fā)，12天左右形成帶葉的小苗。3、叢生芽誘導和增殖培養(yǎng)將小苗切下轉接于LS+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L培養(yǎng)基上，直至形成叢生芽，PH值為5. 8，培養(yǎng)溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度 1000LX。30天左右為一個生長周期，以保持高速度遞增，增殖系數(shù)為5以上。4、生根培養(yǎng)選擇 LS+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L+NAA O. 5mg/L 作為生根培養(yǎng)基， pH值為5. 8，培養(yǎng)溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX，生根率達到90%以上， 只需要25天左右形成完整植株。5、試管苗的移栽選取根系生長良好的試管苗，放入清水中把根部的瓊脂清洗干凈，移載到富養(yǎng)土中，注意保水保濕，移載I個月后，移載成活率達到90%以上。6、后期管理4月份左右移植大田后，6-9月份用兩層遮陽網(wǎng)進行覆蓋，并采用滴管方式進行補水，進入11月份后用地膜進行保溫保水，到第二年3月份左右去除地膜，采用以上方式進行五爪龍栽培管理。若發(fā)生黑斑病，用70%甲基托布津濕性粉劑1000倍液噴灑。有時有根結線蟲病危害，用3%呋喃丹顆粒劑灌施盆土。若缺肥時在花后至8月中旬施 I次磷肥。實施例3 取材五爪龍帶芽根莖段為外植體I、外植體的選取與滅菌采自湖南張家界的五爪龍鮮嫩芽莖段等幼嫩組織，作為培養(yǎng)材料，經(jīng)洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗10-30分鐘后，置于75%酒精中處理 10-30秒，然后再經(jīng)O. I %的升汞消毒10分鐘后用無菌水沖洗，切去外植體變色的部分后備用。2、芽體的萌發(fā)將滅菌處理后的芽體接種在LS+6-BA1. 2mg/L+NAA0. 2mg/L培養(yǎng)基上，pH值為5. 8，培養(yǎng)溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX ;接種后6_8天左右芽體的萌發(fā)，10天左右形成帶葉的小苗。3、叢生芽誘導和增殖培養(yǎng)將小苗切下轉接于LS+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L培養(yǎng)基上，直至形成叢生芽，PH值為5. 8，培養(yǎng)溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度 1000LX。30天左右為一個生長周期，以保持高速度遞增，增殖系數(shù)為5以上。4、生根培養(yǎng)選擇LS+6-BA0. 5mg/L+NAA O. 5mg/L作為生根培養(yǎng)基，pH值為5. 8，培養(yǎng)溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX，生根率達到95%以上，只需要20天左右形成完整植株。5、試管苗的移栽選取根系生長良好的試管苗，放入清水中把根部的瓊脂清洗干凈，移載到沙土中，注意保水保濕，移載I個月后，移載成活率達到85%以上。6、后期管理4月份左右移植大田后，6-9月份用兩層遮陽網(wǎng)進行覆蓋，并采用滴管方式進行補水，進入11月份后用地膜進行保溫保水，到第二年3月份左右去除地膜，采用以上方式進行五爪龍栽培管理。若發(fā)生黑斑病，用70%甲基托布津濕性粉劑1000倍液噴灑。有時有根結線蟲病危害，用3%呋喃丹顆粒劑灌施盆土。若缺肥時在花后至8月中旬施 I次磷肥。
權利要求
1.一種五爪龍的快速繁殖方法，其具體步驟如下1)外植體的選取與滅菌選用五爪龍的假鱗莖上芽體作為培養(yǎng)材料，經(jīng)洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗10-30分鐘后，置于75%酒精中處理10-30秒，然后再經(jīng)O. 1%的升汞消毒后用無菌水沖洗，切去外植體變色的部分后備用；2)芽體的萌發(fā)將滅菌處理后的芽體接種在LS+6-BA1.2mg/L+NAA0. 2mg/L培養(yǎng)基上， pH值為5. 8，培養(yǎng)溫度23-27°C，每天光照12小時，光照強度1000LX，接種后6_8天芽體的萌發(fā)，10天左右形成帶葉的小苗；3)叢生芽誘導和增殖培養(yǎng)將小苗切下轉接于LS+6-BA0.5mg/L+IAA0. 4mg/L培養(yǎng)基上，直至形成叢生芽，PH值為5. 8，培養(yǎng)溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX， 30天左右為一個生長周期，以保持高速度遞增，增殖系數(shù)為5以上；4)生根培養(yǎng)選擇LS+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L+NAA O. 5mg / L 作為生根培養(yǎng)基，pH 值為5. 8，培養(yǎng)溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX，生根率達到90%以上，只需要25天左右形成完整植株；5)試管苗的移栽選取根系生長良好的試管苗，放入清水中把根部的瓊脂清洗干凈， 移載到沙土或富養(yǎng)土中，注意保水保溫保濕，移載I個月后，移載成活率達到90%以上；6)后期管理4月份左右移植大田后，6-9月份用兩層遮陽網(wǎng)進行覆蓋，并采用滴管方式進行補水，進入11月份后用地膜進行保溫保水，到第二年3月份左右去除地膜，采用以上方式進行五爪龍栽培管理；若發(fā)生黑斑病，用70%甲基托布津濕性粉劑1000倍液噴灑；若發(fā)生根結線蟲病危害，用3%呋喃丹顆粒劑灌施盆土 ；若缺肥時在花后至8月中旬施I次磷肥。
2.權利要求I的方法，其中步驟I中采用O.I %升汞進行消毒，消毒時間控制優(yōu)選在 7-15分鐘。
3.權利要求2的方法，其中步驟6中大田濕度控制在40-70%;溫度控制在10-30°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種五爪龍的快速繁殖方法。該方法是在LS培養(yǎng)基上培養(yǎng)五爪龍的莖段等組織，確切取帶1-2個腋芽的莖段為外植體，消毒后，接種在LS+6-BA1.2mg/L+NAA0.2mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種后6-8天左右芽體的萌發(fā)，10天左右形成帶葉的小苗，將小苗切下轉接于LS+6-BA0.5mg/L+IAA0.4mg/L培養(yǎng)基上，以保持高速度遞增，增殖系數(shù)為5以上。選擇LS+6-BA0.5mg/L+IAA0.4mg/L+NAA0.5mg／L作為生根培養(yǎng)基，生根率達到90%以上，只需要25天左右形成完整植株。試管苗移載到沙土中，注意保水保濕，移載1個月后，移載成活率達到90%以上，建立了一套高頻穩(wěn)定再生體系。本發(fā)明方法具有穩(wěn)定好，操作簡便，繁殖速度快，生產成本低，達到產業(yè)化水平等優(yōu)點。
文檔編號A01H4/00GK102599065SQ20121010664
公開日2012年7月25日 申請日期2012年4月13日 優(yōu)先權日2012年4月13日
發(fā)明者覃靜萍 申請人:董愛文