專利名稱：對大豆直接進行基因轉化的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ー種對大豆進行基因轉化的方法。
背景技術：
大豆(67ァmax L.)屬于豆科、蝶形花亞科、大豆屬的二倍體植物,是人類植物蛋白和食用油的主要來源，世界上重要的糧食作物和經濟作物。病、蟲、草害等非生物逆境的頻繁發(fā)生嚴重影響了大豆的產量和品質，由于抗源資源匱乏，利用常規(guī)的育種方法對大豆品種進行改良的效果不佳。隨著分子生物學和分子遺傳學的發(fā)展，利用轉基因技術將優(yōu)良外源基因轉入大豆中改良其品質已成為現代分子育種的重要方法。植物基因工程是在分子水平的分子上定向重組遺傳物質，改良植物性狀，培育優(yōu)質高產作物分子水平新品種的分子育種技木。70年代末，首次從分子水平上證實了土壤農、桿菌(Agrobacterium tumefaieus)在侵染植物細胞以后,不但能將它的一段DNA插入到被侵染細胞的基因組中，井能遺傳給后代。農桿菌介導的轉化是將外源DNA克隆至T-DNA區(qū)，農桿菌與植物細胞接觸，利用農桿菌天然轉移機制將外源基因導入受體細胞內。此法具有技術操作簡單成熟，耗資少，可靠性高，轉化率相對較高，可以轉移大片段的外源基因，沒有明顯的基因重排現象，且外源基因主要以單拷貝插入植物基因組等優(yōu)點。但此方法受植物物種、外植體類型、誘導物質及PH值、菌液濃度等多種因素的制約，致使其轉化周期長、重復性差、研究進程緩慢。隨著大豆遺傳轉化研究的發(fā)展，大豆遺傳轉化的再生體系也愈來愈多祥，目前使用較多的外植體有原生質體、未成熟子葉、上胚軸、下胚軸、胚尖、子葉、子葉節(jié)等。這些受體系統大多依賴于周期較長的組織培養(yǎng)再生體系，且再生率較低，耗費大量的人力、物力，不適于產業(yè)化及商品化。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供ー種對大豆直接進行基因轉化的方法。采用農桿菌直接轉化大豆萌動種子胚尖分生組織的方式，在侵染過程中采用真空滲透輔助轉化的方法，真空滲透輔助的農桿菌介導的大豆萌動種子胚尖遺傳轉化是ー種在真空處理條件下進行的農桿菌介導的非組織培養(yǎng)遺傳轉化方法，以大豆胚尖的分生組織作為外源基因導入的受體，真空滲透處理能夠在受體材料表面產生很多微損傷，且抽真空形成的負壓強致使農桿菌更緊密地吸附于受體的傷ロ及傷口內細胞間隙，從而促進T-DNA向大豆細胞的導入。轉化后的已萌發(fā)種子直接播種，其轉化效率及周期明顯優(yōu)于傳統的農桿菌介導轉化的組培再生體系O本發(fā)明提供的ー種對大豆進行基因轉化的方法包括以下步驟
O挑選飽滿、無病斑、完整的大豆種子經氯氣滅菌處理5-12h，于22-25°C條件下用無菌水浸泡大豆18-24h。2)用細針尖(直徑O. 1-0. 2mm)垂直刺入莖尖分生組織處5_10次，深度l_2mm。
3)將已處理的大豆種子浸入含こ酰丁香酮(ΙΟΟμπιοΙ/L)的農桿菌侵染液中，并輔助真空度為40-60KPa的真空滲透處理15-20min。4)將侵染后的大豆取出用無菌水清洗2-3遍后用無菌濾紙吸去多余菌液后放入共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，25-27°C、2000Lx光照強度下培養(yǎng)2_3天。5)于育苗盤直接進行播種。當植株長出第三片復葉時進行草甘膦(350mg/L)涂抹實驗，進行抗性檢測，用棉簽蘸取草甘膦藥液擦拭葉片，未涂葉片作為對照，7天后觀察植株的抗性反應。6)獲得具草甘膦抗性的植株即2次草甘膦涂抹篩選后出現抗性性狀的植株，移栽到大盆繼續(xù)生長直至結實并進行PCR檢測，獲得陽性轉化植株的種子。本發(fā)明中經真空輔助滲透侵染的針扎的莖尖分生組織避免了刀割傷對外植體造成的過度損傷，可促進轉化部位不定芽的萌發(fā)與生長。可在栽培情況下直接進行常規(guī)的轉化驗證，通過葉片涂抹，可有效對抗性植株進行初歩的篩選、鑒定。抗性植株不需要經過困難的生根過程，于轉化后5個月可以直接獲得轉基因后代(Tl)，一定程度上提高了大豆遺傳轉化的效率，顯著縮短了大豆遺傳轉化的周期，很大程度上降低了大豆遺傳轉化成本。利用本發(fā)明的方法，可以將外源基因成功地轉入大豆組織中，對于大豆基因工程方面的理論研究及遺傳育種實踐具有重要意義。


圖I pS0Y12質粒圖譜。圖2為轉化種子播種后長成的植株。圖3為草甘膦涂抹7天后的反應性狀。圖4為草甘膦篩選后具抗性性狀的植株PCR檢測圖。
具體實施例方式 材料和方法
I、大豆材料黑農37、黑農44、黑農35、北京小粒豆、合豐35、合豐25、綏農28、吉育91。2、菌株、質粒實驗中所用的農桿菌為EHAlOl菌株，重組質粒載體為pS0Y12，由浙江大學生命科學學院植物科學研究所壽惠霞教授實驗構建并提供(見中國優(yōu)秀碩士學位論文全文數據庫，周正劍，抗草甘膦轉基因大豆體系的優(yōu)化[D].浙江大學，2011 ；CN201110303049. 0)，質粒上構建有目的基因EPSPS和標記基因Bar。將保存的農桿菌菌株從_80°C冰箱拿出，置于冰上，取出5 μ L質粒與農桿菌200 μ L混勻，冰浴5min，放入預冷的電擊杯中，1500V，電擊轉化。將菌液吸入I. 5mLEP管中，加入500 μ LYEP培養(yǎng)基，于27°C振蕩暗培養(yǎng)4h，4000r/min, 25 V，離心IOmin收集菌體，棄500 μ L上清，重懸菌體，涂板于27°C培養(yǎng)2天，篩選出已轉化的農桿菌菌株。植物篩選劑是草甘膦。質粒圖譜如圖I所示。3、主要儀器
日本日立高速冷卻離心機CR22G/CR21G/CR20G型 日本BIO-RAD Gel Doc凝膠成像系統 北京六一儀器廠DYY-2C型電泳儀 上海 MP-120-1 電子天平上海光譜儀器有限公司紫外可見分光光度計 上海雷磁PHS-3C型精密pH計 哈爾濱HZQ-XlOO振蕩培養(yǎng)箱。4、主要生化試劑
卡那霉素、壯觀霉素、氯霉素、こ酰丁香酮、6-芐基嘌呤(G-BA)JB1JB6、瓊脂粉等購自北京鼎國技術有限責任公司；胰蛋白胨、蛋白胨、酵母提取物購自Oxoid公司；MS大量元素、微量元素、次氯酸鈉、濃鹽酸及蔗糖等普通化合物購自天津江天化工公司；草甘膦(農達)購自孟山都(馬來西亞)有限公司。5、基本培養(yǎng)基的組成及成分
權利要求
1.一種對大豆進行基因轉化的方法，其特征在于包括以下步驟 1)挑選飽滿、無病斑、完整的大豆種子經氯氣滅菌處理5-12h，于22-25°C條件下用無菌水浸泡大豆18-24h ； 2)用細針尖(直徑O.1-0. 2mm)垂直刺入莖尖分生組織處5_10次，深度l_2mm ； 3)取單菌落于2mL含相應抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，28°C搖床上200r/min振蕩培養(yǎng)12-16h，待OD600為O. 6-0. 8時，按1:1000的比例，再于28°C搖床上200r/min培養(yǎng)至對數期，取50mL離心管4000r/min，25°C離心IOmin收集菌體，用重懸液重懸菌體，加入lOOymol/L的乙酰丁香酮，備用； 4)將已處理的大豆種子浸入含乙酰丁香酮(ΙΟΟμπιοΙ/L)的農桿菌侵染液中，并輔助真空度為40-60KPa的真空滲透處理15-20min ； 5)將侵染后的大豆取出用無菌水清洗2-3遍后用無菌濾紙吸去多余菌液后放入共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，25-27 °C、2000Lx光照強度下培養(yǎng)2_3天； 6)于育苗盤進行播種。當植株長出第三片復葉時進行草甘膦(350mg/L)涂抹實驗，進行抗性檢測，用棉簽蘸取草甘膦藥液擦拭葉片，未涂葉片作為對照，7天后觀察植株的抗性反應; 7)獲得具草甘膦抗性的植株即兩次草甘膦涂抹篩選后出現抗性性狀的植株，移栽到大盆繼續(xù)生長直至結實并進行PCR檢測，獲得陽性轉化植株的種子。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基組成 YEP培養(yǎng)基胰蛋白胨10g/L+酵母提取物5g/L+氯化鈉5g/L，pH 7. O ； 農桿菌培養(yǎng)基 YEP培養(yǎng)基+氯霉素50 mg/L+卡那霉素50mg/L+壯觀霉素50 mg/L, pH 7. O ； 菌體重懸液1/10MSB5+AS100 μ mol/L+ 蔗糖 3%，pH 5. 4 共培培養(yǎng)基l/10MSB5+6-BAl. 6mg/L+AS100 μ mol/L+ 蔗糖 3%+ 瓊脂 0. 5% pH 5· 4。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述的含乙酰丁香酮的農桿菌侵染液的制備方法是取單菌落于2mL添加100mg/L卡那霉素、100mg/L壯觀霉素和25mg/L氯霉素的YEP液體培養(yǎng)基中，28°C搖床上200r/min振蕩培養(yǎng)12_16h，待OD6tltl為0. 6-0. 8時，按1:1000的比例，再于28°C搖床上200r/min培養(yǎng)至對數期，取50mL離心管4000r/min，25 °C離心IOmin收集菌體，用重懸液重懸菌體，加入100 μ mol/L的乙酰丁香酮。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種對大豆進行基因轉化的方法。采用農桿菌直接轉化大豆萌動種子胚尖分生組織的方式，在侵染過程中采用真空滲透輔助轉化的方法。該方法包括經過以下步驟大豆種子氯氣滅菌、無菌水浸泡、針扎胚尖分生組織處、抽真空輔助農桿菌侵染液、共培養(yǎng)、育苗盤播種，植株長出第三片復葉時進行草甘膦(350mg/L)葉片涂抹；獲得抗性植株即兩次草甘膦涂抹篩選后均出現抗性性狀的植株，移栽到大盆直至結實獲得陽性轉化植株的種子。本發(fā)明方法適用于多種基因型，且基因轉化周期短，是一個能夠用于大豆轉基因育種的可靠體系。
文檔編號A01H5/00GK102732558SQ201210107050
公開日2012年10月17日 申請日期2012年4月13日 優(yōu)先權日2012年4月13日
發(fā)明者關春峰, 季靜, 王偉, 王罡 申請人:天津大學