專利名稱：使用含溶菌酶的組合物抑制含水體系中微生物生長的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及控制含水體系中微生物生長的組合物和方法。更具體地，本發(fā)明涉及單獨(dú)使用或與季銨化合物組合使用溶菌酶(Iysozyme)來處理含水體系。
背景技術(shù)：
已經(jīng)使用了大量材料來控制不同環(huán)境中的藻類，例如但不限于氯/溴類化合物、雙胍、銅鹽、銀類化合物、三嗪、季銨化合物和聚合物。它們中的每一種在PH和/或溫度敏 感性、化學(xué)穩(wěn)定性和/或相容性、有限的效力、和環(huán)境和/或?qū)θ说亩拘苑矫婢嬖诓蛔恪＠?，氯是被水池所有者最廣泛使用的衛(wèi)生殺菌劑/消毒劑/氧化劑。它在殺滅細(xì)菌、藻類和其他活的生物體方面非常有效。通常氯以片劑或液體形式加入游泳池中或者由氯產(chǎn)生器提供，該產(chǎn)生器是一種含電池的裝置，由加入池水中的鹽庫產(chǎn)生氯。然而，氯有許多缺點(diǎn)，減弱了將其在游泳池和其他娛樂用水體系中用作唯一的消毒劑的合意性。例如，氯可以與氨結(jié)合形成在殺菌、消毒或氧化方面均無效的氯胺。氨常常存在池水中，或者因?yàn)榄h(huán)境因素，由被風(fēng)攜帶并落到池中的肥料形成，來自游泳者產(chǎn)生的廢物(汗、尿、唾液和體油)，或者甚至來自某些防曬洗液(suntan lotion)。結(jié)果，泳池管理者常常過度用氯處理(over-chlorinate)水池(> 3ppm)以補(bǔ)償氯向氯胺的轉(zhuǎn)化。過度用氯處理會(huì)引起皮膚過多吸收氯和氯胺或吸入含有氯和氯胺的空氣或水蒸氣。在游泳池，尤其在室內(nèi)環(huán)境下訓(xùn)練很多小時(shí)的運(yùn)動(dòng)員，可能對(duì)過度暴露于氯和氯胺特別敏感，以及可能表現(xiàn)出超敏反應(yīng)癥狀和類似哮喘的呼吸狀態(tài)。此外，氯對(duì)于可含有期望的動(dòng)植物的水產(chǎn)業(yè)環(huán)境是不適合的，氯或其副產(chǎn)物對(duì)這些動(dòng)植物可能造成傷害。該水產(chǎn)業(yè)環(huán)境的實(shí)例包括養(yǎng)魚池、養(yǎng)魚場(fish hatchery)、養(yǎng)蟲下塘、龍奸養(yǎng)殖場(crawfish farm),等等。溶菌酶是已知的分布于各種生物液體和組織(包括鳥蛋、植物、細(xì)菌和動(dòng)物分泌物)中的強(qiáng)效抗菌蛋白質(zhì)。它也存在于人類的眼淚、唾液、乳汁、呼吸和宮頸分泌物中，是由多形核白細(xì)胞分泌的。溶菌酶因其抗菌性能已經(jīng)用于制藥業(yè)和食品業(yè)并認(rèn)為對(duì)人類使用非常安全。事實(shí)上，溶菌酶是存在于人類乳汁中的殺微生物的要素之一。Sherba等人的美國專利5，069，717描述了用于控制藻類的、含有二苯醚和溶菌酶的增效(synergistic)混合物的殺微生物組合物。因此，期望有一種預(yù)防、殺滅和/或抑制微生物生長的方法，該方法廉價(jià)并使用低濃度下有效且容易獲取的成分。還期望有一種預(yù)防、殺滅和/或抑制微生物生長的方法，該方法不使用氯或其他在環(huán)境上不合需要的成分。

發(fā)明內(nèi)容
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種在含水體系控制微生物生長，尤其是藻類生長的有效的抗微生物組合物，該組合物通過向含水體系提供單獨(dú)的或與至少一種季銨化合物組合的溶菌酶而獲得。本發(fā)明可以應(yīng)用于多種工業(yè)流體體系(如，含水體系)和工藝中，包括但不限于，造紙水體系、紙衆(zhòng)(pulp slurry)、造紙工藝中的白水、冷卻水體系(冷卻塔,入口冷卻水(intakecooling waters)和排出冷卻水(effluent cooling waters))、廢水體系、再循環(huán)水體系(recirculating water systems)、熱浴槽(hot tubs)、游泳池(swimming pools)、娛樂用水體系(recreational water systems)、食品加工體系、飲用水體系、皮革加工水體系、金屬加工液(metal working fluid)以及其它工業(yè)水體系。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，可以將溶菌酶加入鹽水體系，例如但不限于，使用鹽氯化體系(saline chlorination system)的水體系。溶菌酶可任選與氯化鈉協(xié)同作用，提供控制微生物生長，具體地，例如藻類生長的組合物。 本發(fā)明的附加特征和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)部分在下述的說明中闡述，部分由說明書中明顯可見，或可以通過本發(fā)明的實(shí)踐得到。本發(fā)明的目的和其它優(yōu)點(diǎn)將通過說明書和所附權(quán)利要求書中具體指出的要素和組合來實(shí)現(xiàn)和獲得。具體地，本發(fā)明涉及以下內(nèi)容I. 一種在含水體系中控制至少一種微生物生長的方法，所述方法包括向該含水體系提供基本上由溶菌酶組成的組合物，其中所述溶菌酶是熱處理的或熱改性的溶菌酶，或其中所述溶菌酶是溶菌酶二聚體。2.項(xiàng)I的方法，其中該方法控制所述含水體系中的藻類生長。3.項(xiàng)I的方法，其中所述溶菌酶是熱處理的或熱改性的溶菌酶。4.項(xiàng)I的方法，其中所述溶菌酶是溶菌酶二聚體。5.項(xiàng)I的方法，其中將該溶菌酶加入所述含水體系，提供約0. 01至約IOOppm的溶
菌酶濃度。6.項(xiàng)I的方法，其中將該溶菌酶加入所述含水體系，提供約0. I至約IOppm的溶菌
酶濃度。7.項(xiàng)I的方法，其中所述含水體系是游泳池、熱浴槽或溫泉。8.項(xiàng)I的方法，其中所述含水體系是含有氯產(chǎn)生器的循環(huán)水體系，且該循環(huán)水體系包含約2，000至約6，OOOppm的氯化鈉。9.項(xiàng)I的方法，其中所述含水體系是水產(chǎn)業(yè)的介質(zhì)。10.項(xiàng)I的方法，其中所述含水體系是已除去氯的循環(huán)水體系。11. 一種在含水體系控制至少一種微生物生長的方法，所述方法包括提供組合物，該組合物基本上由至少一種溶菌酶和至少一種季銨化合物的組合組成，其中所述含水體系是水產(chǎn)業(yè)的介質(zhì)；已除去氯的循環(huán)水體系；游泳池；熱浴槽；溫泉；或含有氯產(chǎn)生器的循環(huán)水體系，且該循環(huán)水體系包含約2，000至約6，OOOppm的氯化鈉；以及其中所述溶菌酶是熱處理的或熱改性的溶菌酶，或其中所述溶菌酶是溶菌酶二聚體。12.項(xiàng)11的方法，其中將所述溶菌酶加入所述含水體系，提供約0. 01至約5，OOOppm的溶菌酶濃度。13.項(xiàng)11的方法，其中將所述溶菌酶加入所述含水體系，提供約0. I至約500ppm的溶菌酶濃度。14.項(xiàng)11的方法，其中將所述季銨化合物加入所述含水體系，提供約0. 01至約1，OOOppm的季銨化合物濃度。15.項(xiàng)11的方法，其中將所述季銨化合物加入所述含水體系，提供約0. I至約IOOppm的季銨化合物濃度。16.項(xiàng)11的方法，其中將所述溶菌酶和季銨化合物加入所述含水體系，提供約0. I至約500ppm的溶菌酶濃度和約0. I至約IOOppm的季銨化合物濃度。17.項(xiàng)11的方法，其中該方法控制所述含水體系中的藻類生長。
18. 一種在含水體系中控制至少一種微生物生長的方法，所述方法包括向該含水體系提供基本上由溶菌酶組成的組合物，其中所述含水體系是水產(chǎn)業(yè)的介質(zhì)；已除去氯的循環(huán)水體系；游泳池；熱浴槽；溫泉；或含有氯產(chǎn)生器的循環(huán)水體系，且該循環(huán)水體系包含約2，000至約6，OOOppm的氯化鈉；以及其中所述溶菌酶是熱處理的或熱改性的溶菌酶，或其中所述溶菌酶是溶菌酶二聚體。19.項(xiàng)18的方法，其中將所述溶菌酶加入所述含水體系，提供約0. 01至約IOOppm的溶菌酶濃度。20.項(xiàng)18的方法，其中將所述溶菌酶加入所述含水體系，提供約0. I至約IOppm的
溶菌酶濃度。21. 一種在含水體系中控制至少一種微生物生長的方法，所述方法包括向所述含水體系提供由溶菌酶構(gòu)成的組合物。應(yīng)該理解，上面的概述和下面的詳細(xì)說明僅僅是示范性的而不是對(duì)要求保護(hù)的本發(fā)明的限制。上述的和遍及本申請(qǐng)的所有專利、專利申請(qǐng)和公開文獻(xiàn)通過引用全部并入本文。
具體實(shí)施方案本發(fā)明提供了單獨(dú)使用或與至少一種季銨化合物組合使用溶菌酶在含水體系控制微生物生長的方法和組合物。根據(jù)本發(fā)明的方法，控制或抑制至少一種微生物的生長包括減少和/或防止這種生長。本文使用的術(shù)語“含水體系”包括娛樂用水體系，具體為諸如熱浴槽、溫泉和游泳池的循環(huán)水體系，和工業(yè)流體體系，包括但不限于造紙水體系、紙漿、造紙工藝中的白水、冷卻水體系(冷卻塔，入口冷卻水和排出冷卻水)、廢水體系、食品加工體系、飲用水體系、皮革加工水體系、金屬加工液以及其它工業(yè)水體系。本發(fā)明特別適合用于與高級(jí)生物體接觸的含水體系，該生物體因溶菌酶的低毒性而不會(huì)受到傷害。因此，本發(fā)明可以用于，例如在游泳池、溫泉和熱浴槽控制微生物如藻類，以及用于在包括養(yǎng)魚池、養(yǎng)魚場、養(yǎng)蝦塘、龍蝦塘、軟體動(dòng)物養(yǎng)殖場等在內(nèi)的水產(chǎn)業(yè)所使用的水體系中控制藻類。作為實(shí)例，可以將溶菌酶加入鹽水體系，例如使用鹽氯化體系(salinechlorination)的水體系。例如,該水體系可以含有約2，OOOppm至約8，OOOppm,如2，800ppm至6，OOOppm的氯化鈉。溶菌酶可任選與氯化鈉協(xié)同作用以提供控制微生物特別是藻類生長的組合物。由于溶菌酶控制藻類和/或其他微生物的活性，可以降低在這類水體系中運(yùn)行氯產(chǎn)生器的需要，由此降低電氣成本和減少因過度用氯處理而引起不希望效應(yīng)的可能性。還可以在已經(jīng)經(jīng)過處理以減少或除去氯的含水體系中加入溶菌酶以控制藻類和其他微生物。例如，養(yǎng)魚池可以含有對(duì)氯敏感的動(dòng)植物品種，含量甚至為公共市政水源中存在的量，因此，本文使用的水必須是經(jīng)過濾的或經(jīng)除氯處理的。然后，溶菌酶可以至少提供一些因減少或除去氯而損失的微生物控制活性。進(jìn)一步可理解的是，通過“控制”(例如，防止)至少一種微生物的生長，至少部分抑制了該微生物的生長。換言之，沒有或基本上沒有微生物的生長?！翱刂啤敝辽僖环N微生物的生長維持微生物的種群處于所需水平，降低該種群至所需的水平(甚至到檢測不到的極限)，和/或至少部分抑制微生物的生長。因此，在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，容易受到該至少一種微生物攻擊的產(chǎn)品、材料或介質(zhì)至少部分得到保護(hù)，免于受到因該微生物引起的這種攻擊和產(chǎn)生的損害以及其他有害影響。此外，還應(yīng)理解的是，“控制”至少一種微生物的生長還包括將至少一種微生物在生物統(tǒng)計(jì)學(xué)上降低和/或保持在低水平，使得該微生物引 起的攻擊和任何產(chǎn)生的損害或其他有害影響減輕，即，微生物生長速率或微生物攻擊速率慢下來和/或消除。本發(fā)明的組合物優(yōu)選具有低毒性。這些微生物的實(shí)例包括真菌、細(xì)菌、藻類、及其混合物，例如但不限于，例如綠色木霉(Trichoderma viride)、黑曲霉素(Aspergillus niger)和小球藻屬(Chlorella sp.)。其他實(shí)例為革蘭氏陽性的微生物，如桿菌屬(Bacillus species)。溶菌酶在酶的命名法中一般命名為“EC3. 2. I. 17”，通常也稱為溶膜酶。本發(fā)明使用的溶菌酶可以得自任何已知的溶菌酶源，例如，得自任何動(dòng)植物源，且可以通過酶制備、分離或純化的任何方法，包括重組體方式，來獲取。溶菌酶可以工業(yè)規(guī)模上的純化形式購買至IJ。典型地，純化的酶為白色固體形式。作為一種選擇，溶菌酶可以是熱處理的溶菌酶或熱改性的溶菌酶。溶菌酶可以是溶菌酶二聚體。例如，溶菌酶可以通過在高溫下加熱溶菌酶，如在水浴中加熱而進(jìn)行熱改性。溫度可以是足以改性溶菌酶，例如形成溶菌酶二聚體的任意溫度。例如，可以使用的溫度為約50°C或更高，如70°C至100°C，更具體地，80°C的溫度，持續(xù)加熱約20分鐘。就本發(fā)明的目的而言，可以存在一種以上的溶菌酶。例如，可以存在熱改性的溶菌酶和一種未改性溶菌酶。另外，溶菌酶二聚體還可以和其他溶菌酶一起存在。例如，本發(fā)明的溶菌酶可存在5 %至50 %或更多的溶菌酶二聚體。例如，溶菌酶二聚體可存在的量為I % 50 %或10 % 35%。熱處理的或熱改性的溶菌酶可以充當(dāng)部分或完全熱變性的溶菌酶。正如所述的，在本發(fā)明中可以使用溶菌酶的任何組合。如本文所述，任選加入或存在至少一種季銨化合物在與溶菌酶一起使用時(shí)進(jìn)一步提高了抗微生物活性，特別是提高了抗藻類活性。例如，季銨化合物如烷基二甲基芐基氯化銨是市售的殺藻劑。使用季銨化合物可以提供廣譜抗藻類活性或者可以增加對(duì)付帶來問題的藻類的效力。特別是，認(rèn)為溶菌酶和季銨化合物協(xié)同作用提供特別有用的和經(jīng)濟(jì)的抗微生物體系。根據(jù)本發(fā)明可以用于提供額外的協(xié)同抗微生物效應(yīng)的季銨化合物可以獲自任何銨源。例如，該季銨化合物可以是具有單個(gè)季銨基團(tuán)的化合物或者多季銨化合物。合適的季銨化合物的實(shí)例包括，例如，N，N- 二乙基-N-十二烷基-N-芐基氯化銨、N，N- 二甲基-N-十八烷基-N-(二甲基芐基)氯化銨、N，N-二甲基-N，N-二癸基氯化銨、N，N-二甲基-N，N-雙十二烷基氯化銨、N，N，N-三甲基-N-十四烷基氯化銨、N-芐基-N，N- 二甲基-N-(C12-C18燒基)氯化銨、N- ( 二氯節(jié)基)-N, -N- 二甲基-N-十二燒基氯化銨、N-十六烷基氯吡啶、N-十六烷基溴吡啶、N-十六烷基-N，N，N-三甲基溴化銨、N-十二烷基氯吡啶、N-十二烷基硫酸氫吡啶、N-芐基-N-十二烷基-N，N-雙(P -羥基-乙基)氯化銨、N-十二烷基-N-芐基-N，N- 二甲基氯化銨、N-芐基-N，N- 二甲基-N- (C12-C18烷基)氯化銨、N-十二烷基-N，N- 二甲基-N-乙基乙基硫酸銨、N-十二烷基-N，N- 二甲基-N-(I-萘基甲基)氯化銨、N-十六烷基-N，N- 二甲基-N-芐基氯化銨或N-十二烷基-N，N- 二甲基-N-芐基氯化銨。季銨化合物還可以是多季銨化合物?？梢允褂玫目刮⑸锏亩嗉句@化合物包括如下專利中描述的那些美國專利 3，874，870,3, 931，319,4, 027，020,4, 089，977,4, 111，679、4，506，081,4, 581，058,4, 778，813,4, 970，211,5, 051，124,5, 093，078,5, 142，002 和5，128，100，這些專利在此并入本文作為參考。多季銨化合物的實(shí)例為聚(氧化乙烯基_(二甲基亞氨基)亞乙基(二甲基亞氨基)亞乙基二氯化物)，可以購自Buckman LaboratoriesInternational, Inc,商標(biāo)為 WSCP。作為在含水體系中殺滅、或防止、或抑制微生物生長的方法，可以在溶菌酶和季銨化合物作用以提供殺滅、或防止、或抑制含水體系中的微生物生長的抗微生物劑的條件下，將溶菌酶和任選的所述季銨化合物供應(yīng)至該含水體系中。本領(lǐng)域技術(shù)人員在處理整個(gè)受影響體系之前通過簡單地試驗(yàn)不同的濃度，可以容易地確定具體應(yīng)用中使用的溶菌酶和任選的季銨化合物的有效量。例如，在欲處理的含水 體系中，溶菌酶的濃度可以為任何有效量，如約0. Olppm至5，OOOppm,當(dāng)處理藻類時(shí),優(yōu)選范圍為約0. Olppm至約2，OOOppm,且更優(yōu)選范圍為約0. I至約500ppm。在含水體系中可以存在任何有效量的季銨化合物，例如范圍為0. Olppm至約I, OOOppm,優(yōu)選范圍為約0. Ippm至約lOOppm。在本申請(qǐng)中，如上所述或如其他地方所述的溶菌酶和季銨化合物的濃度可以是將各組分組合或加入含水體系時(shí)組分的初始濃度和/或可以是在組分已經(jīng)與含水體系相互作用之后的任意時(shí)間時(shí)的組分濃度。如果本發(fā)明的方法中同時(shí)使用溶菌酶和至少一種季銨化合物，則這些組分可以單獨(dú)加入含水體系或者可以將它們組合形成加入含水體系的組合物。如果它們單獨(dú)加入，組分的添加順序并不重要，可以采用任何順序。本發(fā)明的方法可以在任何pH下實(shí)施，如pH范圍為約2至約11，優(yōu)選的pH范圍為約5至約9。對(duì)于將與高級(jí)生物體如人類和魚類接觸的含水體系，pH應(yīng)為中性(約pH7)。如本領(lǐng)域已知的，可以通過添加酸或堿調(diào)節(jié)含水體系的pH。添加的酸或堿應(yīng)該選擇不與體系中的任何組分反應(yīng)。然而，優(yōu)選將溶菌酶和任選的季銨化合物添加至水中而無需pH調(diào)節(jié)。本發(fā)明的方法可以用于任何需要微生物控制的任何工業(yè)或娛樂含水體系。該含水體系包括但不限于，金屬加工液，冷卻水體系(冷卻塔，入口冷卻水和排出冷卻水)，廢水體系，包括在水中進(jìn)行廢物處理(如污水處理)的廢水或衛(wèi)生用水(sanitation water)，娛樂用水體系，游泳池，熱浴槽，食品加工體系，飲用水體系，皮革加工水體系，白水體系，紙漿和其他造紙或紙加工水體系。通常，任何工業(yè)或娛樂用水體系可以從本發(fā)明受益。本發(fā)明的方法還可以用于這些不同的工業(yè)過程或娛樂設(shè)施的引入水的處理。首先可以用本發(fā)明的方法處理引入水，從而在引入水進(jìn)入該工業(yè)過程或娛樂設(shè)施之前抑制微生物生長。通過以下實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，該實(shí)施例意圖示例本發(fā)明。實(shí)施例通用方法A.滅藻活性的評(píng)估.本測試方法提供了測試化合物抑制(壓制)藻類生長的效力的技術(shù)。MIC值代表最小抑制濃度(Minimum Inhibitory Concentration),定義為完全抑制(壓制)給定生物體生長所需要的化合物的最低水平。裝置
試管，8-150mm。需要已消毒過的試管。培養(yǎng)器，能夠恒溫(±2°C )和調(diào)節(jié)光線(light regulation)。試劑和材料KNO3K2HPO4MgSO4. 7H20朽1樣酸銨鐵(Fe-ammonium citrate) (1%溶液)儲(chǔ)備液(Stocksolution)
儲(chǔ)備液成分g/200g去離子水
A.K2HPO41.50
B.MgSO4.7H201.50
C.Na2CO30.80
D.CaCl2.2H200.50
E.Na2SiO3.9H201.16
F.檸檬酸1.20
G.PIV金屬
Na2EDTA0.750 g
FeCl3.6H200.097 g
MnCl2.4H200.041 g
ZnCl20.005 g
CoCl2.6H200.002 g
Na2MoO4.2H20 0.004 g 去離子水1,000.000 ml接種物
在改性Allen介質(zhì)中生長14天的培養(yǎng)液(culture)中得到的細(xì)胞懸浮液或者根據(jù)需要獲得期望的小球藻屬(ATCC 7516)或Phormidium faveolarum(UTEX 427)的細(xì)胞物質(zhì)。在接種之前在590納米波長測量的82%透射率處對(duì)該接種物進(jìn)行校準(zhǔn)。方法介質(zhì)制備改性Alien 介質(zhì)(Allen, A. A.，1968)。
NaNO31.5 g
K2HPO45.0 ml 儲(chǔ)備液 A.
MgSO4. 7H205.0 ml 儲(chǔ)備液 B.
Na2CO35.0 ml 儲(chǔ)備液 C.
CaCl2. 2H2010.0 ml 儲(chǔ)備液 a
Na2SiO3. 9H2010.0 ml 儲(chǔ)備液 E.
才寧檬酸1.0 ml儲(chǔ)備液F.
PIV金屬1.0 ml儲(chǔ)備液G.
去離子水1000.0 ml將介質(zhì)在高壓滅菌器中在15磅壓力(121°C )下滅菌20分鐘。高壓滅菌之后，將基質(zhì)冷卻至45-50°C,每根試管分配5ml介質(zhì),然后加入所述化合物和接種物?；衔锏膿饺胫苽溆麥y試的化合物在水中的儲(chǔ)備液。儲(chǔ)備液的濃度取決于測試需要的最大劑量。稀釋儲(chǔ)備液以獲得比儲(chǔ)備液所選劑量小的劑量。每根試管應(yīng)加入最大量100微升儲(chǔ)備液或相應(yīng)的稀釋液。接種對(duì)于每種類型的介質(zhì)和接種物，每根試管加入100微升接種物。培育將含有處理物的試管放入設(shè)定在24°C的培養(yǎng)器中。由植物生長熒光管提供光，該熒光管經(jīng)設(shè)定提供16h光亮和8h黑暗。試管的評(píng)級(jí)將含有處理物的試管定級(jí)為陽性或陰性當(dāng)管內(nèi)介質(zhì)顯示出藻類生長(底部有綠色沉積物)時(shí)為陽性(被污染)。當(dāng)管內(nèi)介質(zhì)保持無色時(shí)為陰性(未受污染)。對(duì)照一直是陽性的?；衔锏淖钚∫种茲舛?MIC)是顯示藻類生長為陰性的最小劑量。協(xié)同作用評(píng)估通過棋盤稀釋法(Yan and Hancock, 2001)測量協(xié)同作用，其中沿試管行稀釋一種化合物，并沿試管列稀釋另一種。該方法重點(diǎn)找尋每種組分在另一種物質(zhì)存在下時(shí)MIC的減少。結(jié)果表示為分級(jí)抑制濃度指數(shù)(Fractional Inhibitory Concentration Index)(FIC)，計(jì)算如下FIC = [A]/MICa+[B]/MICb 其中，
MICa和MICb =化合物A和B單獨(dú)的MIC[A]和[B]=化合物A和B組合時(shí)的MICFIC指數(shù)< I顯示出協(xié)同作用；指數(shù)0. 5表示相當(dāng)于組合中每種化合物的MIC下降四倍。FIC指數(shù)1.0表示附加的活性(組合中每種化合物的MIC下降兩倍)，指數(shù)> I顯示對(duì)抗(antagonism);指數(shù)> 4表示真正對(duì)抗。B.滅細(xì)菌活性的評(píng)估.本方法適合用于通過測定MIC值評(píng)估化學(xué)品的抗細(xì)菌性能。MIC值代表最小抑制濃度，定義為獲得給定生物體殺滅率> 90%需要的化合物的最低水平。設(shè)備I.試管，18x150mm—次性培養(yǎng)管-無菌的2.無菌的Iml和IOml移液管3.培養(yǎng)器，能夠保持37°C ±1°C的溫度4.高壓滅菌器5. pH 計(jì)6. l_200ul 微量吸移管頭(micropipette tips)7. Eppendorf 微量吸移管8. McFarland 標(biāo)樣 #19.陪替培養(yǎng)皿塑料的，一次性陪替培養(yǎng)皿，尺寸100x15mm3.介質(zhì)的制備I. Difco平板計(jì)數(shù)瓊脂(Plate CountAgar):通過將23. 5g瓊脂懸浮在IL去離子水中并加熱至沸騰溶解而使瓊脂再水合。在需要時(shí)分配并在蒸汽高壓滅菌器中在121°C消毒15分鐘。2.基礎(chǔ)鹽基質(zhì)(Basal Salts Substrate), pH7 Trizma (Tris)HCl 3. 9gTrizma (Tris)減 0. 05g(注意在下列物質(zhì)加入之前獲得合適的pH。用多種合適的Trizma 緩沖劑的任一種調(diào)節(jié))
葡萄糖0.02克
蛋白胨0.01克
硝酸銨1.0克
硫酸鎂，七水合物0.25克
氯化鈣0.25克高壓滅菌器，在121°C消毒15分鐘C.接種物.由金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (ATCC 6538)或枯草桿菌(Bacillus subtilis) (ATCC 6633)或產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes) (ATCC13048) 18-24小時(shí)的細(xì)菌培養(yǎng)液得到的細(xì)胞懸浮液，獲得期望的細(xì)胞濃度。采用McFarland比濁計(jì)硫酸鋇標(biāo)樣或某些其他合適的方法，調(diào)節(jié)細(xì)菌懸浮液的濃度，由此，當(dāng)IOOiU接種物加入5ml基礎(chǔ)鹽基質(zhì)時(shí)，獲得最終濃度IxlO4 IxlO5個(gè)細(xì)胞/ml。D.化合物的摻入.制備欲測試的化合物在水中的儲(chǔ)備液。儲(chǔ)備液的濃度取決于測試需要的最大劑量。稀釋儲(chǔ)備液以獲得比儲(chǔ)備液所選劑量小的劑量。每根試管應(yīng)加入最大量100微升儲(chǔ)備液或相應(yīng)的稀釋液。E.接種和培育.對(duì)于每種類型的介質(zhì)和接種物,每根試管加入100微升接種物,并在37°C培育18小時(shí)。F.通過平板計(jì)數(shù)法對(duì)試管評(píng)級(jí).如 Standard Methods (American Public HealthAssociation ；1995)中所述制備Pour平板計(jì)數(shù)瓊脂。使用無菌移液管將I毫升樣品置于無菌的陪替培養(yǎng)皿(100-mm直徑)的中央。加入無菌的、熔融的(44-46°C )平板計(jì)數(shù)瓊脂 (pH7. 0 ；Difco)并通過旋動(dòng)平板與樣品混合。使樣品在室溫冷卻直到固化，然后倒置并在35 ±0. 5°C下培育48±2h。如StandardMethods中所述計(jì)數(shù)48±2h內(nèi)在平板計(jì)數(shù)介質(zhì)之中或之上形成的菌落，結(jié)果記錄為CFU/毫升。在可應(yīng)用時(shí)，將該值乘以稀釋因子獲得經(jīng)校正的CFU/毫升。在本測試中，化合物的MIC是產(chǎn)生90%殺滅率的濃度。這通過下式進(jìn)行計(jì)算對(duì)照中的平拘CFU/ml-處理物中的平拘CFU/mlxlOO對(duì)照中的平均CFU/mlG.協(xié)同作用評(píng)估.通過棋盤稀釋法(Yan and Hancock, 2001)測量協(xié)同作用，其中沿試管行稀釋一種化合物，并沿試管列稀釋另一種。該方法重點(diǎn)找尋每種組分在另一種物質(zhì)存在下時(shí)MIC的減少。結(jié)果表示為分級(jí)抑制濃度指數(shù)(Fractional InhibitoryConcentration Index) (FIC)，計(jì)算如下FIC = [A]/MICa+[B]/MICb 其中，MICa和MICb =化合物A和B單獨(dú)的MIC[A]和[B]=化合物A和B組合時(shí)的MICFIC指數(shù)< I顯示出協(xié)同作用；指數(shù)0.5表示相當(dāng)于組合中每種化合物的MIC下降四倍。FIC指數(shù)1.0表示附加的活性(組合中每種化合物的MIC下降兩倍)，指數(shù)> I顯示對(duì)抗(antagonism);指數(shù)> 4表示真正對(duì)抗。這是控制藻類的純的酶體系。本發(fā)明優(yōu)選使用溶菌酶本身作為活性成分。 測試溶菌酶(Sigma)、溶菌酶氯化物(NutriScience)、溶菌酶氯化物(MPBiomedicals)對(duì)小球藻屬(ATCC 7516)的對(duì)抗。培育期為24°C下14天，16h光亮和8h黑暗。
權(quán)利要求
1.ー種在含水體系控制至少ー種微生物生長的方法，所述方法包括 提供組合物，該組合物基本上由至少ー種溶菌酶和至少ー種季銨化合物的組合組成，其中所述含水體系是水產(chǎn)業(yè)的介質(zhì)；已除去氯的循環(huán)水體系；游泳池；熱浴槽；溫泉；或含有氯產(chǎn)生器的循環(huán)水體系，且該循環(huán)水體系包含約2，OOO至約6，OOOppm的氯化鈉；以及其中所述溶菌酶是熱處理的或熱改性的溶菌酶，或其中所述溶菌酶是溶菌酶ニ聚體。
2.權(quán)利要求I的方法，其中將所述溶菌酶加入所述含水體系，提供約O.01至約5，OOOppm的溶菌酶濃度。
3.權(quán)利要求I的方法，其中將所述溶菌酶加入所述含水體系，提供約O.I至約500ppm的溶菌酶濃度。
4.權(quán)利要求I的方法，其中將所述季銨化合物加入所述含水體系，提供約O.01至約1，OOOppm的季銨化合物濃度。
5.權(quán)利要求I的方法，其中將所述季銨化合物加入所述含水體系，提供約O.I至約IOOppm的季銨化合物濃度。
6.權(quán)利要求I的方法，其中將所述溶菌酶和季銨化合物加入所述含水體系，提供約O.I至約500ppm的溶菌酶濃度和約O. I至約IOOppm的季銨化合物濃度。
7.權(quán)利要求I的方法，其中該方法控制所述含水體系中的藻類生長。
全文摘要
本發(fā)明通過向含水體系或基質(zhì)單獨(dú)或與季銨化合物組合供應(yīng)溶菌酶，提供了一種在能夠支持微生物生長的含水體系中或者基質(zhì)上殺滅、防止或抑制微生物生長的方法。
文檔編號(hào)A01N33/12GK102696683SQ20121012638
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2007年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月16日
發(fā)明者德博拉.A.馬雷, 格雷西拉.H.旺克 申請(qǐng)人:巴科曼實(shí)驗(yàn)室國際公司