專利名稱：甘藍(lán)型油菜ogu cms恢復(fù)系及其轉(zhuǎn)育方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用研究領(lǐng)域，尤其涉及一種甘藍(lán)型油菜恢復(fù)材料及其轉(zhuǎn)育方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Ogura (1968)創(chuàng)建的蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育(Ogu CMS)，具有不育性穩(wěn)定、易于保持等顯著特點(diǎn)，被公認(rèn)為是整個(gè)蕓苔作物中最為理想的雜種優(yōu)勢(shì)利用途徑。在甘藍(lán)型油菜應(yīng) 用研究中，Bannerot (1974)最先利用回交法育成了甘藍(lán)型油菜Ogu CMS，該不育類型因質(zhì)核不協(xié)調(diào)，存在葉色低溫缺綠、蜜腺缺乏等不良特征。Pelletier (1983)以甘藍(lán)型油菜與蘿卜進(jìn)行原生質(zhì)體融合，育成了新一代Ogu-INRA CMS，既保持了原有的不育穩(wěn)定性，又克服了葉色缺綠等問題。其后的研究發(fā)現(xiàn)，整個(gè)蕓苔屬作物中找不到Ogu CMS恢復(fù)基因，恢復(fù)基因僅存在于日本或歐洲的蘿卜品種中。Heyn (1976)嘗試通過有性雜交將蘿卜恢復(fù)基因?qū)氲礁仕{(lán)型油菜，獲得育性部分恢復(fù)的Ogu CMS F1屬間雜交種，Pelletier (1983)從甘藍(lán)型油菜與蘿卜的原生質(zhì)體融合胞質(zhì)雜種中，獲得了甘藍(lán)型油菜性狀的Ogu CMS恢復(fù)株。由于導(dǎo)入到甘藍(lán)型油菜中恢復(fù)基因伴有一定長(zhǎng)度的蘿卜染色體片段，并且伴有恢復(fù)材料結(jié)實(shí)率低、農(nóng)藝性狀差，與高硫苷基因緊密連鎖等系列問題，優(yōu)良純合型恢復(fù)材料轉(zhuǎn)育極為困難。Primard-Brisset (2000)通過福射處理重組恢復(fù)基因,減少了蘿卜片段對(duì)恢復(fù)材料的影響，甘藍(lán)型油菜Ogu CMS成為最具潛力的油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用技術(shù)之一。中國(guó)于上世紀(jì)70年代末引入甘藍(lán)型油菜Ogu CMS，在恢復(fù)材料轉(zhuǎn)育方面，李旭峰(2001)曾將蘿卜變種藍(lán)花子中的恢復(fù)基因?qū)氲礁仕{(lán)型油菜Ogu CMS，并獲得附加染色體恢復(fù)材料Ad-6，純合型甘藍(lán)型油菜Ogu CMS恢復(fù)材料篩選一直沒有取得明顯進(jìn)展。目前世界各國(guó)對(duì)育成的Ogu CMS恢復(fù)材料均實(shí)施專利保護(hù)，創(chuàng)建新型的Ogu CMS恢復(fù)材料(源)對(duì)擴(kuò)大甘藍(lán)型油菜Ogu CMS的應(yīng)用范圍有著重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種成本低、安全性好、可用于甘藍(lán)型油菜Ogu CMS授粉體系中的甘藍(lán)型油菜Ogu CMS恢復(fù)系，還提供一種操作簡(jiǎn)單、直觀、效果明顯、具有重要遺傳意義的甘藍(lán)型油菜Ogu CMS恢復(fù)系的轉(zhuǎn)育方法，同時(shí)相應(yīng)提供該甘藍(lán)型油菜Ogu CMS恢復(fù)系在甘藍(lán)型油菜Ogu CMS授粉體系中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明創(chuàng)建了一種恢復(fù)基因原始親本來源不同的甘藍(lán)型油菜Ogu CMS恢復(fù)系及由該恢復(fù)系通過回交、自交轉(zhuǎn)育后獲得的系列衍生恢復(fù)材料，所述甘藍(lán)型油菜Ogu CMS恢復(fù)系在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCC No. 6003，其植株名稱為Ogu CMS恢復(fù)系CLR650。本發(fā)明的甘藍(lán)型油菜Ogu CMS恢復(fù)系CLR650是于2012年4月16日交由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏單位的地址位于北京中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。作為ー個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供ー種上述甘藍(lán)型油菜Ogu CMS恢復(fù)系的轉(zhuǎn)育方法，包括以下步驟(I)嫁接導(dǎo)入外源蘿卜恢復(fù)基因以甘藍(lán)型油菜Ogu CMS葉色缺綠不育系(Brassica Napus. L)和含Ogu CMS外源恢復(fù)基因的十字花科資源作為嫁接親本，嫁接時(shí)以所述Ogu CMS葉色缺綠不育系的不育株作為接穗，所述十字花科資源的可育株作為砧木，接穗成活開花時(shí)，取砧木的可育花粉與接穗的不育花進(jìn)行雜交，獲得導(dǎo)入有蘿卜染色體的甘藍(lán)型油菜遠(yuǎn)緣雜交后代；所述蘿卜染色體上攜有恢復(fù)基因；本步驟的方法能有效克服遠(yuǎn)緣雜交生殖性障礙，平均結(jié)角率為16%左右，平均結(jié)實(shí)率達(dá)17%左右，相對(duì)其它遠(yuǎn)緣外源基因的導(dǎo)入方法，本步驟的嫁接操作有著更直接、更簡(jiǎn)便的導(dǎo)入效果；(2)篩選甘藍(lán)型油菜性狀從步驟(I)獲得甘藍(lán)型油菜遠(yuǎn)緣雜交后代中，利用葉色缺綠性狀分離以及葉色缺綠程度與植株形態(tài)表現(xiàn)相關(guān)關(guān)系的特征，選擇葉色缺綠的可育株 進(jìn)行持續(xù)培育，經(jīng)多個(gè)世代篩選后，將蘿卜恢復(fù)基因組合到甘藍(lán)型油菜染色體，獲得表現(xiàn)為甘藍(lán)型油菜性狀的Ogu CMS葉色缺綠正常恢復(fù)株(2N=38)(—般來說，經(jīng)5 6個(gè)世代可獲得表現(xiàn)為甘藍(lán)型油菜性狀的嵌合型恢復(fù)株，經(jīng)8 9個(gè)世代可獲得甘藍(lán)型性狀的Ogu CMS葉色缺綠正?；謴?fù)株);本步驟中，利用Ogu CMS葉色缺綠性狀篩選遠(yuǎn)緣雜交恢復(fù)株，較快地排除了遠(yuǎn)緣雜交后代中的附加蘿卜染色體，實(shí)現(xiàn)了對(duì)甘藍(lán)型油菜染色體組的重組(2N=38);但是，由于獲得的Ogu CMS葉色缺綠正?；謴?fù)株的恢復(fù)能力弱，篩選過程中的可育性表現(xiàn)多為半不育和嵌合型可育，并且花為白色、結(jié)實(shí)性較差，恢復(fù)單株天然結(jié)實(shí)僅可收種30 50粒，次代的恢復(fù)株率一般為10%左右，需要通過后續(xù)的步驟(3)進(jìn)行進(jìn)一歩的篩選、純合；(3)純化 Ogu CMS 恢復(fù)系以 Ogu-INRA CMS 葉色正常不育系(Brassica Napus.L)作為母本，以上述步驟(2)培育的Ogu CMS葉色缺綠正常恢復(fù)株作為父本進(jìn)行雜交,從雜交后代中獲得葉色為綠色、花色為黃色的分離恢復(fù)株，結(jié)實(shí)性得到明顯改善，再經(jīng)過多個(gè)世代的自交與回交篩選，獲得自交、測(cè)交均為全可育的Ogu CMS純合恢復(fù)系CLR650 ;本步驟的操作有效克服了蘿卜染色體片段對(duì)恢復(fù)株育性分離造成的影響(如自交可育株率分離多為50%、測(cè)交可育株分離多為10% 20%的育性偏離)，增強(qiáng)了蘿卜恢復(fù)基因與甘藍(lán)型油菜基因組間的重組機(jī)率。本發(fā)明上述轉(zhuǎn)育方法的基本原理為以含Ogu CMS外源恢復(fù)基因的十字花科資源作為恢復(fù)基因供體親本，先利用嫁接技術(shù)克服遠(yuǎn)緣雜交生殖性障礙，將屬間蘿卜恢復(fù)基因?qū)氲礁仕{(lán)型油菜中，其后，通過自交、回交等常規(guī)育種方法與優(yōu)選的強(qiáng)化選擇方法相結(jié)合，克服恢復(fù)基因伴有的蘿卜片段對(duì)正常遺傳分離的不利影響。通過該方法，本發(fā)明最終實(shí)現(xiàn)了蘿卜恢復(fù)基因的重組與純合，育成了甘藍(lán)型油菜Ogu CMS純合恢復(fù)材料CLR650。上述的轉(zhuǎn)育方法，所述步驟(3)中，所述自交與回交分離的后代均優(yōu)選采用小群體、多株系的平行選擇法進(jìn)行強(qiáng)化篩選，此法可逐步提高恢復(fù)株的恢復(fù)率，部分自交株系可能突破Ogu CMS雜合型恢復(fù)株一般表現(xiàn)為I :I育性分離的障礙，并最終達(dá)到純合狀態(tài)。上述的轉(zhuǎn)育方法中，所述含Ogu CMS外源恢復(fù)基因的十字花科資源為蘿-藍(lán)(Raphanobrassica)，即蘿卜(2N=20)與甘藍(lán)型油菜(2N=38)自然雜交形成的多倍體植株(2N=58 )，其原始親本與現(xiàn)有育成的同類恢復(fù)系來源不同。上述的轉(zhuǎn)育方法，所述步驟(I)中，通過嫁接顯著提高了甘藍(lán)型油菜與蘿-藍(lán)進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交的親和力，其平均結(jié)角率達(dá)15% 17%，平均結(jié)實(shí)率達(dá)16% 18%，從而可成功地將蘿卜外源恢復(fù)基因?qū)氲礁仕{(lán)型油菜(現(xiàn)有技術(shù)中則一般采用細(xì)胞融合技術(shù)解決這ー難題)。作為ー個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供ー種上述轉(zhuǎn)育后獲得的甘藍(lán)型油菜OguCMS恢復(fù)系(含由其轉(zhuǎn)育后獲得的衍生恢復(fù)材料)在甘藍(lán)型油菜Ogu CMS授粉體系中的應(yīng)用。相對(duì)其它雜種優(yōu)勢(shì)利用方法，本發(fā)明的應(yīng)用具有操作簡(jiǎn)便、生產(chǎn)安全等明顯優(yōu)勢(shì)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明采用的嫁接導(dǎo)入外源恢復(fù)基因的轉(zhuǎn)育方法，可以通過嫁接砧木與接穗間的生理物質(zhì)交換，有效地克服遠(yuǎn)緣雜交生殖性障礙，提高目標(biāo)基因的導(dǎo)入頻率，這對(duì)其它外源有利基因的導(dǎo)入也有著重要的參考作用。本發(fā)明還利用早期甘藍(lán)型油菜Ogu CMS的葉色缺綠特性，篩選遠(yuǎn)緣雜交后代的甘藍(lán)型油菜性狀，具有選擇直觀、效果明顯、操作簡(jiǎn)易的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，為排除附加蘿卜染色體對(duì)選擇效果的影響提供了ー個(gè)新的技術(shù)途徑。此外，本發(fā)明最終選育的甘藍(lán)型油菜Ogu CMS純合型恢復(fù)材料CLR650與國(guó)外同類恢復(fù)系存在著明顯的分子標(biāo)記差異，這對(duì)擴(kuò)展Ogu CMS恢復(fù)材料的遺傳研究有著重要意義。
本發(fā)明的甘藍(lán)型油菜Ogu CMS恢復(fù)系CLR650已于2012年4月16日交由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏單位的地址位于北京中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC No. 6003，甘藍(lán)型油菜Ogu CMS恢復(fù)系CLR650的分類命名為甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)。


圖I為本發(fā)明實(shí)施例中對(duì)恢復(fù)基因連鎖分子標(biāo)記初步檢測(cè)對(duì)比圖，其中，白色部分為Primard-Brisset等公開的文獻(xiàn)結(jié)果(2005);灰色部分為本發(fā)明甘藍(lán)型油菜Ogu CMS恢復(fù)系CLR650PCR擴(kuò)增結(jié)果。圖2為本發(fā)明實(shí)施例中使用的原始親本蘿-藍(lán)(Raphanobrassica)94_l的外形照片。圖3為本發(fā)明實(shí)施例中使用的原始親本Ogu CMS葉色缺綠不育系H13A的外形照片。圖4為本發(fā)明實(shí)施例中嫁接法導(dǎo)入恢復(fù)基因時(shí)嫁接蕾苔期的形態(tài)照片。圖中箭頭指示為以蘿-藍(lán)為砧木、Ogu CMS缺綠不育株為接穗的嫁接部位。圖5為本發(fā)明實(shí)施例中嫁接法導(dǎo)入恢復(fù)基因時(shí)嫁接開花期的形態(tài)照片。圖中箭頭指示為嫁接部位。圖6為本發(fā)明實(shí)施例中Ogu CMS葉色缺綠恢復(fù)株的育性表現(xiàn)，此圖中箭頭指示為白花部分可育(花藥細(xì)小有少量花粉)。圖7為本發(fā)明實(shí)施例中Ogu CMS葉色缺綠恢復(fù)株的育性表現(xiàn)，此圖中箭頭指示為白花嵌合可育(可育花與不育花共存)。圖8為本發(fā)明實(shí)施例中Ogu CMS葉色缺綠恢復(fù)株的育性表現(xiàn)，此圖中箭頭指示為白花正?？捎?花粉量正常)。圖9為本發(fā)明實(shí)施例中處于苗期的甘藍(lán)型油菜Ogu CMS恢復(fù)系CLR650。圖10為本發(fā)明實(shí)施例中處于花、角期的甘藍(lán)型油菜Ogu CMS恢復(fù)系CLR650。圖11為本發(fā)明實(shí)施例中甘藍(lán)型油菜Ogu CMS恢復(fù)系CLR650的轉(zhuǎn)育流程示意圖。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步描述。實(shí)施例一種如圖9、圖10所示本發(fā)明的甘藍(lán)型油菜Ogu CMS恢復(fù)系CLR650，該甘藍(lán)型油菜Ogu CMS恢復(fù)系在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCCNo. 6003，其植株名稱為Ogu CMS恢復(fù)系CLR650。本實(shí)施例的甘藍(lán)型油菜Ogu CMS恢復(fù)系CLR650的轉(zhuǎn)育方法如圖11所示，具體包括下述步驟。I.外源蘿卜恢復(fù)基因的導(dǎo)入I. I 材料
主要包括如圖2 所不的蘿-藍(lán)(Raphanobrassica)94_l(AACCRR, 2n=58),由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)傅廷棟院士 1993年贈(zèng)送(遺傳背景不詳)；如圖3所示的甘藍(lán)型油菜Ogu CMS (葉色低溫)缺綠不育系H13A (Brassic Napus. L, 2N=38)由湖南省作物研究所崔德訴研究員1979年加拿大引入。I. 2實(shí)施方法1994年秋，將上述的蘿-藍(lán)(94-1)和Ogu CMS葉色缺綠不育系(H13A)同期播種(9月下旬)，次年春季(2月下旬)，在植株苔高約30cm時(shí)(參見圖4)，以解剖刀于苔莖中部按40°左右的斜面對(duì)等切割，將切割部分作為接穗，被切植株作為砧木交互嫁接(斜面相貼后、薄膜包裹并用細(xì)線捆扎)，接穗成活開花時(shí)(參見圖5)，按接穗不育花(H13A) X砧木可育花(94-1 )、砧木不育花(H13A) X接穗可育花(94-1)兩種方式授粉雜交，以非嫁接雜交處理(H13AX94-1)作為對(duì)照，成熟期考察不同處理方式的雜交結(jié)實(shí)效果。I. 3考察結(jié)果以接穗不育花(H13A) X砧木可育花(94-1)，平均結(jié)果率為15. 6%，平均結(jié)實(shí)率為17. 4%，分別為非嫁接対照的14. I倍和15.8倍；以砧木不育花(11134) X接穗可育花(94-1)，平均結(jié)果率和平均結(jié)實(shí)率均為0. 6%，比非嫁接對(duì)照下降0. 5個(gè)百分點(diǎn)。由上可見，接穗不育花作為花粉受體、砧木可育花為花粉供體的雜交方式，其雜交結(jié)實(shí)率顯著高于反向雜交與對(duì)照雜交，這也表明嫁接對(duì)提高雜交結(jié)實(shí)率的作用主要表現(xiàn)在以砧木為花粉供體、接穗為花粉受體的雜交方式上，這種嫁接雜交方式不僅能顯著地提高遠(yuǎn)緣雜交結(jié)實(shí)率，對(duì)遠(yuǎn)緣雜交種的種子正常發(fā)育也有明顯的作用。I. 4觀察雜交后代恢復(fù)性表現(xiàn)次年種植接穗不育花(H13A) X砧木可育花(94-1)雜交Fl代，觀察雜交后代的恢復(fù)性表現(xiàn)。利用接穗不育花(H13A) X砧木可育花(94-1)的雜交方式中，共獲32粒甘藍(lán)型油菜Ogu CMS與蘿-藍(lán)遠(yuǎn)緣雜交種，其中20粒為蘿-藍(lán)型的大粒多棱種，12粒為甘藍(lán)型油菜型的小粒圓形種；將獲得的遠(yuǎn)緣雜交種播種于大田，共計(jì)成苗21株，出苗成活單株均表現(xiàn)出葉色淺缺綠(母本H13A為深缺緑)、葉生刺毛、開淺黃花、株型松散等種間性狀特征，由嫁接獲得的雜交種(含大粒多棱種與小粒圓形種)均為真雜種。開花期對(duì)植株進(jìn)行育性調(diào)查，其中2株具有部分恢復(fù)能力，其雄蕊略低于柱頭、花藥細(xì)長(zhǎng)(約正?；ㄋ幍囊话雽?，含有少量花粉。以上結(jié)果表明，本實(shí)施例供試材料蘿-藍(lán)(94-1)攜有的Ogu CMS恢復(fù)基因，已通過有性雜交導(dǎo)入到甘藍(lán)型油菜Ogu CMS中，獲得導(dǎo)入有蘿卜染色體(染色體上攜有恢復(fù)基因)的甘藍(lán)型油菜遠(yuǎn)緣雜交后代。
2.甘藍(lán)型油菜性狀的恢復(fù)株篩選2. I 材料上述步驟I中獲得的甘藍(lán)型油菜遠(yuǎn)緣雜交后代；用于測(cè)交使用的原缺綠不育系H13A，由湖南省作物研究所提供。2. 2實(shí)施方法 采用蘿卜不育細(xì)胞質(zhì)直接鑒定選擇材料的恢復(fù)性表現(xiàn)(同質(zhì)恢復(fù)材料選育)，1995 2004年以O(shè)gu CMS葉色缺綠不育系(H13A)為選擇背景，主要利用葉色缺綠性狀篩選甘藍(lán)型油菜性狀，每代選取明顯缺綠的可育株構(gòu)成新一輪選擇群體，直至獲得表現(xiàn)為甘藍(lán)型油菜性狀特征的Ogu CMS葉色缺綠正?；謴?fù)株(正?？捎?。選擇過程中，Ogu CMS缺綠恢復(fù)株一般自交結(jié)實(shí)性極差，主要以天然種代替自交種，各世代株系群體數(shù)在20 30株之間，總?cè)后w數(shù)在50 100株之間。在Ogu CMS的胞質(zhì)(H13A)背景中，雜交后代的葉色缺綠性狀與植株形態(tài)呈現(xiàn)出明顯的相關(guān)關(guān)系，一般葉色缺綠越明顯，甘藍(lán)型油菜特征越顯著。連續(xù)以葉色缺綠作為選擇標(biāo)記對(duì)恢復(fù)株進(jìn)行篩選，植株形態(tài)由種間類型逐步轉(zhuǎn)向?yàn)楦仕{(lán)型油菜類型，可育性表現(xiàn)由早期的白花半不育(參見圖6)過渡到白花嵌合型可育(參見圖7)；再到白花正?？捎?參見圖8)，Ogu CMS缺綠恢復(fù)株表現(xiàn)了對(duì)甘藍(lán)型油菜性狀的定向選擇作用。2. 3主要結(jié)果通過采用上述步驟2. 2的實(shí)施方法，共經(jīng)9個(gè)世代(其中包括I代天然結(jié)實(shí)、一代測(cè)交轉(zhuǎn)育、一代自交結(jié)實(shí))后獲得表現(xiàn)為甘藍(lán)型油菜性狀的Ogu CMS葉色缺綠正?；謴?fù)株，該Ogu CMS葉色缺綠正?；謴?fù)株在性狀上表現(xiàn)為葉色缺綠、開白色花，其花藥粗短、飽滿；花粉量充足，花器外觀表型上已達(dá)到正常可育標(biāo)準(zhǔn)。以上結(jié)果表明，對(duì)Ogu CMS葉色缺綠正?；謴?fù)株的甘藍(lán)型油菜性狀選擇達(dá)到基本要求，但Ogu CMS葉色缺綠正?；謴?fù)株共有的結(jié)實(shí)性極差、恢復(fù)性不穩(wěn)定等不利性狀仍未明顯改變。3.甘藍(lán)型油菜Ogu CMS純合恢復(fù)材料篩選3. I 材料主要包括上述步驟2中獲得的表現(xiàn)為甘藍(lán)型油菜性狀(葉色缺綠、開白花)的OguCMS葉色缺綠正?；謴?fù)株；葉色正常Ogu-INRA CMS (H28A)，由湖南省作物研究所從國(guó)外引進(jìn)的Ogu-INRA CMS雜交種后代分離株中轉(zhuǎn)育；用于回交的雙低育種材料20份，由湖南省作物研究所提供。3. 2實(shí)施方法2005 2011年，以葉色正常Ogu-INRA CMS (H28A)為選擇背景，主要通過強(qiáng)化篩選提高選擇株系的群體恢復(fù)率，每代選取恢復(fù)率較高株系的可育株(含經(jīng)過回交的自交系)進(jìn)入下一代，直至獲得自交全可育、測(cè)交全恢復(fù)的純合恢復(fù)材料。Ogu-INRA CMS恢復(fù)株結(jié)實(shí)正常，主要以自交為主、回交為輔進(jìn)行篩選，各世代自交株系數(shù)在30 50個(gè)之間，回交組合株系在10 20個(gè)，總?cè)后w數(shù)在1000 6000株之間。3. 3主要結(jié)果在Ogu-INRA CMS葉色正常不育系(H28A)胞質(zhì)背景中，恢復(fù)株結(jié)實(shí)率等性狀發(fā)生了顯著變化。Ogu-INRA CMS葉色正常不育系(H28A)與缺綠白花Ogu CMS葉色缺綠正?；謴?fù)株雜交，在雜交F1代的24株群體中，2株分離恢復(fù)株葉色轉(zhuǎn)為正常綠葉、花色轉(zhuǎn)為黃色花、花藥形態(tài)完全與甘藍(lán)型油菜無異，其自交與異交均可達(dá)到正常授粉結(jié)實(shí)，所結(jié)的角果平均果長(zhǎng)約5cm、每果粒數(shù)約18粒。但其后各分離世代大多數(shù)自交株系恢復(fù)株率保持在40% 60%之間，回交株系恢復(fù)株率保持在20% 40%之間。2007 2011年五年間共對(duì)201個(gè)自交株系進(jìn)行篩選，達(dá)到或超過3 1育性分離比的株系為12個(gè)，僅占選擇總株系數(shù)的6%，表明恢復(fù)基因與其它蘿卜基因的連鎖關(guān)系很難通過常規(guī)的自(回)交方法輕易打破。采用小群體、多株系平行選擇方法，自交株系平均恢復(fù)率由2007年的36%提高到2011年的63%，育性大于3 :1的分離株系由2009年的2個(gè)提高到2011年的6個(gè)。2011年編號(hào)為CLR650的自交株系首先達(dá)到純合狀態(tài)，該株系的恢復(fù)株率2009年為76%(F: S=16:5)，2010年為94% (F S=34 2)，2011年為100% (F S=63 0)，63株自交群體全部表現(xiàn)為正?？捎?參見圖9、圖10、圖11)。隨機(jī)抽取10個(gè)單株進(jìn)行自交，并分別與不育系(H28A)對(duì)應(yīng)測(cè)交，10個(gè)自交株系均表現(xiàn)為100%可育，10個(gè)成對(duì)測(cè)交株系均表現(xiàn)為100%恢復(fù)，從而 在自交與測(cè)交ニ個(gè)環(huán)節(jié)驗(yàn)證了 CLR650所具有的恢復(fù)能力。4.甘藍(lán)型油菜Ogu CMS恢復(fù)材料的初步應(yīng)用4. I 材料主要包括上述步驟3中獲得的Ogu CMS純合恢復(fù)系CLR650，由Ogu-INRA CMS雜交后代中分離不育株轉(zhuǎn)育的不育系H20A、H31A、H33A，由湖南省作物研究所提供。4. 2實(shí)施方法2010 2011年，以H28A、H31A、H33A為母本，純合恢復(fù)系CLR650為父本于紗網(wǎng)隔離環(huán)境中試配雜交組合，制種父、母本行比I :3，花期放置蜜蜂傳粉，每個(gè)組合的制種小區(qū)面積40平方米(折0. 06畝)。收獲種子后，分小區(qū)三重復(fù)隨機(jī)排列進(jìn)行產(chǎn)量比較試驗(yàn)，每小區(qū)面積20平方米(折0. 03畝)，以POL CMS雜交品種湘雜油4號(hào)為對(duì)照，并按產(chǎn)量比較試驗(yàn)方法進(jìn)行性狀調(diào)查與測(cè)產(chǎn)。4. 3主要結(jié)果利用恢復(fù)系CLR650生產(chǎn)Ogu CMS雜交種獲得了良好的產(chǎn)量結(jié)果與與純度結(jié)果，本試驗(yàn)的三個(gè)雜交組合的制種生產(chǎn)中，組合H28AXCLR650，實(shí)收小區(qū)產(chǎn)量7. 43公斤，折畝產(chǎn)123. 83公斤；組合H31AXCLR650，實(shí)收小區(qū)產(chǎn)量8. 10公斤，折畝產(chǎn)135. 00公斤；組合H33AXCLR650,實(shí)收小區(qū)產(chǎn)量7. 78公斤，折畝產(chǎn)129. 66公斤。對(duì)收獲的三個(gè)雜交組合進(jìn)行純度檢測(cè)，其雜交種純度分別為100%、99%和99%，顯著高于中國(guó)甘藍(lán)型油菜雜交種純度質(zhì)量的一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(90%)。在以恢復(fù)系CLR650生產(chǎn)的雜交種進(jìn)行產(chǎn)量比較試驗(yàn)中，組合H28AXCLR650，三小區(qū)實(shí)收產(chǎn)量15. 8公斤，折畝產(chǎn)175. 5公斤，組合H31AXCLR650，三小區(qū)實(shí)收產(chǎn)量192. 2公斤，折畝產(chǎn)公斤，組合H33AXCLR650，三小區(qū)實(shí)收產(chǎn)量16. 4公斤，折畝產(chǎn)182. 2公斤，分別比對(duì)照湘雜油4號(hào)浙畝產(chǎn)170. 4公斤)增產(chǎn)3. 0%，12. 8%，6. 9%，表現(xiàn)了良好的增產(chǎn)潛力。本發(fā)明方法獲得的甘藍(lán)型油菜Ogu CMS恢復(fù)系CLR650與國(guó)際上采用細(xì)胞質(zhì)融合技術(shù)育成的Ogu CMS恢復(fù)材料不同，本發(fā)明創(chuàng)制的恢復(fù)材料系直接利用有性雜交從恢復(fù)基因供體親本(例如本實(shí)施例的蘿-藍(lán)94-1)中獲得恢復(fù)基因，采用的原始親本及轉(zhuǎn)育方法、轉(zhuǎn)育過程均不同于現(xiàn)有Ogu CMS恢復(fù)系的選育技木。對(duì)本實(shí)施例獲得的甘藍(lán)型油菜Ogu CMS恢復(fù)系CLR650進(jìn)行分子標(biāo)記初步鑒定，由于缺乏受專利保護(hù)對(duì)照恢復(fù)材料用作對(duì)照，采用的方法為參照Hu (2008)與Primard-Brisset (2005)的公開引物,選取I個(gè)基于Ogu CMS恢復(fù)基因(RfO)設(shè)計(jì)的特異標(biāo)記(BnRF0-AS2F/BnRF0-AS2F)與5個(gè)與恢復(fù)基因連鎖的蘿卜標(biāo)記(ScH03、ScA14、SG34、BoIJon、PGIint)進(jìn)行檢測(cè)，并直接將檢測(cè)結(jié)果與Primard-Brisset (2005)在文中列舉的恢復(fù)系(RRH1、R113、R2000)分子標(biāo)記連鎖圖進(jìn)行比較，分子標(biāo)記引物序列見表I。表I :RF0的特異標(biāo)記和連鎖標(biāo)記的引物序列
權(quán)利要求
1.一種甘藍(lán)型油菜Ogu CMS恢復(fù)系及由其轉(zhuǎn)育后獲得的衍生恢復(fù)材料，所述甘藍(lán)型油菜Ogu CMS恢復(fù)系在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCCNo. 6003，其植株名稱為Ogu CMS恢復(fù)系CLR650。
2.一種如權(quán)利要求I所述的甘藍(lán)型油菜Ogu CMS恢復(fù)系的轉(zhuǎn)育方法，包括以下步驟 (1)嫁接導(dǎo)入外源蘿卜恢復(fù)基因以甘藍(lán)型油菜OguCMS葉色缺綠不育系(BrassicaNapus. L)和含Ogu CMS外源恢復(fù)基因的十字花科資源作為嫁接親本，嫁接時(shí)以所述Ogu CMS葉色缺綠不育系的不育株作為接穗，所述十字花科資源的可育株作為砧木，接穗成活并開花時(shí)，取砧木可育花粉與接穗不育花雜交，獲得導(dǎo)入有蘿卜染色體的甘藍(lán)型油菜遠(yuǎn)緣雜交后代；所述蘿卜染色體上攜有恢復(fù)基因； (2)篩選甘藍(lán)型油菜性狀從步驟(I)獲得甘藍(lán)型油菜遠(yuǎn)緣雜交后代中，選擇葉色缺綠的可育株進(jìn)行持續(xù)培育，經(jīng)多個(gè)世代的篩選，將蘿卜恢復(fù)基因組合到甘藍(lán)型油菜染色體，獲得表現(xiàn)為甘藍(lán)型油菜性狀的Ogu CMS葉色缺綠正常恢復(fù)株； (3)純化OguCMS恢復(fù)系以O(shè)gu-INRA CMS葉色正常不育系(Brassica Napus. L)作為母本，以上述步驟(2)培育的Ogu CMS葉色缺綠正?；謴?fù)株作為父本進(jìn)行雜交，從雜交后代中獲得葉色為綠色、花色為黃色的分離恢復(fù)株，再經(jīng)過多個(gè)世代的自交與回交篩選，獲得自交、測(cè)交均為全可育的Ogu CMS恢復(fù)系CLR650。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的甘藍(lán)型油菜OguCMS恢復(fù)系的轉(zhuǎn)育方法，其特征在干在所述步驟(3)中，所述自交與回交分離的后代均采用小群體、多株系的平行選擇法進(jìn)行篩選。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的甘藍(lán)型油菜OguCMS恢復(fù)系的轉(zhuǎn)育方法，其特征在于在上述步驟(I)中，所述含Ogu CMS外源恢復(fù)基因的十字花科資源為蘿-藍(lán)(Raphanobrassica),該蘿-藍(lán)為蘿卜與甘藍(lán)型油菜自然雜交形成的多倍體植株。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的甘藍(lán)型油菜OguCMS恢復(fù)系的轉(zhuǎn)育方法，其特征在干所述步驟(I)中，以嫁接進(jìn)行甘藍(lán)型油菜與蘿-藍(lán)遠(yuǎn)緣雜交，其平均結(jié)角率達(dá)15% 17%，平均結(jié)實(shí)率達(dá)16% 18%。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的甘藍(lán)型油菜OguCMS恢復(fù)系的轉(zhuǎn)育方法，其特征在干所述步驟(2)中，獲得表現(xiàn)為甘藍(lán)型油菜性狀的Ogu CMS葉色缺綠正?；謴?fù)株是指經(jīng)5 6個(gè)世代可獲得表現(xiàn)為甘藍(lán)型油菜性狀的嵌合型恢復(fù)株，經(jīng)8 9個(gè)世代可獲得甘藍(lán)型性狀的Ogu CMS葉色缺綠正?；謴?fù)株。
7.—種如權(quán)利要求I所述的甘藍(lán)型油菜Ogu CMS恢復(fù)系及由其轉(zhuǎn)育后獲得的衍生恢復(fù)材料在甘藍(lán)型油菜Ogu CMS授粉體系中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甘藍(lán)型油菜Ogu CMS恢復(fù)系及由其轉(zhuǎn)育后獲得的衍生恢復(fù)材料，其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCC No.6003，其植株名稱為Ogu CMS恢復(fù)系CLR650。本發(fā)明的轉(zhuǎn)育方法包括以下步驟以含Ogu CMS外源恢復(fù)基因的十字花科資源作為恢復(fù)基因供體親本，先利用嫁接技術(shù)克服遠(yuǎn)緣雜交生殖性障礙，將屬間蘿卜恢復(fù)基因?qū)氲礁仕{(lán)型油菜中，其后選擇葉色缺綠的可育株進(jìn)行持續(xù)培育，經(jīng)多個(gè)世代的篩選后，再經(jīng)過多個(gè)世代的自交與回交篩選，獲得自交、測(cè)交均為全可育的恢復(fù)系CLR650。本發(fā)明的恢復(fù)材料成本低、安全性好，可在甘藍(lán)型油菜Ogu CMS授粉體系中進(jìn)行應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01H1/04GK102640700SQ20121013709
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月4日
發(fā)明者陳衛(wèi)江 申請(qǐng)人:湖南省作物研究所