專(zhuān)利名稱(chēng)：利用人工microRNA培育抗粗縮病玉米的方法及其專(zhuān)用雙鏈RNA的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培育抗粗縮病玉米的方法及其專(zhuān)用雙鏈RNA，尤其涉及利用人工microRNA技術(shù)及其雙鏈專(zhuān)用RNA,屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
玉米是我國(guó)最重要的糧食作物之一，2008年以來(lái)，我國(guó)玉米種植面積穩(wěn)定在4. 5億萬(wàn)畝上下，總產(chǎn)在I. 6億噸左右。然而，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民生活水平的提高，特別是畜牧業(yè)和玉米精深加工產(chǎn)業(yè)鏈的延伸和擴(kuò)漲，我國(guó)對(duì)玉米的需求將不斷増加，目前，我國(guó)玉米生產(chǎn)面臨巨大的壓力，已經(jīng)出現(xiàn)嚴(yán)重供不應(yīng)求的局面。另外，玉米病蟲(chóng)害危害日益嚴(yán)重，每年病蟲(chóng)害造成約1000萬(wàn)噸的產(chǎn)量損失，約占玉米總產(chǎn)的7%-10%。其中發(fā)生較廣、危害較重的是玉米粗縮病。1949年玉米粗縮病(maize rough dwarf virus, MRDV)首次在意大利被發(fā)現(xiàn),此后在阿根廷、法國(guó)、西班牙、前南斯拉夫、伊朗等國(guó)家都有不同程度的發(fā)生。1954年，首次在我國(guó)新疆南部、甘肅西部發(fā)現(xiàn)MRDV。自20世紀(jì)70年代以來(lái)，玉米粗縮病在華北、西北和東北的部分地區(qū)引發(fā)大面積毀種或絕產(chǎn)，成為玉米生產(chǎn)的重要病害。進(jìn)入90年代，MRDV在我國(guó)黃淮海和東北的部分地區(qū)危害逐年加重，局部病田病株率達(dá)到40%，平均減產(chǎn)10-30% (李懷方等，1996)。1999年在全國(guó)玉米種植區(qū)造成的危害面積進(jìn)ー步擴(kuò)大，其中華北地區(qū)、江蘇沿海地區(qū)危害最重。最近幾年玉米粗縮病在北方冀、魯、陜、晉、遼、津等省市暴發(fā)成災(zāi)，其中山東省自2005年以來(lái)已連續(xù)4年嚴(yán)重發(fā)生，主要發(fā)生在臨沂、泰安、濟(jì)寧等魯南地區(qū)，發(fā)病率在10%-70%，其中，2007年曲阜市玉米粗縮病發(fā)生面積達(dá)12萬(wàn)畝，造成2萬(wàn)多畝絕產(chǎn)。2008年山東省因粗縮病造成玉米絕產(chǎn)面積25萬(wàn)畝，病株率在2%-10%之間。2008年安徽宿州、河南東部、河北鹿泉市粗縮病也比較嚴(yán)重。發(fā)病較重的品種主要有雅玉12、皖玉7號(hào)和鄭單958、登海9號(hào)。在我國(guó)大部分地區(qū)分離到的玉米粗縮病的病原是水稻黑條矮縮病毒(RiceBlack-streaked Dwarf Virus, RBSDV)，該病毒是ー種具有雙層衣殼的球形病毒，存在于感病植株葉片凸起部分的細(xì)胞中，病毒粒子呈正二十四面體，具有雙層外売。該病毒基因組包含10條線狀的雙鏈RNA片段，屬于植物呼腸弧病毒組斐濟(jì)病毒屬(王朝輝等2004，方守國(guó)等2000，張恒木等2001)，玉米粗縮病感病植株扭曲，節(jié)間縮短呈叢生狀，植株嚴(yán)重矮化，病株株高僅為健康植株株高的1/2。葉片寬短脆硬，葉色濃綠，節(jié)間粗短，頂葉密集簇生；葉背、葉鞘及苞葉的葉脈上產(chǎn)生粗細(xì)不一的蠟白色條紋狀突起，手觸時(shí)有明顯粗糙感。4-5葉前感病植株少有抽穗，7葉后感病植株能抽穗結(jié)實(shí)，但雄穗發(fā)育不良或退化，花粉少；雌穗短小畸形或無(wú)雌穗，結(jié)實(shí)少，果穗小而畸形，嚴(yán)重時(shí)不能結(jié)實(shí)。玉米粗縮病主要通過(guò)灰飛虱傳播，病毒主要在冬小麥和灰飛虱體內(nèi)越冬，目前生產(chǎn)上推廣品種的抗性大部分處在高感或感病水平，未見(jiàn)抗性較好的品種。目前該病的防治主要靠調(diào)整玉米播種期以避開(kāi)灰飛虱的遷飛高峰期、清除田間雜草切斷其侵染循環(huán)中的鏈條等農(nóng)業(yè)措施，結(jié)合捕虱靈，植病靈等藥化學(xué)殺蟲(chóng)防病為主。但是農(nóng)業(yè)措施和藥劑處理只能停留在治的水平上，不能從根本上解決玉米粗縮病的危害。近年來(lái)，玉米粗縮病毒病原基因組的研究已經(jīng)取得了豐碩的成果。RBSDV和MRDV的基因組均由10條雙鏈RNA組成，按其在聚丙烯酰胺上遷移距離由小到大計(jì)的順序依次命名為S1-S10。RBSDV和MRDV基因組片段無(wú)論在氨基酸水平還是在核苷酸水平都具有相當(dāng)高的一致性(秦國(guó)正等，2006)。RBSDV的基因組大小為29141nt，是目前斐濟(jì)病毒屬中基因組最大的ー個(gè)。RBSDV的S1-S6均編碼病毒的ー個(gè)主要蛋白，其中SI可能編碼RNA依賴(lài)的RNA聚合酶；S2長(zhǎng)約3813nt，編碼ー個(gè)有1226個(gè)氨基酸組成的蛋白，猜測(cè)很可能是核心結(jié)構(gòu)蛋白；S3長(zhǎng)3752nt，編碼ー個(gè)有1146個(gè)氨基酸組成的蛋白，其編碼蛋白可能是病毒粒子的結(jié)構(gòu)蛋白；S4、S5長(zhǎng)3617nt、3163nt，功能未知；S6長(zhǎng)2645nt，雖然功能未知但利用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)其ニ級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和數(shù)據(jù)庫(kù)比較分析表明，其編碼蛋白存在高度保守的親水性結(jié)構(gòu)域及多個(gè)跨膜區(qū)域，可能具有結(jié)合RNA及ATPase活性，這些結(jié)果表明，RBSDV的S6基因可能具有編碼植物基因沉默抑制子的功能；S7全長(zhǎng)大約為2193nt，含有兩個(gè)開(kāi)發(fā)閱讀框(0RF)，分別編碼約為41Ku和36Ku的蛋白質(zhì)ORFl和0RF2，目前已經(jīng)正式ORFl和0RF2均為 病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白；S8全序列約為1936bp，只含有I個(gè)0RF，編碼蛋白的分子量約為68Ku，可能是病毒的核心衣殼蛋白；S9全長(zhǎng)1900bp，含有2個(gè)0RF，其中0RF2保守性極高，編碼ー種24. 2Ku的非結(jié)構(gòu)蛋白。SlO全長(zhǎng)1819nt，編碼病毒63ku的外殼蛋白。截止到2010年6月29日在NCBI注冊(cè)的RBSDV序列總計(jì)有60條，其中20條是從中國(guó)玉米、水稻產(chǎn)區(qū)分類(lèi)得到的。RBSDV基因組序列測(cè)序及其功能研究的深入，為利用植物基因工程改造玉米優(yōu)良自交系，培養(yǎng)抗粗縮病玉米新種質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。相比傳統(tǒng)雜交育種，利用基因工程技術(shù)手段培育抗病品種是徹底解決玉米粗縮病的根本途徑，而且與藥劑防治相比，它既不用増加生產(chǎn)投資，也沒(méi)有農(nóng)藥殘留污染環(huán)境，對(duì)防治發(fā)生范圍廣、流行速度快的病害更為有效。MicroRNA (或稱(chēng)miRNA)是生物體內(nèi)源的非編碼小分子RNA。人工microRNA(Artifical miRNA, amiRNA)技術(shù)是利用內(nèi)源miRNA前體骨架，通過(guò)替換miRNA序列產(chǎn)生具有新功能的miRNA。最近人工microRNA在抗病育種的潛力逐漸被人們認(rèn)識(shí)，Schwab等利用擬南芥pre-miRNA172和pre_miRNA319做骨架，將miRNA/miRNA*區(qū)替換成與目標(biāo)mRNA互補(bǔ)的片段，形成了 artifical miRNA，在擬南芥中超表達(dá)后引起表型的明顯改變(Schwab 2006)，證明amiRNA可以有效沉默單個(gè)和多個(gè)靶基因，并且在誘導(dǎo)性啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下均可以特異性地發(fā)揮作用；Warthmann等利用水稻osa_MIR528作骨架構(gòu)建了人工miRNA,成功對(duì)水稻祀基因高效干涉(Warthmann)。2006年Niu等通過(guò)修飾擬南芥miR159的前體獲得了能夠分別鏢靶P69和HC-Pro的人造miRNAs amiR-P69159和amiR-HC-Pro159，發(fā)現(xiàn)表達(dá)amiR_P69159和amiR-HC-Pro159的轉(zhuǎn)基因擬南芥能夠分別特異抵抗TYMV和TuMV病毒感染(Niu，2006)。2007年Qu等設(shè)計(jì)了鏢靶黃瓜花葉病毒(CMV)的沉默抑制子2b的miRNA并在煙草中表達(dá)，獲得抗病毒的煙草植株，并且發(fā)現(xiàn)煙草的抗性水平和miRNA的表達(dá)水平成正相關(guān)(Qu，2007)。相比PTGS (RNAi)介導(dǎo)的基因沉默，人工miRNA在培養(yǎng)抗病毒植物上具有其獨(dú)特的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)(I)RNAi介導(dǎo)的基因沉默依賴(lài)DCL4途徑，而病毒編碼的抑制蛋白(基因沉默抑制子)可以抑制這種沉默，能夠抑制RNAi機(jī)制的發(fā)生。AmiRNA通過(guò)DCLl途徑，可以避開(kāi)ー些病毒抑制蛋白的拮抗作用；(2) RNAi介導(dǎo)的基因沉默在植物中轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)片段病毒基因組，這些病毒基因組序列可能與植物基因組重組，存在ー些生物安全方面的隱患，而amiRNA只引入21個(gè)堿基的外源序列，降低了此類(lèi)風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)生；(3)田間病毒多是混合侵染，并不是ー個(gè)純的株系，而且病毒株系多、變異快，RNAi等方法只能有效抵御部分株系，無(wú)法培育ー種持久廣譜的抗病毒品種，amiRNA可以允許錯(cuò)配的存在，因而科研針對(duì)病毒保守區(qū)設(shè)計(jì)amiRNA，使之有效抑制大多數(shù)病毒株系，并且當(dāng)病毒發(fā)生突變后仍然能夠保持抗病毒能力，從而延長(zhǎng)品種的壽命；(4) RNAi介導(dǎo)的基因沉默會(huì)產(chǎn)生一系列序列信息不明確的siRNAs,往往造成意外“脫靶”現(xiàn)象和非目標(biāo)基因的沉默等現(xiàn)象，amiRNA只產(chǎn)生I條miRNA成熟體(mature miRNA)，和靶基因的結(jié)合更加精確、高效、可控；(5)低溫能夠抑制RNAi介導(dǎo)基因沉默的機(jī)制，在低溫(<15°C)條件下，RNAi轉(zhuǎn)基因種質(zhì)抗病毒能力明顯下降，容易受到病毒的侵染。而研究表明人工miRNA介導(dǎo)的基因沉默在15°C和24°C下沒(méi)有區(qū)別，在低溫環(huán)境下人工miRNA將更加穩(wěn)定、高效。 然而在可檢索的現(xiàn)有技術(shù)中，利用人工microRNA技術(shù)提高玉米抗粗縮病的方法還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了ー種利用人工microRNA提高玉米抗粗縮病的方法，并且提供改造microRNA的專(zhuān)用雙鏈RNA序列，實(shí)現(xiàn)利用人工miRNA培育抗粗縮病玉米新種質(zhì)。本發(fā)明的技術(shù)方案是ー種利用人工microRNA培育抗粗縮病玉米的專(zhuān)用雙鏈RNA,其特征是，它是由sequenceA和sequenceB組成的雙鏈RNA ;所述sequenceA如SEQNO. 1-34所述；所述sequenceB的核苷酸序列是與sequenceA反向互補(bǔ)，或者與sequenceA小于4個(gè)堿基錯(cuò)配的反向互補(bǔ)序列。本發(fā)明還提供了ー種利用人工microRNA培育抗粗縮病玉米的方法，其特征是，首先克隆玉米內(nèi)源的microRNA,然后以玉米內(nèi)源的microRNA為模板，以分別含有上述sequenceA和sequenceB的ー對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增后的序列通過(guò)酶切,連接轉(zhuǎn)化到帶有ubiqutin或者CaMV 35S啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體中；或者或者通過(guò)人工合成的方式，直接合成帶有sequenceA和sequenceB的人工microRNA前體序列，然后連接轉(zhuǎn)化到帶有ubiqutin或者CaMV35S啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體中；然后將該植物表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌侵染或者基因槍的方法導(dǎo)入玉米中，得到抗玉米粗縮病的轉(zhuǎn)基因玉米。本發(fā)明進(jìn)ー步的技術(shù)方案是所述玉米內(nèi)源的microRNA為zma_MIR159a,所述擴(kuò)增用的引物為 primer 7 TGCTCTAGATCGATGCTTTGGGTTTGAAGCG-seguenceB-AGGGTCGTTCCGAAGGG,和 primer 8 CGCGGATCCGGAGGGGTGGATCAGGATG-seguenceA-GAGAGCGGCCAGCAAGGGGG ；PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94°C 5min;再 94°C 50s，54°C 45s, 72°C lmin，30 循環(huán)；72°C 7min。所述的克隆內(nèi)源高水平表達(dá)的microRNA (zma_MIR159a)的方法是，以玉米總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。以 primerl :5’ -AGITCCCTCACTCCCCAG-3’ (SEQ NO. 38),primer2 5’ -GGACGCAACAAGCAAAAA-3’ (SEQ NO. 39)進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94 °C 5min ；再94°C 50s, 54°C 45s, 72°C lmin，30循環(huán)；72°C 7min ;以擴(kuò)增后的稀釋產(chǎn)物為模板，以primer3 :5-’TCGATGCTTTGGGTTTGA_3’ (SEQ NO. 40),primer4 :5’-GGAGGGGTGGATCAGGAT-3’(SEQ NO. 41)，以同樣的程序進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，或者不進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，直接用primer3和primer4進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。轉(zhuǎn)基因玉米苗的分子檢測(cè)方法是提取轉(zhuǎn)基因苗的總RNA，以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，分別以引物(sequence B, sequenceA), (primer 3, sequenceA)和(sequence B,primer 4)進(jìn)行PCR檢測(cè)。玉米粗縮病毒是造成我國(guó)玉米大面積減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)的主要病害，由于玉米粗縮病的病原菌主要靠灰飛虱傳播，從苗期到成株期均可發(fā)病，且感病期越早，發(fā)病越重，所以通過(guò)噴施農(nóng)藥或者栽培措施優(yōu)化等方法很難防止玉米粗縮病的發(fā)生和危害，所以說(shuō)提高玉米自身的抗病能力是解決玉米粗縮病危害的根本途徑。由于目前缺少對(duì)粗縮病高抗的優(yōu)良自交系，所以通過(guò)基因工程手段培養(yǎng)抗病品系將是徹底解決玉米粗縮病的有效途徑。本發(fā)明以玉米優(yōu)良自交系為受體植物，設(shè)計(jì)了能夠干擾玉米粗縮病毒病原菌的人エmicroRNA載體,通過(guò)導(dǎo)入玉米種,成功實(shí)現(xiàn)了利用人工miRNA提高玉米對(duì)粗縮病的抗性， 具有廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(I)相比傳統(tǒng)雜交育種，利用人工microRNA技術(shù)手段培育抗病品種是徹底解決玉米粗縮病的根本途徑，而且與藥劑防治相比，它既不用増加生產(chǎn)投資，也沒(méi)有農(nóng)藥殘留污染環(huán)境，對(duì)防治發(fā)生范圍廣、流行速度快的病害更為有效。(2)相比PTGS (RNAi)介導(dǎo)的基因沉默，人工microRNA技術(shù)只引入21個(gè)堿基的外源序列，不容易造成“脫靶”現(xiàn)象和非目標(biāo)基因的沉默等現(xiàn)象，生物安全性更高。(3)本發(fā)明中人工microRNA載體的構(gòu)建，采用玉米自身高水平表達(dá)的microRNA的前體作為骨架，和傳統(tǒng)的通過(guò)引入外源基因改良作物品質(zhì)有很大不同，一定程度上可以減 少引入外源基因造成的不確定表型，另外也可以減少轉(zhuǎn)基因引起的爭(zhēng)議。(4)本發(fā)明可以用(sequence B, sequenceA), (primer 3, sequenceA)和(sequenceB, primer 4)引物組合對(duì)轉(zhuǎn)基因苗進(jìn)行快速檢測(cè)。


圖I玉米粗縮病毒病原菌S6基因組片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖譜；其中S6為玉米粗縮病毒病原菌S6基因組片段，Marker為分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000。圖2植物表達(dá)載體構(gòu)建圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)ー步說(shuō)明，但不限于此。實(shí)施例I克隆玉米內(nèi)源的microRNA (zma-MIR159a)根據(jù)microRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www. mirbase. org/)中玉米 zma_MIR159a (檢索號(hào)MI0001809)提供的序列信息提交到NCBI中進(jìn)行blastN，結(jié)果表明zma_MIR159a包含在EST (EE295085)內(nèi)。根據(jù)EST的序列及zma_MIR159a在EST中所在的位置，設(shè)計(jì)引物primerl :5’-AGTTCCCTCACTCCCCAG-3’ (SEQ NO. 38),primer2 :5’-GGACGCAACAAGCAAAAA-3’(SEQ NO.39)， primer3 :5’ -TCGATGCTTTGGGTTTGA-3’ (SEQ NO.40), primer4 5，-GGAGGGGTGGATCAGGAT-3，(SEQ NO. 41)。
提取玉米優(yōu)良自交系齊319的總RNA后進(jìn)行純化，方法如下I.稱(chēng)取0.2g新鮮組織，在液氮中充分研磨至粉末狀，研磨中不斷緩慢加入液氮，防止材料解凍。2.將研好的組織迅速轉(zhuǎn)移至預(yù)熱(65°C )的裝有600微升CTAB提取液(2% CTAB,2% PVP, 0. IM Tris-Cl, 2. OM NaCl, 25mM EDTA)的 EP 管中，立即劇烈渦旋振蕩 30s，使其混勻。3. 65°C水浴2-5min，期間劇烈渦旋振蕩3_5次。4.稍微冷卻后加入等體積的氯仿/異戊醇(氯仿異戊醇=24:1 (V/V)，下同)渦旋振蕩 lmin,混勻，4°C, 12，OOOrpm 離心 15min。5.將上清轉(zhuǎn)移到另一新的EP管中，加入2微升的DNase I，37°C水浴15min。
6.再加入等體積的氯仿/異戊醇渦旋振蕩Imin，混勻，4 °C，12，OOOrpm離心15min。7.將上清轉(zhuǎn)移到另一新的EP管中，加入1/3體積的8M LiCl，使其終濃度為2M，4 °C過(guò)夜沉淀。8. 40C，12，OOOrpm離心20min，棄上清，分別用70%こ醇，無(wú)水こ醇洗沉淀，晾干，カロ30-50微升DEPC-H2O,溶解沉淀。9.在微量離心管中加入全部 RNA, DNaseI Buffer 5ul, DnaseIC5U/ul )5ul, RnaseInhibitor (40u/ul)0. 5ul，最后加入DEPC H2O使總體積達(dá)到50ul，37°C反應(yīng)I個(gè)小時(shí)。10.加入 50ul DEPC H2O,混勻。11.加入等量(IOOul)的苯酚/氯仿/已戊醇(25:24:1),充分混勻。12.離心，取上層水相到新離心管中。13.加入等量(IOOul)的氯仿/已戊醇(24:1)，充分混勻。14.心取上清(水相)到新的離心管。15.加入 1/10 體積(IOul)的 3M NaOAC (pH 5. 2) 。16.加入2. 5倍(250ul)的冷無(wú)水こ醇，_20°C過(guò)夜(或者一個(gè)小時(shí)以上)。17.離心回收沉淀，用70%的こ醇清洗，干燥。20.加入20ul DEPC H2O溶解后，電泳檢測(cè)。玉米cDNA的獲得參照Takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明的方法，在500ul離心管中加入 oligo dT primer lul, dNTP lul，總 RNA 2ul, DEPC H2O 6ul，混勻后，在 PCR 儀上65°C溫育5min后迅速在冰上冷卻，然后再加入5XPrimeScript II Buffer 4. Oul, RnaseInhibitor 0. 5ul,PrimeScript II Rtase I. Oul,最后加入 DEPC H2O,補(bǔ)足 20ul,混勻后在PCR儀上進(jìn)行，42°C，60min ；70°C , 15min后，冰上冷卻。用稀釋5倍的cDNA做模板，以primerl, primer2進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C 5min ;再 94°C 50s，54°C 45s, 72°C lmin，30 循環(huán)；72°C 7min ;以擴(kuò)增后的稀釋 5 倍的產(chǎn)物為模板，以 primer3 :5’ TCGATGCTTTGGGTTTGA 3’，primer4 :5’ GGAGGGGTGGATCAGGAT3’，以同樣的程序進(jìn)行第二輪擴(kuò)増。或者不進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，直接用primer3和primer4進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物連接到T載體上進(jìn)行測(cè)序。實(shí)施例2改造microRNA的專(zhuān)用雙鏈RNA序列的獲得根據(jù)NCBI中報(bào)道的玉米粗縮病毒病原菌-水稻黑條矮縮病毒(RiceBlack-streaked Dwarf Virus, RBSDV)基因組片段 S6 的序列(檢索號(hào)AJ409148)設(shè)計(jì)引物 primer5 :5， -AAGTTTTTTGAGTCTGAGATA-3’ (SEQ NO.42), primer6 5’-GACATCAGCTGATTTGAGTC-3’ (SEQ NO. 43)。收集受到粗縮病危害的玉米病葉，提取總RNA，總RNA提取和純化方法同實(shí)施例I中的方法。將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄方法同實(shí)施例1，不同之處在于，用隨機(jī)引物代替了 oligo dT引物。用cDNA做模板，以primer 5, primer 6為引物進(jìn)行PCR程序,PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C 5min;再 94°C 50s，54°C 45s, 72°C 3min，32 循環(huán)；72°C 7min。PCR 產(chǎn)物在瓊脂糖電泳中進(jìn)行檢測(cè)，其瓊脂糖電泳圖譜如圖I所示，凝膠電泳回收并純化目的片段。將目的片段連接到T載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)陽(yáng)性克隆用M13+引物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序后得到玉米粗縮病毒病原菌基因組S6片段(如SEQ NO. 36-37所述)。將S6 片段的序列提交到軟件 wmd3 (http://wmd3. weigelworld. org/cgi-bin/webapp.cgi page=Home;project=stdwmd),通過(guò)和玉米全基因組序列的比對(duì)和雙鏈RNA的能量值確定專(zhuān)用的RNA序列，如SEQ1-34所述；詳細(xì)的具體步驟如下
(I)凝膠電泳回收并純化目的片段過(guò)程紫外燈下檢測(cè)，切下預(yù)期大小的基因片段放入I. 5mL離心管中，加入溶膠液300-700ul，55°C保溫溶解，期間不斷搖動(dòng)。將含有目的基因的溶解液過(guò)柱，經(jīng)過(guò)70%酒精清洗，用20ul雙蒸水洗脫。(2)目的片段連接到T載體的過(guò)程通過(guò)凝膠電泳回收并純化長(zhǎng)度約為2645bp的目的片段，取純化產(chǎn)物4. Oul，加入pMD18simple T vector I. Oul 混勻，再加入 5. Oul Solution I 混勻后，16°C保溫 I 個(gè)小時(shí)以上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。(3)感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化的過(guò)程用無(wú)菌接種環(huán)挑取_70°C甘油保存的E. coli DH5 a，通過(guò)劃線稀釋的方法經(jīng)37°C培養(yǎng)16-20h后在平板中得到DH5 a的單菌落；挑ー單菌落于5ml的LB液體培養(yǎng)基，180rpm振蕩培養(yǎng)12h ;取Iml DH5 a LB菌液于IOOml的LB液體培養(yǎng)基，180rpm振蕩培養(yǎng)到OD值
0.4 ;冰上放置15分鐘,無(wú)菌條件下倒入50ml Beckman離心管中，4°C,3500rpm離心IOmin,棄上清；沉淀用30ml冰預(yù)冷的0. IM CaCl2溶液重懸；4°C,3500rpm離心IOmin,小心倒出上清液；沉淀重懸于2ml冰預(yù)冷的含15%甘油0. IM CaCl2溶液；將這些感受態(tài)細(xì)胞按每份IOOu I分裝。將連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中，稍稍混勻，冰上靜置0. 5h，42°C熱激90S，加入600ul的LB溶液，37°C搖菌復(fù)蘇lh，取IOOul均勻涂到含有抗生素的LB固體平板上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。實(shí)施例3過(guò)量表達(dá)載體的構(gòu)建植物表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程如圖2所示根據(jù)玉米zma_MIR159a的前體序列以及專(zhuān)用雙鏈RNA的序列，設(shè)計(jì)引物primer7 TGCTCTAGATCGATGCTTTGGGTTTGAAGCG-sequenceB-AGGGTCGTTCCGAAGGG (SEQ NO. 44),和 primer 8 CGCGGATCCGGAGGGGTGGATCAGGATG-sequenceA-GAGAGCGGCCAGCAAGGGGG (SEQ NO. 45);其中下劃線序列為酶切位點(diǎn)，sequenceA和sequenceB序列為專(zhuān)用雙鏈 RNA 序列及其反向互補(bǔ)序列。如 sequenceA TCAT ACGAGCT AAAT CGACAG, sequenceB GTCGATTTAGCTCGTATGAGA。以玉米zma_MIR159a為模板,用引物primer 7和primer 8進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C 5min;再 94°C 50s，54°C 45s, 72°C lmin，30 循環(huán)；72°C 7min。將擴(kuò)增后的序列連接到T載體中，提取質(zhì)粒通過(guò)Xba I和Bam HI雙酶切,連接轉(zhuǎn)化到帶有ubiqutin或者CaMV 35S啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體中。連接和轉(zhuǎn)化的過(guò)程同實(shí)施例2，詳細(xì)的具體步驟如下酶切的過(guò)程在I. 5mL 離心管中先后加入 ddH20 21. 5ul,質(zhì)粒 5. Oul, Buffer K I. 5ul, Bam HI
I.Oul, Xba I I. Oul，混勻，37°C酶切過(guò)夜，電泳后回收目的片段，回收過(guò)程同實(shí)施例2。質(zhì)粒提取過(guò)程(上海生エ質(zhì)粒提取試劑盒):(I)取I. 5-5ml過(guò)夜培養(yǎng)的菌液,12, OOOrpm離心2min,收集菌體,倒盡或吸干培養(yǎng)基。(2)在菌體沉淀中加入250 U I Solution I，吸打或震蕩至徹底懸浮菌體。(3)加入250 ill Solution II，立即溫和顛倒離心管5_10次混勻，室溫靜置2-4min。(4)加入350lil Solution III,立即溫和顛倒離心管5-10次充分混勻。(5) 12，OOOrpm離心IOmin,將上清全部小心移入吸附柱中，8，OOOrpm離心30sec。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。(6)向吸附柱中加入 500 U I 漂洗液(Wash Solution), 10，OOOrpm 離心 lmin,倒掉
收集管的液體，將吸附柱放入同一收集管。(7)重復(fù)步驟(6)—次。(9)將空吸附柱和收集管放入離心機(jī)，12，OOOrpm離心2min。(10)將吸附柱放入干凈的I. 5ml離心管中，在吸附膜中央加入30-50 y I洗脫液(Elution Buffer),室溫靜置2min, 10, OOOrpm離心lmin。將所得的質(zhì)粒DNA溶液置于_20°C保存或用于后續(xù)試驗(yàn)。實(shí)施例4 轉(zhuǎn)化玉米優(yōu)良自交系玉米幼胚的獲得和遺傳轉(zhuǎn)化取受粉后9-14d玉米優(yōu)良自交系齊319的幼胚，先用70%こ醇消毒3min，再用2%(有效氯)的次氯酸鈉消毒30min，用無(wú)菌水沖洗干凈，剝?nèi)∮着撸糜诠腆w培養(yǎng)基上(N6鹽，N6維生素,鹿糖20g/L,葡萄糖10g/L,脯氨酸2. 94g/L,酸解酪蛋白100mg/L, 2mg/L2，4-D，pH5. 8)上，26°C下暗培養(yǎng)2_3d ;轉(zhuǎn)移至高滲培養(yǎng)基(N6+0. 4g甘露醇)上培養(yǎng)4_8小時(shí)，用基因槍轟擊；轉(zhuǎn)移至高滲培養(yǎng)基上16-24h，然后轉(zhuǎn)移至N6培養(yǎng)基(N6鹽+N6維生素+鐵鹽+2. 9g/L脯氨酸+100mg/L水解酪蛋白+2. 4mg/L2, 4D+20克葡萄糖+8mg/L AgNO3)上恢復(fù)培養(yǎng)2-3d ;移至選擇培養(yǎng)基(N6+Kan)上4_6周，每?jī)芍芾^代一次；移至MSO分化培養(yǎng)基(MS大量鹽+MS微量鹽+N6維生素+鐵鹽+30g/L蔗糖)；經(jīng)過(guò)生根和壯苗后將轉(zhuǎn)化苗移入營(yíng)養(yǎng)缽。、
基因槍用金粉母液和子彈的制備取IOmg的金粉，用70%的こ醇洗3次，每次IOOOOrpm離心I分鐘，家Iml滅菌水振蕩2分鐘，制成10mg/ml的金粉儲(chǔ)存液；取300ul的金粉儲(chǔ)藏液，HOOOrpm離心30秒，棄上清。加入150ul的水將金粉懸浮，在振蕩器上邊輕微震蕩邊往里加入lug/ul的質(zhì)粒30ul，再加入新配制的60ul的0. IM亞精胺，再加入150ul 2. 5M的CaC12，高速渦旋3分鐘，將離心管放在冰上約2分鐘讓金粉自動(dòng)沉淀一會(huì)兒，lOOOOrpm離心10秒(這樣可以得到非常好的沉淀)，去掉上清，加100%酒精750ul，高速渦旋，然后將離心管放在冰上約2分鐘金粉自動(dòng)沉淀一會(huì)，IOOOOrpm離心10秒,去掉上清,用300ul無(wú)水こ醇懸浮,分裝成IlOul姆管(防止揮發(fā))，準(zhǔn)備打槍。實(shí)施例5 :轉(zhuǎn)基因玉米苗的分子檢測(cè)提取轉(zhuǎn)基因苗的總RNA(提取方法同實(shí)施例1)，以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，分別以I,sequence B, sequence Aノ，(primer 3, sequence A)和(sequence B, primer 4)進(jìn)訂 PCR檢測(cè)。PCR程序同實(shí)施例I。實(shí)施例6 :轉(zhuǎn)基因苗的抗病性檢測(cè)通過(guò)人工接種方法對(duì)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的TO代轉(zhuǎn)化苗(齊319，鄭58共兩個(gè)品種，每 個(gè)品種轉(zhuǎn)基因玉米幼苗各20株，對(duì)照組非轉(zhuǎn)基因玉米幼苗各20株)進(jìn)行人工接種鑒定，從玉米矮縮病重病區(qū)采集發(fā)病植株，將灰飛虱在毒源上飼喂獲毒，移入帶有玉米幼苗的燒杯中飼養(yǎng)(循回時(shí)間12-17d，有效接種強(qiáng)度10-20頭/株，接種時(shí)間48-72h和玉米接種齡期2葉齡)，渡過(guò)循環(huán)期，檢測(cè)完單頭灰飛虱攜帯病原菌情況后，對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米幼苗和非轉(zhuǎn)基因玉米幼苗進(jìn)行人工接種檢測(cè)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因株系的發(fā)病率(兩個(gè)品種轉(zhuǎn)基因植株發(fā)病率均彡20%)顯著低于對(duì)照組(兩個(gè)品種非轉(zhuǎn)基因植株發(fā)病率均彡50%)，且轉(zhuǎn)基因玉米植株較對(duì)照組抗病性明顯增強(qiáng)。主要參考文獻(xiàn)李懷方.玉米矮花葉病毒(MDMV)和粗縮病毒(MRDV)研究報(bào)告匯編.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系，1996，30-34.王朝輝.水稻黑條矮縮病毒玉米分離物的分子特性.學(xué)位論文.2004方守國(guó)，于嘉林，馮繼東等.我國(guó)玉米粗縮病株上發(fā)現(xiàn)的水稻黑條矮縮病毒.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2000, 8 (I) : 121-125張恒木，雷娟利，陳劍平等.浙江和河北發(fā)生的一種水稻、小麥、玉米矮縮病是水稻黑條矮縮病毒引起的.中國(guó)病毒學(xué)，2001, 16(3) :246-251秦國(guó)正，王飛.玉米粗縮病的研究進(jìn)展.山東農(nóng)業(yè)科學(xué).2006(3) :17-21Qu J, Ye J, Fang R (2007) Artificial miRNA-mediated virus resistance inplants. Journal of virology 81 1212, 6690-6699Niu Qff, Lin SS, Reyes JL, Chen KC, Wu HW, Yeh SD, Chua NH (2006) Expressionof artificial microRNAs in transgenic Arabidopsis thaiiana confers virusresistance. Nat BiotechnoI. Nov;24(11):1358-1359Schwab R, Ossowski S, Riester M, et al. Highly specitic gene silencing byartificial microRNAs in Arabidopsis. Plant Cell, 2006, 18:1121—113權(quán)利要求
1.一種利用人工micix)RNA培育抗粗縮病玉米的專(zhuān)用雙鏈RNA，其特征是，它是由sequenceA 和 sequenceB 組成的雙鏈 RNA ；所述 sequenceA 如 SEQ NO. 1-34 所述；所述sequenceB的核苷酸序列是與sequenceA反向互補(bǔ),或者與sequenceA小于4個(gè)堿基錯(cuò)配的反向互補(bǔ)序列。
2.一種利用人工micix)RNA培育抗粗縮病玉米的方法，其特征是，首先克隆玉米內(nèi)源的microRNA,然后以玉米內(nèi)源的microRNA為模板，以分別含有如權(quán)利要求I所述的sequenceA和sequenceB的一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的序列通過(guò)酶切，連接轉(zhuǎn)化到帶有ubiqutin或者CaMV 35S啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體中；或者通過(guò)人工合成的方式，直接合成帶有權(quán)利要求I所述的sequenceA和sequenceB的人工microRNA前體序列,然后連接轉(zhuǎn)化到帶有ubiqutin或者CaMV 35S啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體中；然后將該植物表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌侵染或者基因槍的方法導(dǎo)入玉米中，得到抗玉米粗縮病的轉(zhuǎn)基因玉米。
3.如權(quán)利要求2所述的一種利用人工microRNA培育抗粗縮病玉米的方法，其特征是，所述玉米內(nèi)源的microRNA為zma-MIR159a，所述擴(kuò)增用的引物為primer 7 TGCTCTAGATCGATGCTTTGGGTTTGAAGCG-sequenceB-AGGGTCGTTCCGAAGGG,和 primer 8 CGCGGATCCGGAGGGGTGGATCAGGATG-sequenceA-GAGAGCGGCCAGCAAGGGGG ;PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94°C 5min ;再941 50s,54°C 45s, 72°C lmin，30 循環(huán)；72°C 7min。
4.如權(quán)利要求2或3所述的一種利用人工microRNA培育抗粗縮病玉米的方法，其特征是，所述克隆zma-MIR159a的方法是，以玉米總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA ;然后以 primerl :5，-AGTTCCCTCACTCCCCAG-3，，primer2 :5，-GGACGCAACAAGCAAAAA-3’ 進(jìn)行PCR 反應(yīng)，PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94°C 5min;再 94°C 50s, 54 °C 45s, 72 °C lmin，30 循環(huán)；72°C7min ；以擴(kuò)增后的稀釋產(chǎn)物為模板，以 primer3 :5_’ TCGATGCTTTGGGITTGA-3’，primer4 5’ -GGAGGGGTGGATCAGGAT-3’，以同樣的程序進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，或者不進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，直接用primer3和primer4進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用人工microRNA培育抗粗縮病玉米的方法及其專(zhuān)用雙鏈RNA。所述專(zhuān)用雙鏈RNA是由sequenceA和sequenceB組成的雙鏈RNA序列。首先克隆玉米內(nèi)源的microRNA，然后以它為模板，以分別含有sequenceA和sequenceB的一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的序列通過(guò)酶切，連接轉(zhuǎn)化到帶有強(qiáng)啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體中；然后將該植物表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌侵染或者基因槍的方法導(dǎo)入玉米中，得到得到抗玉米粗縮病的轉(zhuǎn)基因玉米。本發(fā)明通過(guò)人工microRNA技術(shù)培育抗粗縮病玉米新種質(zhì)，不容易脫靶，安全性高，而且抗病性狀可以穩(wěn)定遺傳。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102703448SQ20121014728
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月14日
發(fā)明者夏晗, 孟昭東, 李?lèi)?ài)芹, 李長(zhǎng)生, 畢玉平, 王興軍, 趙傳志 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心