專利名稱：一種外周血單個核細胞的凍存液及凍存方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體地講，本發(fā)明涉及一種外周血單個核細胞的凍存液及凍存方法。
背景技術：
外周血單個核細胞(peripheralblood mononuclear cell, PBMC),指外周血中具有單個核的細胞，包括淋巴細胞、單核細胞(monocyte)、樹突狀細胞和其它少量細胞(造血干細胞等)。PBMC是制備細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)的種子細胞，CIK細胞因其同時表 達CD3和CD56而被認為是新一代腫瘤過繼免疫治療的首選方案。在臨床應用過程中，常見的問題是很難保證提供足夠數量的PBMC。針對該問題目前常用的做法是，利用低溫凍存技術保存外周血單個核細胞，在需要時復蘇并誘導培養(yǎng)為各種免疫細胞。但凍存過程會顯著改變細胞的熱力學、化學和物理環(huán)境，同時伴隨生物性損傷的危險。為了將凍存過程中細胞的損傷降至最低，使細胞復蘇時存活率最高，最佳的冷凍條件是盡可能地降低細胞內的晶體形成，減少細胞內水凝固所形成的高濃度溶質對細胞造成的低溫損傷。因此需要采取緩慢冷凍、加入冷凍保護劑排除水分、在盡可能低的溫度下保存細胞、快速復蘇等方法來達到對細胞產生最低損傷的目的，其中冷凍保護劑的作用十分重要。常用的冷凍保護劑主要有甘油、二甲基亞砜(DMSO)等滲透性試劑，以及羥乙基淀粉(HES )、白蛋白和聚乙二醇(PEG)等非滲透性試劑，目前常用的是DMSO?，F有技術中，細胞凍存復蘇后的存活率通常在70%_90%之間。日本學者Makino S等采用5%DMS0、6%羥乙基淀粉、4%人血清白蛋白凍存自體外周血干細胞，凍存于_80°C，獲得的復蘇存活率為88. 4%±3. 6%，為目前已知報道中最高的存活率。不過葉韻斌等學者的報道顯示，用此方法凍存的細胞回輸給患者，有些患者出現了不適癥狀，原因可能是羥乙基淀粉(HES)為大分子物質，個別患者在使用含羥乙基淀粉的藥品時，可能發(fā)生過敏性反應。因此，為提供足夠量的PBMC，現有技術中細胞凍存復蘇后的存活率仍需進一步提高，同時也應避免回輸給患者時出現惡心、嘔吐或過敏等不良反應。

發(fā)明內容
針對上述現有技術中的不足，本發(fā)明的目的是提高PBMC細胞凍存復蘇后的存活率，同時避免將復蘇后的PBMC細胞回輸給患者時出現不良反應。為了實現上述發(fā)明目的，本發(fā)明技術方案如下一種外周血單個核細胞凍存液，包含10-12%(V/V)滲透性冷凍保護劑，10-14%(V/V) ￠-葡聚糖，8-10%(V/V)血清或血漿，64-72%(V/V)生理鹽水。以及，一種外周血單個核細胞凍存方法，包括以下步驟(I)將外周血單個核細胞懸浮于細胞培養(yǎng)液中，獲得外周血單個核細胞懸液；(2)將所述外周血單個核細胞懸液與本發(fā)明的外周血單個核細胞凍存液按照0.9-1. I I的比例混勻，分裝于細胞凍存管中；
(3)將所述細胞凍存管放置于程序凍存盒中，先于_80°C冷凍，然后轉入液氮中凍存。本發(fā)明的PBMC凍存液使用了經美國FDA認證安全的P -葡聚糖作為冷凍保護劑，使凍存復蘇后的PBMC的存活率達到91. 56%左右，且使用本發(fā)明的PBMC凍存液的單個核細胞復蘇后經誘導培養(yǎng)得到的CIK細胞中CD3+CD56+T細胞的比例與未凍存的PBMC相比十分接近，且兩者的細胞生長曲線和增殖倍數沒有明顯差異，并且將該CIK細胞回輸給患者后未引起不適癥狀。


圖I為使用本發(fā)明實施例I的凍存液凍存PBMC復蘇后誘導得到CIK細胞與未凍存的PBMC誘導得到的CIK細胞的生長曲線圖；
圖2為使用本發(fā)明實施例I的凍存液凍存PBMC復蘇后誘導得到CIK細胞與未凍存的PBMC誘導得到的CIK細胞中CD3+CD56+T細胞的流式檢測圖，其中(a)為本發(fā)明實施例I的凍存液凍存的PBMC的檢測結果，(b)為未凍存的PBMC的檢測結果。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發(fā)明作進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明實施例提供了一種能提高外周血單個核細胞凍存復蘇后存活率，同時避免將復蘇后誘導培養(yǎng)的細胞回輸給患者時出現不良反應的外周血單個核細胞凍存液。該外周血單個核細胞凍存液包含10-12%(V/V)滲透性冷凍保護劑，10-14%(V/V) ￠-葡聚糖，8-10%(V/V)血清或血漿，64-72%(V/V)生理鹽水。具體地，上述滲透性冷凍保護劑可滲透到細胞內，防止細胞在凍存的時候生成冰晶損傷細胞從而起到保護作用，本發(fā)明實施例中所述滲透性冷凍保護劑選自甘油、DMS0、乙二醇和丙二醇中的一種或幾種，優(yōu)選的實施例中所述滲透性冷凍保護劑為DMS0，其優(yōu)選濃度為10%(V/V)。其中，V/V為體積百分比。上述實施例中使用￠-葡聚糖作為非滲透性冷凍保護劑可降低回輸給患者時的不良反應。葡聚糖是一種高分子葡萄糖聚合物，存在于某些微生物生長過程中分泌的粘液中，被美國FDA已認定是一種安全的物質，是目前最佳的血漿代用品之一，￠-葡聚糖是葡聚糖中最具生理活性的，廣泛用于醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)。本發(fā)明優(yōu)選實施例中所述^ -葡聚糖濃度為12%。上述生理鹽水優(yōu)選為注射用生理鹽水，用分析純氯化鈉配制，優(yōu)選濃度為68%。上述血清或血漿中的血清可為胎牛血清或小牛血清；血漿優(yōu)選為自體血漿，自體血漿為抗凝外周血分離出細胞后得到的血漿，因與PBMC細胞來自同一受試者，因此稱為自體血漿，自體血漿優(yōu)選濃度為10%。本發(fā)明實施例的外周血單個核細胞凍存液使用了 ￠-葡聚糖作為非滲透性冷凍保護劑，使凍存復蘇后的PBMC的存活率達到91. 56%左右，且使用本發(fā)明的PBMC凍存液的單個核細胞復蘇后經誘導培養(yǎng)得到的CIK細胞中CD3+CD56+T細胞的比例與未凍存的PBMC相比十分接近，且兩者的細胞生長曲線和增殖倍數沒有明顯差異，同時將該CIK細胞回輸給患者后未引起不適癥狀，因此本發(fā)明的PBMC凍存液相對于現有技術有顯著進步。本發(fā)明還提供一種外周血單個核細胞凍存方法，所述方法包括以下步驟( I)將外周血單個核細胞懸浮于細胞培養(yǎng)液中，獲得外周血單個核細胞懸液；(2)將所述外周血單個核細胞懸液本發(fā)明的外周血單個核細胞凍存液按照0.9-1. I I的比例混勻，分裝于細胞凍存管中；(3)將所述細胞凍存管放置于程序凍存盒中，先于_80° C冷凍，然后轉入液氮中凍存。優(yōu)選地，步驟(I)得到的PBMC細胞懸液中細胞密度為2-10X IO7個/ml。懸浮PBMC細胞的培養(yǎng)液可以是本領域常用的PBMC培養(yǎng)液，如RPMI1640培養(yǎng)液。步驟(2)中將PBMC細胞懸液與PBMC凍存液優(yōu)選以I : I的比例輕輕混合均勻，且使得分裝于細胞凍存管中的細胞數量為1-5 X IO7個/支，通過調整外周血單個核細胞的密度，以達到最佳凍存效果。優(yōu)選地，步驟(3)中將程序凍存盒于_80°C冷凍的時間為23-25小時，優(yōu)選時間為24小時。優(yōu)選地，在程序凍存盒中裝有純異丙醇，可實現每分鐘1°C的降溫。其中，純異丙醇可以是分析純的異丙醇或是工業(yè)中的純異丙醇。本發(fā)明的實施例中將PBMC凍存后復蘇，檢測細胞存活率，誘導培養(yǎng)為CIK細胞，并檢測所得的成熟CIK細胞中⑶3+⑶56+T細胞的百分比。同時將復蘇并誘導得到的CIK細胞回輸給患者并觀察臨床反應，以此檢測PBMC凍存效果。本發(fā)明的PBMC凍存方法使用了本發(fā)明的PBMC凍存液并在凍存盒中使用了異丙醇以達到緩慢線性降溫的目的，跟程序降溫儀相比具有同樣的緩慢降溫的效果，本發(fā)明的方法節(jié)約了細胞凍存成本。本發(fā)明實施例中涉及的細胞培養(yǎng)基及細胞培養(yǎng)方案均為本領域技術人員熟知，其中細胞培養(yǎng)基可從生物公司購得，細胞培養(yǎng)方案及相關參數可從本領域的教材或實驗指南中獲得?，F以具體外周血單個核細胞的凍存液及凍存方法為例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。實施例II.抽取健康志愿者外周血50ml，肝素抗凝，室溫700g離心20min，吸取上層血漿，56°C水浴30min ;下部細胞加D-PBS至50ml，混勻，緩慢加到2個裝有20ml人淋巴細胞分離液的50ml離心管中，室溫800g離心15min，吸取白膜層細胞，為外周血單個核細胞。上述700g離心后所得血漿于4°C靜置15min，900g離心30min，取自體血漿，按如下體積百分比的組分配制PBMC凍存液10%DMS0+12% ^ -葡聚糖+10%自體血漿+68%注射用生理鹽水。2. PBMC 的凍存(I)將上述分離得到的PBMC用PBS清洗兩次，之后用RPMI1640培養(yǎng)液重懸細胞，調整細胞密度至6 X IO7個/ml ； (2)將上述細胞懸液與PBMC凍存液按照I : I的體積比例輕輕混合均勻，分裝于細胞凍存管中，每管1ml，使細胞含量為3 XlO7個/支；(3)將上述細胞凍存管放置于程序凍存盒中，該凍存盒底部夾層內含有濃度為100%的異丙醇，然后將該程序凍存盒放入-80°c超低溫冰箱中，24h后轉入液氮罐中凍存。3. PBMC的復蘇及誘導培養(yǎng)(I)從液氮罐中取出一管已凍存的PBMC，迅速置于37°C水浴中l(wèi)min，使PBMC完全融化，取少量細胞用臺盼藍染色法檢測細胞存活率，結果見表I ;(2)將融化的細胞懸液轉移到15ml離心管中，800rpm離心3min ；(3)棄上清，向離心管中加入IOml CIK培養(yǎng)液,吹打均勻,800rpm離心3min ；
(4)棄上清，加適量CIK完全培養(yǎng)液(含血清和IL-2)，吹打均勻，轉移到預先包被處理的培養(yǎng)瓶中進行誘導培養(yǎng)；(5)將上述培養(yǎng)瓶置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中，每隔一天取樣對CIK細胞進行計數，并取未凍存PBMC進行誘導培養(yǎng)，兩者結果進行比較，見表2和圖I，誘導培養(yǎng)第13天收獲成熟的CIK細胞。4.誘導得到的CIK細胞的檢測用流式細胞儀檢測收獲的成熟CIK細胞中⑶3+⑶56+T細胞的百分比，并與未凍存PBMC誘導培養(yǎng)的結果進行比較，結果見圖2。5. CIK細胞回輸結果觀測選取100名受試者回輸以上所得的成熟CIK細胞，回輸后觀察24h，記錄反應結果。對比實施例II.取人外周血，分離得到外周血單個核細胞(PBMC)及自體血衆(zhòng)，按如下比例及組分配制PBMC凍存液10%DMS0+10%自體血漿+80%注射用生理鹽水。2. PBMC 的凍存實驗步驟同實施例I。3. PBMC復蘇后存活率檢測從液氮罐中取出一管已凍存的PBMC，迅速置于37°C水浴中l(wèi)min，使PBMC完全融化，取少量細胞用臺盼藍染色法檢測細胞存活率，結果見表I。結果I.實施例I中的PBMC凍存復蘇后細胞存活率檢測結果如表I所示。表I采用不同凍存液凍存的PBMC復蘇后的細胞存活率
^含12 P-葡聚糖不含P-葡聚糖 凍存液類型(實施例I )(對比實施例I )
細胞存活率(％)91.56 + 7. 4682. 23 + 9. 52由表I可見，實施例I中PBMC凍存并復蘇后細胞存活率高于對比實施例I中的細胞存活率，也高于目前已知的使用現有技術的凍存液凍存PBMC并復蘇后細胞存活率。2.實施例I的凍存組和對比實施例I的未凍存組的PBMC誘導培養(yǎng)得到的CIK細胞計數結果如表2和圖I所示。表2凍存組與未凍存組的PBMC誘導得到的CIK計數結果
權利要求
1.一種外周血單個核細胞凍存液，包含體積百分比為10-12%的滲透性冷凍保護劑，10-14%的P -葡聚糖，8-10%的血清或血漿，64-72%的生理鹽水。
2.根據權利要求I所述的外周血單個核細胞凍存液，其特征在于，所述滲透性冷凍保護劑選自甘油、二甲基亞砜、乙二醇和丙二醇中的一種或幾種。
3.根據權利要求I所述的外周血單個核細胞凍存液，其特征在于，所述生理鹽水為注射用生理鹽水。
4.根據權利要求I所述的外周血單個核細胞凍存液，其特征在于，所述血清為胎牛血清或小牛血清。
5.根據權利要求I所述的外周血單個核細胞凍存液，其特征在于，所述血漿為自體血漿。
6.一種外周血單個核細胞凍存方法，包括以下步驟 (1)將外周血單個核細胞懸浮于細胞培養(yǎng)液中，獲得外周血單個核細胞懸液； (2)將所述外周血單個核細胞懸液與權利要求1-5中任一項所述的外周血單個核細胞凍存液按照0.9-1. I I的比例混勻，分裝于細胞凍存管中； (3)將所述細胞凍存管放置于程序凍存盒中，先于-80°C冷凍，然后轉入液氮中凍存。
7.根據權利要求6所述的外周血單個核細胞凍存方法，其特征在于，所述步驟(I)得到的外周血單個核細胞懸液中細胞密度為2-10X IO7個/ml。
8.根據權利要求6所述的外周血單個核細胞凍存方法，其特征在于，所述步驟(2)中分裝于細胞凍存管中的細胞數量為1-5X IO7個/支。
9.根據權利要求6所述的外周血單個核細胞凍存方法，其特征在于，所述步驟(3)中的程序凍存盒內裝有純異丙醇。
10.根據權利要求6所述的外周血單個核細胞凍存方法，其特征在于，所述步驟(3)中將程序凍存盒于_80°C冷凍時間為23-25小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術領域。本發(fā)明提供一種外周血單個核細胞凍存液，包含10-12%(V/V)滲透性冷凍保護劑，10-14%(V/V)β-葡聚糖，8-10%(V/V)血清或血漿，64-72%(V/V)生理鹽水。本發(fā)明還提供一種外周血單個核細胞凍存方法，包括(1)將外周血單個核細胞懸浮于細胞培養(yǎng)液中，獲得外周血單個核細胞懸液；(2)將所述外周血單個核細胞懸液與權利要求1-5中任一項所述的外周血單個核細胞凍存液按照0.9-1.1∶1的比例混勻，分裝于細胞凍存管中；(3)將所述細胞凍存管放置于程序凍存盒中，先于-80℃冷凍，然后轉入液氮中凍存。
文檔編號A01N1/02GK102669087SQ201210149968
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月15日 優(yōu)先權日2012年5月15日
發(fā)明者劉韜 申請人:深圳市博泰生物醫(yī)療機構管理有限公司