專利名稱：利用重組過氧化物酶A4-Prx脫毒玉米酒糟生產(chǎn)飼料的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)飼料的方法，具體涉及ー種利用重組過氧化物酶Α4-ΡΓΧ脫毒玉米酒糟中ZEA毒素生產(chǎn)飼料的方法。
背景技術(shù)：
飼料和食品霉變是全世界普遍存在的問題，據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO) 2002年資料，全世界每年約有25%的農(nóng)作物糧食被霉菌毒素污染，而我國平均毎年由于霉變所引起的飼料損失占總產(chǎn)量的10%以上，最主要的霉變來源于錸刀菌產(chǎn)生的ー種雌激素類真菌毒素玉米赤霉纟布麗(ZEA) ο
ZEA性質(zhì)穩(wěn)定難降解，玉米及其副產(chǎn)品極易受ZEA污染。王金榮等對玉米DDGS(酒糟蛋白飼料)多個(gè)樣品調(diào)查結(jié)果顯示，ZEA的陽性檢出率均為100%，ZEA含量范圍為4. 79 1219. 90 μ g/kg，超出國家標(biāo)準(zhǔn)(玉米中ZEA含量彡60 μ g/kg) 5 20倍以上，其對DDGS為飼料的禽畜危害深遠(yuǎn)(王金榮，馬鵬，黃亞寬，等.2010年上半年DDGS常規(guī)養(yǎng)分含量差異及霉菌毒素污染狀況調(diào)查[J].飼料エ業(yè)，2011，32 (17) :61-64.)。生物轉(zhuǎn)化脫毒ZEA技術(shù)能避免物理和化學(xué)方法的去毒效果有限、營養(yǎng)物質(zhì)損失大、成本高和有害物質(zhì)殘留等缺點(diǎn)，已成為研究熱點(diǎn)和主要趨勢。日本Takahashi-Ando等人對粉紅粘帚霉(Clonostachys rosea)的研究較為全面,分離出的內(nèi)酯水解酶zhdlOl可破壞ZEA結(jié)構(gòu)，使其轉(zhuǎn)化為雌激素毒性較弱的化合物，且ZEA的降解率在80°/Γ90%之丨、日」(Kimara M, Naoko T, Nisniu-chi T. MolecularBiology and Biotechnology forReduction of Fusarium Mycotoxin Contamination. Pesticide Biochemistry andPhysiology, 2006, 86 (3) :117-123.)。大腸桿菌和釀酒酵母表達(dá)的重組zhdlOl表現(xiàn)出了內(nèi)酷水解酶的能力，對ZEA的降解率可達(dá)75%，具有zhdlOl的轉(zhuǎn)基因玉米也具備降解ZEA的HE力(Tomoko I, Naoko T, Noriyuki O, et ai. Reduced contamination by the fusariummycotoxin zearalenone in maizekernels through genetic modification with adetoxification gene. Applied andEnvironmental Microbiology,2007, 73(5):1622-1629.)。此外，奧地利Molnar從白蟻后腸中分離出了ー種新酵母菌一毛孢子菌屬Trichosporon mycotoxinivorans,它的培養(yǎng)物能將ZEA降解為ニ氧化碳和其它弱紫外吸收的代謝物，從而降低其毒性(Molnar O, Schatzmayr G, Fuchs E, et al. Trichosporonmycotoxinivorans sp. nov. , a new yeast species useful in Diologicaldetoxificationof various mycotoxins. Systematic and Applied Microbiology, 2004,27:661-671. XAbdullah從玉米地里分離的假單胞菌ZEA-I可利用ZEA為唯一碳源，并且在12h內(nèi)可將ZEA減少一半，編碼此ZEA降解酶的基因在大腸桿菌中也獲得了活性表達(dá)(AbdullaD.Altalhi, Bahig El—Deeb. Localization of zearalenone detoxificationgene(s)mpZEA—1 plasmid of Pseudomonas putida ZEA-I and expressed inEscherichia coli.JHazard Mater, 2009, 161:1166-1172.)。中國發(fā)明專利CN99101577.0公開了ー種菜籽餅發(fā)酵脫毒新方法，將菜籽餅同發(fā)酵劑(淀粉類副產(chǎn)品或三七糠或玉米粉或麩皮等)按ー定比例攪拌均勻，在常溫20°C以上，置于發(fā)酵池(防漏防滲)內(nèi)加水，水面溢出料面5厘米左右，發(fā)酵脫毒，從而得到優(yōu)質(zhì)飼料。本課題組成員從Acinetobacter sp. SMO4培養(yǎng)物上清液中分離到ー種有降解ZEA功能的過氧化物酶，克隆了其基因并在大腸桿菌E. coli BL2KDE3)中獲得了活性表達(dá)(YuYuanshan, Wu Hui, Tang Yuqian, et al.しloning, Expression of aperoxiredoxin geneirom Acinetobacter sp. SMO4 and characterization of its recombinant protein forzearalenone detoxifcation[J]. Microbiol Res, 2012, 167 (3):121-126. X

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供ー種利用重組過氧化物酶A4-Prx脫毒玉米酒糟生產(chǎn)飼料的方法，該方法能去除玉米DDGS中高達(dá)98%的ZEA毒素。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)ー種利用重組過氧化物酶Α4-ΡΓΧ脫毒玉米酒糟生產(chǎn)飼料的方法，包括如下步驟(I)制備重組過氧化物酶液A4-Prx :將重組大腸桿菌BL21/pET31b/A4_Prx接種于LB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至其OD6tltl值大于O. 5，添加IPTG繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4_5h，然后離心收集細(xì)胞后洗滌、重懸，超聲波破碎細(xì)胞后，離心收集上清液即為粗酶液；(2)飼料的制備將步驟(I)的粗酶液與玉米酒糟蛋白飼料(即玉米DDGS)混合，反應(yīng)并烘干后得到安全的、無毒的飼料，DDGS中ZEA的降解率達(dá)98%以上；步驟(I)所述的LB培養(yǎng)基中含有50 μ g/mL的氨芐青霉素；步驟(I)所述的添加IPTG優(yōu)選添加至IPTG的終濃度為O. 5mM ；步驟(I)所述的粗酶液中的過氧化物酶酶活大于300U/mL ；步驟(2)中，將粗酶液與玉米DDGS混合之前，每O. Ikg玉米DDGS要添加I. 5LNa2CO3水溶液，粗酶液中要添加H2O2至H2O2的終濃度為15_40mM ；步驟(2)所述的將粗酶液與玉米DDGS混合，每千克DDGS添加I. 5-2. OL粗酶液；步驟(2)所述的反應(yīng)是在68_70°C下反應(yīng)6_9h，所述的烘干是在45_50°C下烘干。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果采用本發(fā)明的方法，可降解DDGS中98%以上的ZEA毒素，使玉米酒糟或其他有毒飼料成為安全的飼料，實(shí)現(xiàn)了エ業(yè)殘?jiān)母咧祷谩?br>

圖I是利用重組過氧化物酶A4_Prx處理玉米酒糟DDGS中ZEA的液相檢測圖；A-過氧化物酶A4-Prx酶液處理DDGS樣品Oh后ZEA的液相檢測圖，B-過氧化物酶A4_Prx酶液處理DDGS樣品9h后ZEA的液相檢測圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
實(shí)施例Iー種利用重組過氧化物酶A4_Prx脫毒玉米酒糟生產(chǎn)飼料的方法，包括如下步驟(I)制備重組過氧化物酶液A4_Prx I.用LB固體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂20g/L，pH 7. 0，50 μ g/mL氨芐青霉素)活化重組大腸桿菌BL21/pET31b/A4-Prx，放置28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)I天。2.從活化LB固體培養(yǎng)基上挑取重組大腸桿菌BL21/pET31b/A4-Prx的單菌落，接種于LB液體種子培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，pH 7. O, 50 μ g/mL氨芐青霉素)中，28°C、220r/min振搖培養(yǎng)過夜，得到種液。3.取種液10mL，接入200mL的LB液體富集培養(yǎng)基中(胰蛋白胨10g/L，酵母抽提 物 5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂 20g/L, pH 7. O，50 μ g/mL 氨芐青霉素)中，28°C、250r/min 振搖培養(yǎng)，每隔Ih取樣檢測其0D_ ；6h后培養(yǎng)液0D_值達(dá)到0. 54，添加IPTG，使其終濃度為0. 5mM，繼續(xù)于 28°C、250r/min 搖床培養(yǎng) 4h。4.將培養(yǎng)液在10，OOOXg離心5min，棄上清，加入200mL 50mM的Tris-HCl緩沖液(pH8. 0)洗滌I次。添加200mL 50mM的Tris-HCl緩沖液(pH8. 0)，漩渦震蕩使菌體懸浮均勻，用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞(4°C，200W，15min)，10，OOOXg離心5min，收集上清液，即為粗酶液。5.粗酶液中過氧化物酶的酶活達(dá)316U/mL。過氧化物酶活測定方法如下取920 μ L 的 0. lmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)緩沖液、20 μ L 的 0. 2mol/L 4-氨基安替吡啉水溶液、20 μ L的0. 3mol/L苯酚溶液(用甲醇溶解)、ImL粗酶液，混合均勻。放置于70°C的恒溫水浴鍋中保持2min后，添加20 μ L的lmol/L的雙氧水啟動反應(yīng)。反應(yīng)5min后，用紫外分光光度計(jì)測A5tltl值。用ImL LB液體富集培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂20g/L，pH 7· 0，50 μ g/mL氨芐青霉素)作空白對照。粗酶液中過氧化物酶酶活的計(jì)算公式為I (U/mL)=60X每分鐘A5tltl的升高值/0.01 (I個(gè)過氧化物酶活性單位為實(shí)驗(yàn)規(guī)定的酶活力條件下，每小時(shí)吸光值A(chǔ)500升高0. 01個(gè)單位所需的酶量)。(2)飼料制備I.添加I. 5L 2%的Na2CO3水溶液(v/m)于0. Ikg玉米酒糟DDGS中，采用滾筒式攪拌器混合均勻。2.往150mL粗酶液中添加30%H202( g/mL)水溶液0. 17mL,使H2O2終濃度達(dá)到15mM，再添加到用處理Na2CO3后的DDGS中，30r/min拌料均勻，在68°C溫育5h，45°C烘干后，取樣檢測DDGS中的ZEA殘留，其降解率達(dá)到98. 6%，即得到安全的、無毒的飼料。檢測ZEA降解率的方法如下取2g粗酶液處理后DDGS，加入2mL 0. IM Tris-HCl (pH 9. 0)及15mLこ腈，常溫旋潤振搖IOmin,濾紙過濾。用PuriToxSR TC-M160真菌毒素多功能凈化柱過濾5mL濾液,收集流出液體3mL于60°C下N2蒸發(fā)儀蒸干后用500 μ L流動相溶解，溶解液用于高效液相色譜(HPLC)分析檢測ZEA的殘留量。高效液相色譜(HPLC)檢測ZEA的條件色譜柱采用Waters XTerraE MS C18柱(4· 6 X 150mm, 5 μ m)。流動相為こ腈水甲醇=46 : 46 : 8。柱溫30°C,流量為lmL/min。結(jié)果采用熒光檢測器，激發(fā)波長274nm，發(fā)射波長450nm。設(shè)置對照組中，使用去離子水代替
酶液。結(jié)果以相對降解率表示。計(jì)算公式如下
權(quán)利要求
1.一種利用重組過氧化物酶A4-Prx脫毒玉米酒糟生產(chǎn)飼料的方法，其特征在于包括如下步驟 Cl)制備重組過氧化物酶液A4-Prx :將重組大腸桿菌BL21/pET31b/A4-Prx接種于LB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至其0D_值大于O. 5，添加IPTG繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4-5h，然后離心收集細(xì)胞后洗滌、重懸，超聲波破碎細(xì)胞后，離心收集上清液即為粗酶液； (2)飼料的制備將步驟(I)的粗酶液與玉米DDGS混合，反應(yīng)并烘干后得到安全的、無 毒的飼料。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用重組過氧化物酶A4-Prx脫毒玉米酒糟生產(chǎn)飼料的方法，其特征在于步驟(I)所述的LB培養(yǎng)基中含有50 μ g/mL的氨芐青霉素。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用重組過氧化物酶A4-Prx脫毒玉米酒糟生產(chǎn)飼料的方法，其特征在于步驟(I)所述的添加IPTG為添加至IPTG的終濃度為O. 5mM。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用重組過氧化物酶A4-Prx脫毒玉米酒糟生產(chǎn)飼料的方法，其特征在于步驟(I)所述的粗酶液中的過氧化物酶酶活大于300U/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用重組過氧化物酶A4-Prx脫毒玉米酒糟生產(chǎn)飼料的方法，其特征在于步驟(2)中，將粗酶液與玉米DDGS混合之前，每O. Ikg玉米DDGS要添加I. 5LNa2CO3水溶液，粗酶液中要添加H2O2至H2O2的終濃度為15_40mM。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用重組過氧化物酶A4-Prx脫毒玉米酒糟生產(chǎn)飼料的方法，其特征在于步驟(2)所述的將粗酶液與玉米DDGS混合，每千克DDGS添加I. 5-2. OL粗酶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用重組過氧化物酶A4-Prx脫毒玉米酒糟生產(chǎn)飼料的方法，其特征在于步驟(2)所述的反應(yīng)是在68-70°C下反應(yīng)6-9h，所述的烘干是在45_50°C下烘干。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用重組過氧化物酶A4-Prx脫毒玉米酒糟生產(chǎn)飼料的方法，該方法包括如下步驟(1)制備重組過氧化物酶液A4-Prx將重組大腸桿菌BL21/pET31b/A4-Prx接種于LB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至其OD600值大于0.5，添加IPTG繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4-5h，然后離心收集細(xì)胞后洗滌、重懸，超聲波破碎細(xì)胞后，離心收集上清液即為粗酶液；(2)飼料的制備將步驟(1)的粗酶液與玉米DDGS混合，反應(yīng)并烘干后得到安全的、無毒的飼料。采用本發(fā)明的方法，可降解DDGS中98%以上的ZEA毒素，使玉米酒糟或其他有毒飼料成為安全的飼料，實(shí)現(xiàn)了工業(yè)殘?jiān)母咧祷谩?br> 文檔編號A23K1/165GK102669414SQ201210152168
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月15日
發(fā)明者余元善, 唐語謙, 張楊揚(yáng), 李丹, 李慶全, 肖俊梅, 陳深亮, 陳瑜楠, 陳藝 申請人:華南理工大學(xué)