專利名稱：一種紅豆杉葉片愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)的方法及其所用的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種紅豆杉葉片愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)的方法及所用的培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
紫杉醇(Taxol)是從紅豆杉科紅豆杉屬(Tkro1S spp.)植物的樹(shù)皮中提取的ー種天然抗癌紫杉烷類化合物，是目前世界公認(rèn)的最好的廣譜、強(qiáng)活性天然抗癌藥。由于紅豆杉屬植物生長(zhǎng)緩慢，紫杉醇含量較低，僅占樹(shù)皮干質(zhì) 量的O. 01% - O. 02%，枝葉干質(zhì)量的十萬(wàn)分之一左右。因此隨著全球?qū)σ吧t豆杉資源保護(hù)措施的不斷加強(qiáng)，利用野生資源生產(chǎn)紫杉醇已無(wú)可能，而現(xiàn)階段人工種植的紅豆杉資源量還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足紫杉醇生產(chǎn)的需求量。運(yùn)用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)紅豆杉愈傷組織進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，獲取人們需要的活性產(chǎn)物可望成為紫杉醇生產(chǎn)的重要途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之ー為了解決上述的運(yùn)用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)紅豆杉愈傷組織進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，獲取人們需要的活性產(chǎn)物紫杉醇的問(wèn)題而提供了一種紅豆杉葉片愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)的方法。本發(fā)明的目的之ニ是提供上述的一種紅豆杉葉片愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)的方法所用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基。本發(fā)明的技術(shù)方案
一種紅豆杉葉片愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)的方法，即以南方紅豆杉的葉片為外植體，先后分別在誘導(dǎo)培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)后，最終得到紅豆杉葉片愈傷組織。上述的一種紅豆杉葉片愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)的方法，具體包括如下步驟
(1)、外植體的消毒
取當(dāng)年生南方紅豆杉的幼嫩葉片，經(jīng)流水沖洗，然后依次用酒精、氯化汞消毒，蒸餾水洗凈后獲得消毒的紅豆杉外植體；
(2)、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)
將步驟(I)所得的消毒的紅豆杉外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，控制溫度為20_22°C條件下暗培養(yǎng)，20天后得到誘導(dǎo)培養(yǎng)后的愈傷組織；
所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按每升計(jì)算，
由 400mg NH4NO3>556mg Ca (NO3) 2· 4H20、990 mg K2SO4,96 mg CaCl2. 2H20、170 mg KH2PO4,0. 25 mg Na2MoO4. 2H20、370 mg MgSO4. 7H20、22. 4mg MnSO4. H20、8. 6mg ZnSO4. 7H20、0. 25mgCuSO4. 5H20、27.8 mg FeSO4. 7H20、37. 3 mg Na2-EDTAUOO mg 肌醇、I. Omg 維生素 B1、0. 5 mg煙酸、0. 5 mg維生素B6、2. 0 mg甘氨酸、Img卩引哚乙酸(IBA)、0. 25mg 6-節(jié)基票呤(6-BA)、O. 5mg水解酪蛋白(CH)、20 g鹿糖、8g瓊脂、2g活性炭和余量的水組成；或由 400mg NH4N03、556mg Ca (NO3) 2· 4H20、990 mg K2SO4,96 mg CaCl2. 2H20、170 mgKH2PO4>0. 25 mg Na2MoO4. 2H20、370 mg MgSO4. 7H20、22. 4mg MnSO4. H20、8. 6mg ZnSO4. 7H20、0. 25mg CuSO4. 5H20、27. 8 mg FeSO4. 7H20、37. 3 mg Na2-EDTAUOO mg肌醇、I. Omg維生素BI、0. 5 mg 煙酸、0.5 mg 維生素 B6、2.0 mg 甘氨酸、2mg ΙΒΑ、0· 5mg CH >20 g 鹿糖、8g 瓊脂、2g活性炭和余量的水組成；
或由 1650mg NH4N03、1900mg KN03、440mg CaCl2 *2H20,370mg MgSO4 ·7Η20、170mg KH2PO4,0. 83mg KI、6. 2 mgH3B03、22. 3mg、MnSO4 · 4H20、8. 6mg ZnSO4 · 7H20、0. 25mg Na2MnO4 · 2H20、0. 025mg CuSO4 · 5H20、0. 025mg CoCl2 · 6H20、27. 8mg FeSO4 · 7H20、37. 3mg Na2-EDTA · 2H20、100 mg 肌醇、I. Omg 維生素 B1、0. 5 mg 煙酸、0.5 mg 維生素 B6、2.0 mg 甘氨酸、2mg IBA、O. 5mg CH >20 g鹿糖、8g瓊脂、2g活性炭和余量的水組成；
(3)、愈傷組織繼代培養(yǎng)
將步驟(2)所得的初代愈傷組織接種于繼代培養(yǎng)基上，在20-22°C條件下暗培養(yǎng)，得到繼代培養(yǎng)后的愈傷組織；
所述的繼代培養(yǎng)基，按每升計(jì)算，
由 400mg NH4NO3>556mg Ca (NO3) 2· 4H20、990 mg K2SO4,96 mg CaCl2. 2H20、170 mg KH2PO4,0. 25 mg Na2MoO4. 2H20、370 mg MgSO4. 7H20、22. 4mg MnSO4. H20、8. 6mg ZnSO4. 7H20、0. 25mgCuSO4. 5H20、27.8 mg FeSO4. 7H20、37. 3 mg Na2-EDTAUOO mg 肌醇、I. Omg 維生素 B1、0. 5 mg煙酸、0. 5 mg維生素B6、2. 0 mg甘氨酸、2 mg 2，4-ニ氯苯氧こ酸(2，4_D)、1 mg 6-BA >20g鹿糖、8g瓊脂、2g活性炭和余量的水組成；
或由 400mg NH4N03、556mg Ca (NO3) 2· 4H20、990 mg K2SO4,96 mg CaCl2. 2H20、170 mgKH2PO4>0. 25 mg Na2MoO4. 2H20、370 mg MgSO4. 7H20、22. 4mg MnSO4. H20、8. 6mg ZnSO4. 7H20、0. 25mg CuSO4. 5H20、27. 8 mg FeSO4. 7H20、37. 3 mg Na2-EDTAUOO mg肌醇、I. Omg維生素BI、0. 5 mg煙酸、0· 5 mg維生素Β6、2·0 mg甘氨酸、2mg 2，4_D、0· 5mg CH >20 g鹿糖、8g瓊脂、2g活性炭和余量的水組成；
或由 1650mg NH4N03、1900mg KN03、440mg CaCl2 *2H20,370mg MgSO4 ·7Η20、170mg KH2PO4,0. 83mg KI、6. 2 mgH3B03、22. 3mg、MnSO4 · 4H20、8. 6mg ZnSO4 · 7H20、0. 25mg Na2MnO4 · 2H20、0. 025mg CuSO4 · 5H20、0. 025mg CoCl2 · 6H20、27. 8mg FeSO4 · 7H20、37. 3mg Na2-EDTA · 2H20、100 mg 肌醇、I. Omg 維生素 B1、0. 5 mg 煙酸、0.5 mg 維生素 B6、2.0 mg 甘氨酸、2 mg 2，4_D、1 mg 6-BA >20 g鹿糖、8g瓊脂、2g活性炭和余量的水組成。本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明以紅豆杉葉片為外植體，由于采用了本發(fā)明所特有的誘導(dǎo)培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基，最終所得的愈傷組織誘導(dǎo)率為100%，生長(zhǎng)速率為O. 78g/L. d，出愈時(shí)間15d，因此具有誘導(dǎo)率高、出愈時(shí)間短、生長(zhǎng)速度快、污染率低等特點(diǎn)。另外，本發(fā)明的一種紅豆杉葉片愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)的方法，解決了運(yùn)用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)紅豆杉愈傷組織進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)的問(wèn)題。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)ー步闡述，但并不限制本發(fā)明。實(shí)施例I一種紅豆杉葉片愈傷組織的誘導(dǎo)方法，具體包括如下步驟
(1)、外植體的消毒
取當(dāng)年生南方紅豆杉的幼嫩葉片，流水沖洗4h，依次用70%的酒精消毒30s、l%氯化汞消毒8min，無(wú)菌水沖洗干凈；
(2)、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)
將步驟(I)所得的消毒的紅豆杉外置體用刀片將葉片劃傷后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，控制溫度為20-22°C條件下暗培養(yǎng)20天后，得到誘導(dǎo)培養(yǎng)后的愈傷組織；
所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按每升計(jì)算，由 400mg NH4NO3^ 556mg Ca (NO3) 2· 4H20、990 mg K2SO4,96 mg CaCl2. 2H20、170 mg KH2PO4>0. 25 mg Na2MoO4. 2H20、370 mg MgSO4. 7H20、22. 4mg MnSO4.H2O>8. 6mg ZnSO4. 7H20、0. 25mg CuSO4. 5H20、27. 8 mg FeSO4. 7H20、37. 3 mg Na2-EDTA> 100 mg肌醇、I. Omg 維生素 B1、0. 5 mg 煙酸、0.5 mg 維生素 Β6、2· 0 mg 甘氨酸、Img ΙΒΑ、0· 25mg6-BA、0.5mg CH、20 g蔗糖、8g瓊脂、2g活性炭和余量的水組成;
(3)、愈傷組織繼代培養(yǎng)
將步驟(2)所得的初代愈傷組織接種于繼代培養(yǎng)基上，在20-22°C條件下暗培養(yǎng)20天后，得到繼代培養(yǎng)后的愈傷組織；
所述的繼代培養(yǎng)基，按每升計(jì)算，由 400mg NH4NO3^ 556mg Ca (NO3) 2· 4H20、990 mg K2SO4,96 mg CaCl2. 2H20、170 mg KH2PO4>0. 25 mg Na2MoO4. 2H20、370 mg MgSO4. 7H20、22. 4mg MnSO4.H2O>8. 6mg ZnSO4. 7H20、0. 25mg CuSO4. 5H20、27. 8 mg FeSO4. 7H20、37. 3 mg Na2_EDTA、100 mg肌醇、I. Omg 維生素 B1、0. 5 mg 煙酸、0.5 mg 維生素 B6、2.0 mg 甘氨酸、2mg 2，4_D、0· 5mgCH >20 g鹿糖、8g瓊脂、2g活性炭和余量的水組成。 實(shí)施例2
一種紅豆杉葉片愈傷組織的誘導(dǎo)方法，具體包括如下步驟
(1)、外植體的消毒
取當(dāng)年生南方紅豆杉的幼嫩葉片，流水沖洗4h，依次用70%的酒精消毒30s、l%氯化汞消毒8min，無(wú)菌水沖洗干凈；
(2)、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)
將步驟(I)所得的消毒的紅豆杉外植體用刀片將葉片劃傷后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，控制溫度為20-22°C條件下暗培養(yǎng)20天后，得到誘導(dǎo)培養(yǎng)后的愈傷組織；
所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按每升計(jì)算，由 400mg NH4NO3^ 556mg Ca (NO3) 2· 4H20、990 mg K2SO4,96 mg CaCl2. 2H20、170 mg KH2PO4>0. 25 mg Na2MoO4. 2H20、370 mg MgSO4. 7H20、22. 4mg MnSO4.H2O>8. 6mg ZnSO4. 7H20、0. 25mg CuSO4. 5H20、27. 8 mg FeSO4. 7H20、37. 3 mg Na2_EDTA、100 mg肌醇、I. Omg 維生素 B1、0. 5 mg 煙酸、0.5 mg 維生素 B6、2.0 mg 甘氨酸、2mg ΙΒΑ、0· 5mg CH>20 g鹿糖、8g瓊脂、2g活性炭和余量的水組成，pH5. 8 ;
(3)、愈傷組織繼代培養(yǎng)
將步驟(2)所得的初代愈傷組織接種于繼代培養(yǎng)基上，在20-22°C條件下暗培養(yǎng)20天后，得到繼代培養(yǎng)后的愈傷組織；
所述的繼代培養(yǎng)基，按每升計(jì)算，由 400mg NH4NO3^ 556mg Ca (NO3) 2· 4H20、990 mg K2SO4,96 mg CaCl2. 2H20、170 mg KH2PO4>0. 25 mg Na2MoO4. 2H20、370 mg MgSO4. 7H20、22. 4mg MnSO4.H2O>8. 6mg ZnSO4. 7H20、0. 25mg CuSO4. 5H20、27. 8 mg FeSO4. 7H20、37. 3 mg Na2_EDTA、100 mg肌醇、I. Omg 維生素 Β1、0· 5 mg 煙酸、O. 5 mg 維生素 B6、2.0 mg 甘氨酸、2 mg 2，4_D、1 mg6-BA >20 g鹿糖、8g瓊脂、2g活性炭和余量的水組成。
實(shí)施例3
一種紅豆杉葉片愈傷組織的誘導(dǎo)方法，具體包括如下步驟
(1)、外植體的消毒
取當(dāng)年生南方紅豆杉的幼嫩葉片，流水沖洗4h，依次用70%的酒精消毒30s、l%氯化汞消毒8min，無(wú)菌水沖洗干凈；
(2)、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)
將步驟(I)所得的消毒的紅豆杉外植體用刀片將葉片劃傷后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，控制溫度為20-22°C條件下暗培養(yǎng)20天，得到誘導(dǎo)培養(yǎng)后的愈傷組織；
所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基按每升計(jì)算，由1650mg NH4NO3^1900mg KN03、440mg CaCl2 · 2H20、370mg MgSO4 · 7H20、170mg KH2PO4^0. 83mg KI、6. 2 mgH3B03、22. 3mg、MnSO4 · 4H20、8. 6mgZnSO4 · 7H20、0. 25mg Na2MnO4 · 2H20、0. 025mg CuSO4 · 5H20、0. 025mg CoCl2 · 6H20、27. 8mgFeSO4 · 7H20、37. 3mg Na2-EDTA · 2H20、100 mg 肌醇、I. Omg 維生素 Β1、0· 5 mg 煙酸、0. 5 mg維生素B6、2.0 mg甘氨酸、2mg IBA、0· 5mg CH >20 g鹿糖、8g瓊脂、2g活性炭和余量的水組成；
(3)、愈傷組織繼代培養(yǎng)
將步驟(2)所得的初代愈傷組織接種于繼代培養(yǎng)基上，在20-22°C條件下暗培養(yǎng)20天后，得到繼代培養(yǎng)后的愈傷組織；
所述的繼代培養(yǎng)基，按每升計(jì)算，由1650mg NH4NO3^ 1900mg KN03、440mg CaCl2 · 2H20、370mg MgSO4 · 7H20、170mg KH2PO4^0. 83mg KI、6. 2 mgH3B03、22. 3mg、MnSO4 · 4H20、8. 6mgZnSO4 · 7H20、0. 25mg Na2MnO4 · 2H20、0. 025mg CuSO4 · 5H20、0. 025mg CoCl2 · 6H20、27. 8mgFeSO4 · 7H20、37. 3mg Na2-EDTA · 2H20、100 mg 肌醇、I. Omg 維生素 Β1、0· 5 mg 煙酸、0. 5 mg維生素B6、2. O mg甘氨酸、2 mg 2，4_D、1 mg 6-BA >20 g鹿糖、8g瓊脂、2g活性炭和余量的水組成。將上述各實(shí)施例中步驟(2)經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)20天后所得到的誘導(dǎo)培養(yǎng)后的愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)率和出愈時(shí)間的統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表I。表I、實(shí)施例1-3所得的誘導(dǎo)培養(yǎng)后的愈傷組織的誘導(dǎo)率、出愈時(shí)間和污染率情況
培養(yǎng)基I誘導(dǎo)率I出愈時(shí)間I污染率
實(shí)施例 I 100%152.4%
實(shí)施例 2 95%185.8%
實(shí)施例 3 [85%115[2.9%
從表I中可以看出以實(shí)施例I的所用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，最終結(jié)果所得的誘導(dǎo)率最高，出愈
時(shí)間最短、污染率最低。統(tǒng)計(jì)上述各實(shí)施例中步驟(3)經(jīng)繼代培養(yǎng)20天后所得到的繼代培養(yǎng)后的愈傷組織的生長(zhǎng)率，結(jié)果見(jiàn)表2。表2、實(shí)施例1-3所得的繼代培養(yǎng)后的愈傷組織的生長(zhǎng)率情況
培養(yǎng)基|生長(zhǎng)速率4/し.(1)_^
實(shí)施例I O. 56
實(shí)施例2 O. 78_
實(shí)施例3~1θ. 32_從表2中可以看出，實(shí)施例I經(jīng)繼代培養(yǎng)基后，最終結(jié)果所得的生長(zhǎng)速率最快。綜上所述，本發(fā)明的一種紅豆杉葉片愈傷組織的誘導(dǎo)方法，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方，按每升計(jì)算，由 400mg NH4N03、556mg Ca (NO3) 2· 4H20、990 mg K2SO4,96 mg CaCl2. 2H20、170mg KH2PO4>0. 25 mg Na2MoO4. 2H20、370 mg MgSO4. 7H20、22. 4mg MnSO4. H2O>8. 6mg ZnSO4. 7H20、0. 25mg CuSO4. 5H20、27. 8 mg FeSO4. 7H20、37. 3 mg Na2-EDTAUOO mg肌醇、I. Omg維生素BI、0. 5 mg 煙酸、0.5 mg 維生素 B6、2.0 mg 甘氨酸、Img ΙΒΑ、0· 25mg 6_BA、0. 5mg CH >20 g 鹿糖、8g瓊脂、2g活性炭和余量的水組成；
最佳繼代培養(yǎng)基配方，按姆升計(jì)算，由400mg NH4N03、556mg Ca (NO3) 2· 4H20、990 mgK2SO4>96 mg CaCl2. 2H20、170 mg KH2PO4^ 0. 25 mg Na2MoO4. 2H20、370 mg MgSO4. 7H20、22. 4mgMnSO4. H20、8. 6mg ZnSO4. 7H20、0. 25mg CuSO4. 5H20、27. 8 mg FeSO4. 7H20、37. 3 mg Na 2-EDTA>100 mg肌醇、I. Omg 維生素B1、0. 5 mg煙酸、0. 5 mg 維生素 B6、2.0 mg 甘氨酸、2mg 2，4_D、
0.5mg CH >20 g鹿糖、8g瓊脂、2g活性炭和余量的水組成。上述內(nèi)容僅為本發(fā)明構(gòu)思下的基本說(shuō)明，而依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案所作的任何等效變換，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種紅豆杉葉片愈傷組織的誘導(dǎo)方法，其特征在于具體包括如下步驟 (1)、外植體的消毒 取當(dāng)年生南方紅豆杉的幼嫩葉片，經(jīng)流水沖洗，然后依次用酒精、氯化汞消毒，蒸餾水洗凈后獲得消毒的紅豆杉外植體； (2)、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng) 將步驟(I)所得的消毒的紅豆杉外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，控制溫度為20-22°C條件下暗培養(yǎng)，20天后得到誘導(dǎo)培養(yǎng)后的愈傷組織； 所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按每升計(jì)算，由 400mg NH4NO3>556mg Ca (NO3) 2· 4H20、990 mg K2SO4,96 mg CaCl2. 2H20、170 mg KH2PO4,0. 25 mg Na2MoO4. 2H20、370 mg MgSO4. 7H20、22. 4mg MnSO4. H20、8. 6mg ZnSO4. 7H20、0. 25mgCuSO4. 5H20、27.8 mg FeSO4. 7H20、37. 3 mg Na2-EDTAUOO mg 肌醇、I. Omg 維生素 B1、0. 5 mg煙酸、0. 5 mg 維生素 B6、2.0 mg 甘氨酸、Img ΙΒΑ、0· 25mg 6_BA、0. 5mg CH >20 g 鹿糖、8g瓊脂、2g活性炭和余量的水組成；或由 400mg NH4N03、556mg Ca (NO3) 2· 4H20、990 mg K2SO4,96 mg CaCl2. 2H20、170 mgKH2PO4>0. 25 mg Na2MoO4. 2H20、370 mg MgSO4. 7H20、22. 4mg MnSO4. H20、8. 6mg ZnSO4. 7H20、0. 25mg CuSO4. 5H20、27. 8 mg FeSO4. 7H20、37. 3 mg Na2-EDTAUOO mg肌醇、I. Omg維生素BI0. 5 mg 煙酸、0.5 mg 維生素 B6、2.0 mg 甘氨酸、2mg ΙΒΑ、0· 5mg CH >20 g 鹿糖、8g 瓊脂、2g活性炭和余量的水組成；或由 1650mg NH4NO3^ 1900mg KN03、440mg CaCl2 *2H20,370mg MgSO4 ·7Η20、170mg KH2PO4'0. 83mg KI、6. 2 mgH3B03、22. 3mg、MnSO4 · 4H20、8. 6mg ZnSO4 · 7H20、0. 25mg Na2MnO4 ·2H200. 025mg CuSO4 · 5H20、0. 025mg CoCl2 · 6H20、27. 8mg FeSO4 · 7H20、37. 3mg Na2-EDTA · 2H20、100 mg 肌醇、I. Omg 維生素 B1、0. 5 mg 煙酸、0.5 mg 維生素 B6、2.0 mg 甘氨酸、2mg IBA、O. 5mg CH >20 g鹿糖、8g瓊脂、2g活性炭和余量的水組成； (3)、愈傷組織繼代培養(yǎng) 將步驟(2)所得的初代愈傷組織接種于繼代培養(yǎng)基上，在20-22°C條件下暗培養(yǎng)，20天后得到繼代培養(yǎng)后的愈傷組織； 所述的繼代培養(yǎng)基，按每升計(jì)算，由 400mg NH4NO3>556mg Ca (NO3) 2· 4H20、990 mg K2SO4,96 mg CaCl2. 2H20、170 mg KH2PO4,0. 25 mg Na2MoO4. 2H20、370 mg MgSO4. 7H20、22. 4mg MnSO4. H20、8. 6mg ZnSO4. .7H20、.0. .25mgCuSO4. 5H20、27.8 mg FeSO4. 7H20、37. 3 mg Na2-EDTAUOO mg 肌醇、I. Omg 維生素 B1、0. 5 mg煙酸、0. 5 mg 維生素 B6、2. 0 mg 甘氨酸、2 mg 2，4_D、1 mg 6-BA >20 g 鹿糖、8g 瓊脂、2g活性炭和余量的水組成；或由 400mg NH4N03、556mg Ca (NO3) 2· 4H20、990 mg K2SO4,96 mg CaCl2. 2H20、170 mgKH2PO4>0. 25 mg Na2MoO4. 2H20、370 mg MgSO4. 7H20、22. 4mg MnSO4. H20、8. 6mg ZnSO4. 7H20、0. 25mg CuSO4. 5H20、27. 8 mg FeSO4. 7H20、37. 3 mg Na2-EDTAUOO mg肌醇、I. Omg維生素BI、.0. 5 mg煙酸、0· 5 mg維生素Β6、2·0 mg甘氨酸、2mg 2，4_D、0· 5mg CH >20 g鹿糖、8g瓊脂、2g活性炭和余量的水組成；或由 1650mg NH4N03、1900mg KN03、440mg CaCl2 *2H20,370mg MgSO4 ·7Η20、170mg KH2PO4,0. 83mg KI、6. 2 mgH3B03、22. 3mg、MnSO4 · 4H20、8. 6mg ZnSO4 · 7H20、0. 25mg Na2MnO4 · 2H20、.O. 025mg CuSO4 · 5Η20、0· 025mg CoCl2 · 6Η20、27· 8mg FeSO4 · 7H20、37. 3mg Na2-EDTA · 2H20、.00 mg 肌醇、I. Omg 維生素 B1、0. 5 mg 煙酸、0.5 mg 維生素 B6、2.0 mg 甘氨酸、2 mg 2，4_D、1 mg 6-BA >20 g鹿糖、8g瓊脂、2g活性炭和余量的水組成。
2.如權(quán)利要求I所述的ー種紅豆杉葉片愈傷組織的誘導(dǎo)方法，其特征在于步驟(I)中取當(dāng)年生紅豆杉的幼嫩葉片，經(jīng)流水沖洗4h，然后依次用70%的酒精消毒30s、l%氯化汞消毒8min，無(wú)菌水沖洗干凈。
3.如權(quán)利要求I或2所述的ー種紅豆杉葉片愈傷組織的誘導(dǎo)方法，其特征在于所用的紅豆杉葉片愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按每升計(jì)算，由 400mg NH4NO3>556mg Ca (NO3) 2· 4H20、990 mg K2SO4,96 mg CaCl2. 2H20、170 mg KH2PO4,0. 25 mg Na2MoO4. 2H20、370 mg MgSO4. 7H20、22. 4mg MnSO4. H20、8. 6mg ZnSO4. 7H20、0. 25mgCuSO4. 5H20、27.8 mg FeSO4. 7H20、37. 3 mg Na2-EDTAUOO mg 肌醇、I. Omg 維生素 B1、0. 5 mg煙酸、0. 5 mg 維生素 B6、2.0 mg 甘氨酸、Img ΙΒΑ、0· 25mg 6_BA、0. 5mg CH >20 g 鹿糖、8g瓊脂、2g活性炭和余量的水組成；或由 400mg NH4N03、556mg Ca (NO3) 2· 4H20、990 mg K2SO4,96 mg CaCl2. 2H20、170 mgKH2PO4>0. 25 mg Na2MoO4. 2H20、370 mg MgSO4. 7H20、22. 4mg MnSO4. H20、8. 6mg ZnSO4. 7H20、0. 25mg CuSO4. 5H20、27. 8 mg FeSO4. 7H20、37. 3 mg Na2-EDTAUOO mg肌醇、I. Omg維生素BI、0. 5 mg 煙酸、0.5 mg 維生素 B6、2.0 mg 甘氨酸、2mg ΙΒΑ、0· 5mg CH >20 g 鹿糖、8g 瓊脂、2g活性炭和余量的水組成；或由 1650mg NH4N03、1900mg KN03、440mg CaCl2 *2H20,370mg MgSO4 ·7Η20、170mg KH2PO4,0. 83mg KI、6. 2 mgH3B03、22. 3mg、MnSO4 · 4H20、8. 6mg ZnSO4 · 7H20、0. 25mg Na2MnO4 · 2H20、0. 025mg CuSO4 · 5H20、0. 025mg CoCl2 · 6H20、27. 8mg FeSO4 · 7H20、37. 3mg Na2-EDTA · 2H20、100 mg 肌醇、I. Omg 維生素 B1、0. 5 mg 煙酸、0.5 mg 維生素 B6、2.0 mg 甘氨酸、2mg IBA、O. 5mg CH >20 g鹿糖、8g瓊脂、2g活性炭和余量的水組成。
4.如權(quán)利要求3所述的ー種紅豆杉葉片愈傷組織的誘導(dǎo)方法，其特征在于所用的紅豆杉葉片愈傷組織的繼代培養(yǎng)基，按每升計(jì)算，由 400mg NH4NO3>556mg Ca (NO3) 2· 4H20、990 mg K2SO4,96 mg CaCl2. 2H20、170 mg KH2PO4,0. 25 mg Na2MoO4. 2H20、370 mg MgSO4. 7H20、22. 4mg MnSO4. H20、8. 6mg ZnSO4. 7H20、0.25mgCuSO4. 5H20、27.8 mg FeSO4. 7H20、37. 3 mg Na2-EDTAUOO mg 肌醇、I. Omg 維生素 B1、0. 5 mg煙酸、0. 5 mg 維生素 B6、2. 0 mg 甘氨酸、2 mg 2，4_D、1 mg 6-BA >20 g 鹿糖、8g 瓊脂、2g活性炭和余量的水組成；或由 400mg NH4N03、556mg Ca (NO3) 2· 4H20、990 mg K2SO4,96 mg CaCl2. 2H20、170 mgKH2PO4>0. 25 mg Na2MoO4. 2H20、370 mg MgSO4. 7H20、22. 4mg MnSO4. H20、8. 6mg ZnSO4. .H20、..25mg CuSO4. 5H20、27. 8 mg FeSO4. 7H20、37. 3 mg Na2-EDTAUOO mg肌醇、I. Omg維生素BI、0. 5 mg煙酸、0· 5 mg維生素Β6、2·0 mg甘氨酸、2mg 2，4_D、0· 5mg CH >20 g鹿糖、8g瓊脂、2g活性炭和余量的水組成；或由 1650mg NH4N03、1900mg KN03、440mg CaCl2 *2H20,370mg MgSO4 ·7Η20、170mg KH2PO4,0. 83mg KI、6. 2 mgH3B03、22. 3mg、MnSO4 · 4H20、8. 6mg ZnSO4 · 7H20、0. 25mg Na2MnO4 · .H200. 025mg CuSO4 · 5H20、0. 025mg CoCl2 · 6H20、27. 8mg FeSO4 · 7H20、37. 3mg Na2-EDTA · 2H20、100 mg 肌醇、I. Omg 維生素 B1、0. 5 mg 煙酸、0.5 mg 維生素 B6、2.0 mg 甘氨酸、2 mg 2，4_D、1 mg 6-BA >20 g鹿糖、8g瓊脂、2g活 性炭和余量的水組成。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種紅豆杉葉片愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)的方法。即以當(dāng)年生南方紅豆杉的幼嫩葉片為外植體，消毒后接種于特定的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在20-22℃條件下暗培養(yǎng)20天后，選取疏松、淡黃色的愈傷組織，轉(zhuǎn)入特定的繼代培養(yǎng)基中，在20-22℃條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng)20天后即得到紅豆杉葉片的愈傷組織。本發(fā)明的一種紅豆杉葉片愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)的方法，具有誘導(dǎo)率高、出愈時(shí)間短、生長(zhǎng)速度快、污染率低等特點(diǎn)，并解決運(yùn)用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)紅豆杉愈傷組織進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)的問(wèn)題。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102640710SQ20121015688
公開(kāi)日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月21日
發(fā)明者侯梅芳, 姜育龍, 宋麗莉, 張妤萍, 趙華強(qiáng) 申請(qǐng)人:上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院