專利名稱：人源dcf1基因轉(zhuǎn)基因果蠅模型的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種轉(zhuǎn)基因果蠅模型的構(gòu)建方法，特別是一種人源dcfl基因轉(zhuǎn)基因果蠅模型的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
果蜆(Drosophila melanogaster)具有高度發(fā)達(dá)的神經(jīng)系統(tǒng)以及較短的生命周期，易飼養(yǎng)且易于進(jìn)行遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)手段的操作和分析，是一種非常實(shí)用的模式生物。所有，果蠅廣泛地用于神經(jīng)退行性疾病模型的構(gòu)建和研究。樹突狀細(xì)胞因子(dendritic cell factor I, DCFl)又名跨膜蛋白59(transmembrane protein 59, TMEM59),首次發(fā)現(xiàn)于免疫系統(tǒng)的樹突細(xì)胞中，是一個(gè)表達(dá) 范圍比較廣泛的單次跨膜蛋白。目前對于該蛋白的功能研究報(bào)道比較少，已有的報(bào)道表明DCFl主要定位在高爾基體上，且DCFl與其同源蛋白TMEM59-like能夠抑制APP向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)以及進(jìn)一步的剪切，說明DCFl與AD存在某種聯(lián)系。Alzheimer’s disease (AD),又稱老年癡呆癥，是由一名叫 Alois Alzheimer 的德國醫(yī)生于1906年第一次報(bào)道的，以不可逆進(jìn)行性的記憶減退和認(rèn)知、語言功能障礙以及定向力、運(yùn)動(dòng)能力障礙等為主要臨床表現(xiàn)的一種神經(jīng)退行性疾病。AD是老年人的常見病與多發(fā)病，全球有超過1500萬的老年人正受到AD的侵蝕和折磨。AD嚴(yán)重危害老年人的身心健康，已成為僅次于心臟病、惡性腫瘤和中風(fēng)的第4位導(dǎo)致老年人死亡的原因，也是老年醫(yī)學(xué)中亟待解決和最棘手的問題之一。AD的發(fā)病機(jī)制目前學(xué)說眾多，如自由基損傷學(xué)說、膽堿能學(xué)說、鈣平衡失調(diào)學(xué)說、興奮性氨基酸毒性學(xué)說等。AD的患者一般表現(xiàn)為皮質(zhì)神經(jīng)元丟失，并伴隨有細(xì)胞外由APP剪切產(chǎn)生的大量β淀粉樣肽(amyloid β -peptides, APs)沉積形成的老年斑和大量神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)異常過度磷酸化tau蛋白聚集且以雙螺旋絲的形式形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle, NFT)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種人源dcfl基因轉(zhuǎn)基因果蠅模型的構(gòu)建方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種人源dcfl基因轉(zhuǎn)基因果蠅模型的構(gòu)建方法，其特征在于該方法的具體步驟為
a.將人源dcfl基因開放式閱讀框?qū)?yīng)的cDNA序列構(gòu)建入果蠅轉(zhuǎn)基因載體pWIZ中，得到果蠅轉(zhuǎn)基因載體pUAST-dcfl ；
b.將步驟a所得果蠅轉(zhuǎn)基因載體pUAST-dcfl為材料，利用顯微注射的基因工程技術(shù)手段構(gòu)建并得到人源dcfl轉(zhuǎn)基因果蠅。上述的步驟a的具體方法可以為
a-Ι.以人子宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞的cDNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為 dcfl primers 5’ -CGGAATTCATGGCGGCGCCGAAGGGG AG-3’
5， -GCTCTAGATTAAATTTCAGAATGAGCAA-3，)，得到大小為972bp的dcfl基因開放式閱讀框全長的目的片段；再用EcoRI和XbaI雙酶切，收集片段；
a-2.用EcoRI和XbaI雙酶切空載體質(zhì)粒pWIZ，收集大片段備用；a-3.將步驟a-1和步驟a-2所得的兩個(gè)片段連接起來，得到果蠅轉(zhuǎn)基因載體pUAST-dcflo上述的步驟b的具體步驟為
b-Ι.將轉(zhuǎn)基因載體pUAST-dcfl (終濃度O. 8 Pg/mg)和輔助質(zhì)粒ρ Λ 2_3 (終濃度O. 2Kg/mg)混合后，將此混合液注入果蠅的受精卵的尾部，并放置在16°C的濕盒中培養(yǎng)；
b-2.待步驟b-1所得的受精卵孵化成幼蟲然后羽化為成蟲后即和野生型W1118交配，挑取子代眼色為紅色的果蠅即為轉(zhuǎn)基因果蠅； b-3.將步驟b_2所得轉(zhuǎn)基因果蜆和Double Balance果蜆以及野生型wlll8雜交,篩選出基因型為w;UAS-dcfl/UAS-dcfl;+/+的果蠅。本發(fā)明利用顯微注射基因工程技術(shù)和果蠅雜交技術(shù)，構(gòu)建了人源dcfl基因轉(zhuǎn)基因果蠅模型，為相關(guān)神經(jīng)退行性疾病的研究提供了材料和新思路。


圖I為構(gòu)建的果蠅轉(zhuǎn)基因載體pUAST-dcf I經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI雙酶切產(chǎn)物的電泳圖，最左邊泳道為DNA Marker，泳道1、2均為pUAST-dcfl雙酶切產(chǎn)物。圖2為顯微注射操作時(shí)果蠅的受精卵的狀態(tài)。
圖3為顯微注射得到帶有平衡基因的人源dcfl轉(zhuǎn)基因果蠅和Double Balance果蠅以及野生型果蠅wlll8分別雜交后獲得的純合UAS系轉(zhuǎn)基因果蠅品系w;UAS-dcn/以5-如€1;+/+、以及野生型果蠅《1118分別和elav-GAL4果蠅(泛神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)啟動(dòng))雜交得到的Fl代果蠅，分別提取羽化后10天Fl代果蠅腦部組織的總RNA后反轉(zhuǎn)錄cDNA為模版而進(jìn)行的PCR反應(yīng)后的電泳圖(引物為構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體pUAST-dcf I時(shí)取得目的片段時(shí)的引物)，內(nèi)參為β-actin。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一果蠅轉(zhuǎn)基因載體pUAST-dcf I的構(gòu)建和驗(yàn)證
I、為得到果蠅轉(zhuǎn)基因載體pUAST-dcf I，首先以人子宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞的cDNA為模版進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，引物為 dcfl primers (5，-CGGAATTCATGGCGGCGCCGAAGGGG AG-3’和 5’ -GCTCTAGATTAAATTTCAGAATGAGCAA-3’)，得到大小為972bp (dcfl基因開放式閱讀框全長)的目的片段后再用EcoRI和XbaI雙酶切，收集片段備用。2、然后用EcoRI和XbaI雙酶切空載體質(zhì)粒pWIZ，收集大片段備用。3、最后將兩個(gè)片段連接起來，得到果蠅轉(zhuǎn)基因載體pUAST-dcfl。4、如圖1，EcoRI和XbaI雙酶切鑒定構(gòu)建的果蠅轉(zhuǎn)基因載體pUAST-dcf 1，可見轉(zhuǎn)基因載體pUAST-dcf I雙酶切后放出了大小為972bp的目的片段，后經(jīng)測序證明了目的片段的準(zhǔn)確性，說明正確的目的片段已經(jīng)插入到載體中，載體構(gòu)建成功。實(shí)施例二 顯微注射轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)以及轉(zhuǎn)基因果蠅的驗(yàn)證
I、為得到人源dcfl轉(zhuǎn)基因果蠅，以P因子介導(dǎo)的生殖細(xì)胞系轉(zhuǎn)化的原理，利用顯微注射的基因工程技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因果蠅。2、將轉(zhuǎn)基因載體pUAST-dcfl和輔助質(zhì)粒以一定濃度比例，裝入拉長開口的玻璃微電極中，在氣壓機(jī)械注射臂的幫助下將此混合液注入果蠅新產(chǎn)出Ih內(nèi)去除卵殼的受精卵的尾部，參見圖2，將注射完成后的卵放16°C在濕盒中培養(yǎng)。3、注射后的受精卵孵化成幼蟲然后羽化為成蟲后即和野生型《1118交配，挑取子代眼色為紅色的果蠅即為轉(zhuǎn)基因果蠅。將挑選出的帶有dcfl基因的UAS品系果蠅和Double Balance果蜆雜交和回交，得到穩(wěn)定遺傳的人源dcfl轉(zhuǎn)基因果蜆品系w;UAS_dcfl/Cyo; Tm6B/Tm2o再將此品系果蜆與Double Balance果蜆以及野生型wl 118雜交,可以篩選出基因型為w;UAS-dcfl/UAS-dcfl;+/+的純合UAS系dcfl轉(zhuǎn)基因果蠅。為了可以在果蠅神經(jīng)細(xì)胞中驗(yàn)證表達(dá)dcfl，利用GAL4/UAS雙元系統(tǒng)控制外源基因表達(dá)的原理，將篩選出的純合UAS系dcfl轉(zhuǎn)基因果蠅與elav-GAL4雜交，得到Fl代并提取羽化后10天Fl代果蠅腦部組織的總RNA后反轉(zhuǎn)錄cDNA為模版而進(jìn)行PCR反應(yīng)， PCR反應(yīng)的引物為dcfl primers ;內(nèi)參基因?yàn)棣?actin,引物的序列為β-actin primers(5，-GTCCCAGTTGGTCACGAT-3’ 和 5’ -AGTTGCTGCTCTGGTTGT-3’ )。 參見圖 3 由電泳圖可知，構(gòu)建的人源dcfl轉(zhuǎn)基因果蠅是成功的，因?yàn)橐赞D(zhuǎn)基因果蠅Fl代的cDNA為模版可以擴(kuò)增出972bp的目的條帶而對照組卻沒有。實(shí)施例三本發(fā)明的果蠅模型能作為神經(jīng)細(xì)胞研究中的工具
I、果蠅有天生的負(fù)趨地性，當(dāng)果蠅被放入豎直放置的管中會(huì)本能地向上端爬行，而爬行的速度反應(yīng)了果蠅的運(yùn)動(dòng)能力。實(shí)驗(yàn)利用不同基因、相同數(shù)量(10只)、相同羽化天數(shù)、相同性別(雄性)的果蠅用二氧化碳麻醉后分別移入相同的試管(長18cm，直徑I. 5cm)中，25°C環(huán)境復(fù)蘇30min后開始實(shí)驗(yàn)。2、裝有果蠅的試管保持豎直狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)溫和地敲擊試管，使果蠅集中到試管底部后開始計(jì)時(shí)，IOs后計(jì)時(shí)結(jié)束時(shí)快速計(jì)數(shù)在試管頂端和底端的果蠅數(shù)量并做好記錄，一次測試后讓果蠅恢復(fù)60s后再繼續(xù)下一次測試，每次實(shí)驗(yàn)完成5-10次測試；實(shí)驗(yàn)每5天重復(fù)一次，從剛羽化到羽化第60天為止，各組實(shí)驗(yàn)要進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)。3、實(shí)驗(yàn)的四組果蠅分別為AD模型果蠅、本發(fā)明的模型果蠅與AD模型果蠅雜交后得到的共表達(dá)dcfl的AD模型果蠅、本發(fā)明的模型果蠅、野生型果蠅(這些UAS系果蠅和elav-GAL4雜交產(chǎn)生Fl代以表達(dá)各外源基因，野生型與elav-GAL4雜交作為對照)。每次實(shí)驗(yàn)中5-10次技術(shù)重復(fù)取平均值作為一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，完成三次生物學(xué)重復(fù)，利用Student’ sTest統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從第10天開始，共表達(dá)dcfl的AD模型果蠅相比于AD模型果蠅，同時(shí)期的爬壁能力均有了顯著的提高(*ρ〈0· 05，** ρ〈0·01)，即運(yùn)動(dòng)能力下降的癥狀有了顯著的緩解。AD模型果蠅相比于作為對照的表達(dá)外源dcfl的果蠅和野生型對照果蠅，同時(shí)期的爬壁能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)要差，說明運(yùn)動(dòng)能力大幅度下降；而同時(shí)共表達(dá)dcfl的AD模型果蠅相比于作為對照的表達(dá)外源dcfl果蠅和野生型對照果蠅，同時(shí)期的爬壁能力仍然要差但強(qiáng)于AD模型果蠅，即運(yùn)動(dòng)能力下降的癥狀雖然得到緩解卻不能完全治愈，以到達(dá)正常的水平。因此本發(fā)明的果蠅模型可以為相關(guān)神經(jīng)退行性疾病的研究提供了材料和新思路。
權(quán)利要求
1.一種人源dcfI基因轉(zhuǎn)基因果蠅模型的構(gòu)建方法，其特征在于該方法的具體步驟為a.將人源dcfl基因開放式閱讀框?qū)?yīng)的cDNA序列構(gòu)建入果蠅轉(zhuǎn)基因載體pWIZ中，得到果蠅轉(zhuǎn)基因載體pUAST-dcfl ； b.將步驟a所得果蠅轉(zhuǎn)基因載體pUAST-dcfl為材料，利用顯微注射的基因工程技術(shù)手段構(gòu)建并得到人源dcfl轉(zhuǎn)基因果蠅。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人源dcfl基因轉(zhuǎn)基因果蠅模型的構(gòu)建方法，其特征在于所述的步驟a的具體方法為 a-Ι.以人子宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞的cDNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為 dcfl primers 5’ -CGGAATTCATGGCGGCGCCGAAGGGG AG-3’5， -GCTCTAGATTAAATTTCAGAATGAGCAA-3，)， 得到大小為972bp的dcfl基因開放式閱讀框全長的目的片段；再用EcoRI和XbaI雙酶切，收集片段； a-2.用EcoRI和XbaI雙酶切空載體質(zhì)粒pWIZ，收集大片段備用；a-3.將步驟a-1和步驟a-2所得的兩個(gè)片段連接起來，得到果蠅轉(zhuǎn)基因載體pUAST-dcflo
3.根據(jù)權(quán)利要求I人源dcfl基因轉(zhuǎn)基因果蠅模型的構(gòu)建方法，其特征在于所述的步驟b的具體步驟為 b-Ι.將轉(zhuǎn)基因載體pUAST-dcf I (終濃度O. 8 Pg/mg)和輔助質(zhì)粒ρ Λ 2_3 (終濃度O. 2Kg/mg)混合后，將此混合液注入果蠅的受精卵的尾部，并放置在16°C的濕盒中培養(yǎng)； b-2.待步驟b-1所得的受精卵孵化成幼蟲然后羽化為成蟲后即和野生型《1118交配，挑取子代眼色為紅色的果蠅即為轉(zhuǎn)基因果蠅； b-3.將步驟b_2所得轉(zhuǎn)基因果蜆和Double Balance果蜆以及野生型wlll8雜交,篩選出基因型為w;UAS-dcfl/UAS-dcfl;+/+的果蠅。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人源dcf1基因轉(zhuǎn)基因果蠅模型的構(gòu)建方法。本發(fā)明構(gòu)建了果蠅轉(zhuǎn)基因載體pUAST-dcf1；通過顯微注射的方式獲得人源dcf1轉(zhuǎn)基因UAS品系果蠅，并通過與DoubleBalance果蠅w;B1/Cyo;Tm6B/Tm2的雜交與回交得到帶有平衡基因且能穩(wěn)定遺傳的人源dcf1轉(zhuǎn)基因果蠅品系w;UAS-dcf1/Cyo;Tm6B/Tm2。本發(fā)明利用顯微注射基因工程技術(shù)和果蠅雜交技術(shù)，構(gòu)建了人源dcf1基因轉(zhuǎn)基因果蠅模型，為相關(guān)神經(jīng)退行性疾病的研究提供了材料和新思路。
文檔編號A01K67/033GK102766635SQ20121016460
公開日2012年11月7日 申請日期2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月25日
發(fā)明者文鐵橋, 蔣萌 申請人:上海大學(xué)