專利名稱：一種有效防止綠藻產(chǎn)生的擬南芥水培方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種擬南芥的水培方法，特別是涉及ー種在培養(yǎng)室或人工氣候箱內(nèi)有效防止綠藻產(chǎn)生的擬南芥水培方法。
背景技術(shù)：
擬南芥具有生活史短、種子多、形態(tài)結(jié)構(gòu)簡單、全部基因組已測序、遺傳轉(zhuǎn)化體系成熟等優(yōu)點，作為模式植物廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、植物營養(yǎng)學(xué)、逆境生物學(xué)等研究中。擬南芥幼苗脆弱，易受外界環(huán)境，特別是培養(yǎng)基組分的影響，致使實驗的重復(fù)性較差、影響實驗的進(jìn)度。另外，由于擬南芥植株小、生物量相對較少，致使許多生理生化方面的實驗難以開展。 因此，在研究過程中，提高擬南芥的生長速度，提供ー種良好且一致的生長環(huán)境，培養(yǎng)出健壯而整齊一致的植株，不但是實驗成功的關(guān)鍵，而且是實驗順利進(jìn)行的必要條件。土培和瓊脂固體培養(yǎng)法是目前擬南芥培養(yǎng)的兩種最主要的方法，土培難以精確控制培養(yǎng)基質(zhì)中的營養(yǎng)成分，且很難獲取完整的根系；而瓊脂固體培養(yǎng)法難以繁殖種子，且植株小，不易獲得大量的實驗材料，尤其是根系。水培不但可以提供ー個一致且可重復(fù)的培養(yǎng)系統(tǒng)，而且可以根據(jù)實驗要求精確控制水溶液中的營養(yǎng)成分，各部分實驗材料(尤其是根系)容易觀察和收集，可極大的提高擬南芥生長速度，獲取更多的實驗材料。但目前大部分水培方法，易被緑藻污染，致使植株瘦弱，提取擬南芥根系RNA、DNA、蛋白質(zhì)等組分時，常被緑藻所污染，影響實驗結(jié)果，甚至因?qū)嶒灢牧线_(dá)不到要求而無法開展實驗。因此，目前迫切需要一種在培養(yǎng)室或人工氣候箱內(nèi)嚴(yán)格控制實驗條件的無綠藻污染、根系發(fā)達(dá)且簡單易行的擬南芥水培方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可在培養(yǎng)室或人工氣候箱內(nèi)培育出健壯、大小基本一致、無綠藻污染、簡單易行的擬南芥水培方法。本發(fā)明提供的擬南芥水培方法，包括以下步驟
I)育苗將消毒、春化的種子播于1/2 MS固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)12 18天。培養(yǎng)條件光周期為14小時光照，10小時黑暗；溫度為白天22±2° C，夜間為18±2° C ;相対濕度為60% 80% ;光照強(qiáng)度為100 400 μ MnT2 s—1，經(jīng)培育得擬南芥幼苗。2)轉(zhuǎn)苗將步驟I)所得的幼苗轉(zhuǎn)至打有一孔的3、平方厘米的小KT板上，使根穿過孔進(jìn)入培養(yǎng)液。然后將苗轉(zhuǎn)入裝有1/2 Hoagland營養(yǎng)液的盆中進(jìn)行馴化，轉(zhuǎn)苗前2天用玻璃板蓋在盆上密封，以防幼苗干枯，而后每天打開ー些，使苗逐漸適應(yīng)外部的環(huán)境，直至完全移開玻璃板，馴化培養(yǎng)約需5 7天。培養(yǎng)條件與育苗相同。3)自制培養(yǎng)裝置，并將其消毒根據(jù)實驗要求，選擇適當(dāng)大小的培養(yǎng)盤并消毒。剪取比培養(yǎng)盤略小的KT板，在KT板上挖寬約I. 5厘米，兩端約短于KT板各2厘米的長方形小槽，根據(jù)KT板大小，每隔51厘米挖ー小槽，也可根據(jù)實驗需要，適當(dāng)?shù)恼{(diào)整小槽間距，各小槽平行排列。在培養(yǎng)盤內(nèi)裝入適量的1/2 Hoagland培養(yǎng)液，再把上述改造的KT板放入培養(yǎng)盤內(nèi)。將錫箔紙置于KT板上方,并封住培養(yǎng)盤開ロ，KT板質(zhì)輕，因而會始終浮于培養(yǎng)液的上方，可防止其上的錫箔紙等物體浸入水中。錫箔紙可遮光，能防止培養(yǎng)液受到光的照射，從而有效防止綠藻滋生。4)幼苗培養(yǎng)將步驟2)所得的帶小KT板的幼苗轉(zhuǎn)至3)所述的自制培養(yǎng)裝置上，根據(jù)錫箔紙下方大KT板上長方形小槽的位置種植擬南芥，每ー小槽上方種植ー排小苗。小苗種植時在錫箔紙上劃ー小ロ，讓小苗的根通過錫箔紙及其下方大KT板上的小槽浸入水中，每隔51厘米轉(zhuǎn)ー棵小苗，也可根據(jù)實驗需要，適當(dāng)?shù)恼{(diào)整小苗的間距。培養(yǎng)條件與育苗相同。每隔6、天更換一次培養(yǎng)液，每2 3天給培養(yǎng)液充空氣一次，以保證根部有充足的氧氣。在上述培養(yǎng)方法中，步驟I)種子消毒、春化的方法為用75%的酒精表面消毒Imin，2%的次氯酸鈉浸泡10 min，再經(jīng)滅菌水洗滌5飛次后播種于1/2 MS (O. 52°/Γθ. 58 %瓊脂，3%蔗糖，O. 05%的MES，pH 5. 8)培養(yǎng)基上。1/2 MS培養(yǎng)基被裝入組培瓶內(nèi)，組培瓶上方空間較大，在同樣的時間內(nèi)，所得幼苗蓮座葉要比培養(yǎng)皿內(nèi)的大且健壯，撒在MS培養(yǎng)基 上的種子要稀，過密相互擁擠會影響植株生長。將上述組培瓶放入4°C冰箱內(nèi)，使種子春化2^3天，然后再置于培養(yǎng)室或人工氣候箱內(nèi)里培養(yǎng)。步驟2)小KT板上的孔可用打孔器制作。為防止根損傷，可利用洗瓶擠壓出的水流帶動根穿過孔。擬南芥幼苗的根細(xì)弱，若用質(zhì)地堅硬的鑷子或其它工具使根穿過孔，會給根帶來不可避免的傷害，引起幼苗干枯甚至死亡。而用細(xì)的水流帶動根穿過孔不僅不易造成幼苗損傷，而且還可使柔軟的根輕松穿越孔，大大加快轉(zhuǎn)苗速度。所用KT板可從廣告公司或裝飾材料店購買。KT板厚約O. 5厘米。所用盆在使用前用5%。 10%。的次氯酸鈉消毒Γ2小吋，再用蒸餾水沖洗5飛次。步驟3)中所述的培養(yǎng)盤可用不同顔色但不透光、高約5 10厘米的方形或長方形水果盤。培養(yǎng)盤每次使用前用5%。 10%。的次氯酸鈉消毒f 2小時，再用蒸餾水沖洗干凈。步驟4)中所述的錫箔紙上的小口，可用小刀在錫箔紙適當(dāng)?shù)奈恢么怪眲潻`小口(形狀如“L”形)，并在根穿過小口后，用透明膠帶將ロ封上。本發(fā)明簡單易行、便于操作，所用材料價格低廉易得，實驗重復(fù)性好，所得苗健壯、大小基本一致、無綠藻污染，所用培養(yǎng)液可根據(jù)實驗需求而適當(dāng)調(diào)整、井能精確控制其成份。上述方法可以培養(yǎng)任何生態(tài)型的野生型或突變體擬南芥植株。本發(fā)明可在培養(yǎng)室或人エ氣候箱內(nèi)培育幼苗，也可用來繁殖種子，應(yīng)用前景廣闊。


下面結(jié)合附圖以及具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)ー步的詳細(xì)說明。圖I為本發(fā)明的自制擬南芥培養(yǎng)裝置結(jié)構(gòu)示意圖；1、打有一孔的:Γ5平方厘米的小KT板，2、轉(zhuǎn)移到I所示小的KT板上的擬南芥幼苗，3、錫箔紙，4、錫箔紙上的“ L”形小口，
5、比培養(yǎng)盤略小的大KT板，6、大KT板上的長方形小槽，7、培養(yǎng)盤。圖2為本發(fā)明的自制擬南芥培養(yǎng)裝置剖視示意圖；廣7同圖1，8、培養(yǎng)盤中的培養(yǎng)液。
具體實施方式
實施例I、一種有效防止綠藻產(chǎn)生的擬南芥水培方法，依次進(jìn)行以下步驟
I)育苗將適量哥倫比亞野生型擬南芥種子置于I. 5毫升離心管中，用I毫升75%的酒精表面消毒I分鐘，倒出酒精，再加入I毫升2%的次氯酸鈉滅菌10分鐘，倒出次氯酸鈉，然后用滅菌水洗滌5次后播于組培瓶內(nèi)1/2 MS (O. 56%瓊脂，3%蔗糖，O. 05%的MES，PH 5. 8)培養(yǎng)基上。播種密度要稀，防止過于擁擠影響植株生長。將撒有種子的組培瓶放入4°C冰箱內(nèi)，春化2天，然后再置于培養(yǎng)室培養(yǎng)15天。培養(yǎng)條件光周期為14小時光照，10小時黑暗；溫度為白天22±2° C，夜間為18±2° C ;相対濕度為70% ;光照強(qiáng)度為120 μΜm_2 s—1，經(jīng)培育得擬南芥幼苗。2)轉(zhuǎn)苗將步驟I)所得的幼苗轉(zhuǎn)至打有一孔的約4平方厘米的小KT板上，用洗瓶擠壓出的水流帶動根穿越孔進(jìn)入培養(yǎng)液。然后將苗轉(zhuǎn)入內(nèi)裝1/2 Hoagland營養(yǎng)液的盆(用前已用5%。次氯酸鈉消毒I小時，并用蒸餾水沖洗5次)中進(jìn)行馴化培養(yǎng)5天，轉(zhuǎn)苗前2天用玻璃板蓋在盆上密封，以防幼苗干枯，而后每天打開ー些，使苗逐漸適應(yīng)外部的環(huán)境，直至完全移開玻璃板。培養(yǎng)條件與育苗相同。 3)自制培養(yǎng)裝置，并將其消毒選擇適當(dāng)大小的培養(yǎng)盤并用5%。次氯酸鈉消毒I小時，用蒸餾水沖洗干凈。根據(jù)所選培養(yǎng)盤大小，剪取比其略小的KT板，在KT板上挖寬約I. 5厘米，兩端約短于KT板各2厘米的長方形小槽，在KT板上每隔5厘米挖ー小槽。在培養(yǎng)盤內(nèi)裝入適量的1/2 Hoagland培養(yǎng)液，再把上述改造的KT板放入培養(yǎng)盤內(nèi)。將錫箔紙置于KT板之上，并封住培養(yǎng)盤開ロ。4)幼苗培養(yǎng)將步驟2)得的帶小KT板的幼苗轉(zhuǎn)至3)所述的自制培養(yǎng)裝置上，將擬南芥種植于小槽上方，沿小槽平行排列。在錫箔紙上劃ー “し”形的小ロ，讓小苗的根通過錫箔紙及其下方大KT板上的小槽浸入水中，每隔5厘米轉(zhuǎn)ー小苗，錫箔紙上的小口用透明膠帶封上。每隔8天更換一次培養(yǎng)液，每2天給培養(yǎng)液充空氣一次，以保證根部有充足的氧氣。培養(yǎng)條件與育苗相同。從播種到植株開花大約需要4飛周，6周后角果中種子開始成熟。由于培養(yǎng)液經(jīng)常更換，擬南芥可不斷從培養(yǎng)液中吸取豐富的營養(yǎng)，所以植株開花時間較長，所得種子量大約比土培多20%。根在黑暗的環(huán)境中生長，可有效防止緑藻污染。
權(quán)利要求
1.一種有效防止綠藻產(chǎn)生的擬南芥水培方法，包括以下步驟1)育苗將消毒、春化的種子播種于組培瓶內(nèi)的1/2 MS固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)12 18天得幼苗；2)轉(zhuǎn)苗將I)所得幼苗轉(zhuǎn)至打有一孔的3飛平方厘米的小KT板上，使根穿過孔進(jìn)入培養(yǎng)液，馴化培養(yǎng)5 7天；3)自制培養(yǎng)裝置，將培養(yǎng)盤用5%。 10%。次氯酸鈉消毒f 2小時，剪取比培養(yǎng)盤略小的KT板，在KT板上挖寬約I. 5厘米，兩端約短于KT板各2厘米的長方形小槽，根據(jù)KT板大小，每隔5^8厘米挖ー小槽，在培養(yǎng)盤內(nèi)裝入適量的1/2 Hoagland培養(yǎng)液，再把上述KT板放入培養(yǎng)盤內(nèi)，用錫箔紙封住培養(yǎng)裝置；4)幼苗培養(yǎng)將2)所得帶小KT板的苗轉(zhuǎn)到3)自制培養(yǎng)裝置上，并使擬南芥根通過錫箔紙和培養(yǎng)裝置浸入培養(yǎng)液中。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的有效防止綠藻產(chǎn)生的擬南芥水培方法，其特征是所述步驟2)小KT板上的孔采用打孔器制作。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的有效防止綠藻產(chǎn)生的擬南芥水培方法，其特征是所述步驟2)利用洗瓶擠壓出的水流帶動根穿過孔，從而有效防止根損傷。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的有效防止綠藻產(chǎn)生的擬南芥水培方法，其特征是所述步驟2)和3)的KT板質(zhì)輕，可使小苗始終浮于培養(yǎng)液之上。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的有效防止綠藻產(chǎn)生的擬南芥水培方法，其特征是所述步驟3)的培養(yǎng)盤為不透光、高約5 10厘米的方形或長方形水果盤。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的有效防止綠藻產(chǎn)生的擬南芥水培方法，其特征是所述步驟3)和4)用不透光的培養(yǎng)盤與錫箔紙組成ー個黑暗的空間，使該空間中的培養(yǎng)液和根接觸不到光照，從而有效防止需光才能生長的綠藻在培養(yǎng)液和根上滋生。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的有效防止綠藻產(chǎn)生的擬南芥水培方法，其特征是所述步驟4)每隔6、天更換一次培養(yǎng)液，每2 3天給培養(yǎng)液充空氣一次，以保證根部有充足的氧氣。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的有效防止綠藻產(chǎn)生的擬南芥水培方法，其特征是所述步驟4)可根據(jù)研究的內(nèi)容，適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)液中的組分，如研究重金屬對擬南芥的影響，可在培養(yǎng)液中添加不同濃度的重金屬。
全文摘要
本發(fā)明提供一種有效防止綠藻產(chǎn)生的擬南芥水培方法。該方法包括以下步驟1)育苗將消毒、春化的種子播種于組培瓶內(nèi)的1/2MS固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)12~18天得幼苗；2)轉(zhuǎn)苗將1)所得幼苗轉(zhuǎn)至打有一孔的3~5平方厘米的小KT板上，使根穿過孔進(jìn)入培養(yǎng)液，馴化培養(yǎng)5~7天；3)自制培養(yǎng)裝置，將其消毒，并用錫箔紙封住培養(yǎng)裝置；4)幼苗培養(yǎng)將2)所得帶小KT板的幼苗轉(zhuǎn)到3)自制培養(yǎng)裝置上，并使擬南芥根通過錫箔紙和培養(yǎng)裝置浸入培養(yǎng)液中，每隔6~9天更換一次培養(yǎng)液，每2~3天為培養(yǎng)液通氣一次，以保證根部有充足的氧氣。上述培養(yǎng)方法簡單易行，擬南芥生長良好，可有效防止綠藻污染。
文檔編號A01H4/00GK102696463SQ201210185028
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月7日
發(fā)明者劉東武, 徐恒戩, 王學(xué) 申請人:山東理工大學(xué)