專利名稱：卵巢大皮質(zhì)片玻璃化冷凍保護液及冷凍方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細胞、組織和器官的超低溫保存的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種卵巢大皮質(zhì)片玻璃化冷凍保護液及冷凍方法。
背景技術(shù)：
玻璃化冷凍是1985年由Rall和Fahy首先提出來的超快速超低溫保存的新技術(shù)，不僅操作方法簡便，而且凍存效果好，可較好保存有生命的細胞、組織和器官的生物活性，具有經(jīng)濟、簡便和高效的優(yōu)點，是近年低溫生物學領(lǐng)域發(fā)展最快的研究方向之一。將癌癥患者卵巣在癌癥放化療前進行凍存，癌癥控制后，將凍存卵巣移植回體內(nèi)，在一定程度上恢復患者卵巣的內(nèi)分泌功能和生育能力。近年許多學者相繼報道了小鼠、大鼠、羊、猴及人的卵巢組織玻璃化冷凍成功(參見文獻Kagabu S Umezu M.Transplantation of しryopreserved mouse, Chinese hamster, rabbit, Japanesemonkey and rat ovaries into rat recipients [J]. Exp Anim，2000，49 (I):17-21.Alaghbari AM，Jr Menino AR. Survival of oocytes recovered from vitrifiedsheep ovarian tissues[J]. Annimal Reprod Science, 2002，71(1-2) :101-110.Lee KA，Lee SH，Yoon SJ，et al. Resumption of the human primordial folliclegrowth in xenografts after vitrification of the ovarian tissue [J].FertilSteril,2000, 74(3) :S214.)。雖然玻璃化冷凍法已廣泛應(yīng)用于實驗動物中，但目前還沒有ー個通用的冷凍方法和標準的冷凍液配置方案，導致玻璃化凍存的體積移植徘徊在小體積階段。但由于卵巢小皮質(zhì)片(ImmX2mmX2mm)所含卵泡有限，移植回體內(nèi)后由于卵泡的消耗使生理性生殖內(nèi)分泌狀態(tài)維持時間較短(2 3年)，同時，切割時會因卵泡破壞過多造成卵泡數(shù)量的減少。大皮質(zhì)片(80mm3以上)移植因含原始卵泡數(shù)量巨大，將明顯延長移植物的功能壽命，目前，最大的皮質(zhì)塊面積為15mmX5mm,厚度均為l_2mm大小，且均采用低濃度保護劑的慢速凍存法(參見文獻J Donnez,麗Dolmans, D Demylle, PJadoul, C Pirard, J Squifflet, B Martinez—Maarid, and A vanLangenaonckt. Livebirthafter orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue..2004,.Lancet, Oct 2004;364(9443) :1405-10 ；Dror Meirow,Jacob Levron, Talia Eldar-Geva etal. Pregnancy after Transplantation of Cryopreserved Ovarian Tissue in a Patientwith Ovarian Failure after Chemotherapy. N Engl J Med2005; 353; 318-321.),慢速冷凍法是采用冷凍降溫儀按設(shè)置的程序進行冷凍，冷凍過程時間長，消耗液氮多，而且需要專門的儀器，一般實驗室不易實施。卵巢大皮質(zhì)片的玻璃化冷凍是近期研究者關(guān)注的焦點和難點，具體操作方法面臨如下挑戰(zhàn)組織塊太大將使皮質(zhì)片在玻璃化液中的滲透時間延長，雖然可提供足夠的時間使得保護劑進入中央?yún)^(qū)域，但邊緣區(qū)域就將暴露于高濃度保護劑中的時間過長，會產(chǎn)生細胞毒性損傷。若滲透時間較短，則造成皮質(zhì)片中心的冷凍保護劑不能達到有效濃度。因此如何在最大限度地降低細胞毒性的條件下，保證中央?yún)^(qū)域保護劑的滲入是確保卵巣大皮質(zhì)片玻璃化冷凍成功的關(guān)鍵。目前尚無適用于卵巢大皮質(zhì)片玻璃化冷凍保護液及其冷凍方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種適用于卵巢大皮質(zhì)片的玻璃化冷凍保護液，本發(fā)明的另ー目的是提供ー種適用于卵巢大皮質(zhì)片的玻璃化冷凍方法。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題主要是大皮質(zhì)片的凍存由于保護液的滲入和透出時間長，經(jīng)受的低溫保護劑的毒性時間也長，可能面臨更大的毒性損傷。同時，大皮質(zhì)片無血管吻合移植將由于血流不能及時到達而面臨缺血缺氧損傷，會損失卵母細胞和女性激素產(chǎn)生的基礎(chǔ)——原始卵泡。因此，要解決以上技術(shù)問題，首先必須要有一種既能抵抗凍存過程中產(chǎn)生的凋亡又可促進冷凍后移植卵巣快速回復血流的玻璃化冷凍保護液。 本發(fā)明提供了ー種適用于卵巢大皮質(zhì)片的玻璃化凍存保護液，該玻璃化凍存保護液是將促性腺激素作為抗凋亡劑加入到凍存使用液體中，所用的玻璃化冷凍保護液為EG5. 5/30液，此保護液由5. 5mol/Lこニ醇(EG)+30%聚鹿糖+0. 5mol/L鹿糖組成,在此基礎(chǔ)上添加了促性腺激素(gonadotropins)。所述的促性腺激素，可以是人絕經(jīng)期促性腺激素(HMG)、黃體生成素(LH)或促卵泡刺激激素(FSH)。優(yōu)選促卵泡刺激激素(FSH)。成年小鼠卵巢器官大皮質(zhì)片的玻璃化冷凍保護液玻璃化液EG5. 5/30 (5. 5mol/LEG+30%聚蔗糖+0. 5mol/L蔗糖玻璃化液)中添加0. 2IU/mL 0. 6IU/mL FSH、LH或人絕經(jīng)期促性腺激素(HMG)，最佳地濃度為0. 3IU/mLFSH。綿羊卵巢大皮質(zhì)片的玻璃化冷凍保護液玻璃化液EG5. 5/30(5. 5mol/LEG+30%聚蔗糖+0. 5mol/L蔗糖玻璃化液)中添加5 u g/mL 20 y g/mL的促卵泡成熟激素(FSH)，最佳地為10 u g/mL的FSH。本發(fā)明提供的適用于卵巢大皮質(zhì)片的玻璃化冷凍保護液，不僅可以抵抗卵巢組織在凍存中產(chǎn)生的凋亡，而且促進移植后血流的在灌注時間提前12-24h。利用該玻璃化冷凍保護液對成年小鼠卵巣器官、綿羊大皮質(zhì)片的玻璃化凍存，凍存效果好，可較好保存有生命的細胞、組織和器官的生物活性，并且凍存卵巢大皮質(zhì)片移植回體內(nèi)，內(nèi)分泌功能、生育功能等活性未受到影響。使用本發(fā)明的玻璃化冷凍保護液，凍存卵巢大皮質(zhì)片，卵巢大皮質(zhì)片的體積為80mm3 以上，一般在 80mm3-200mm3 之間，厚度< 2mm。本發(fā)明還提供了ー種適用于卵巢大皮質(zhì)片的玻璃化冷凍方法，該玻璃化冷凍方法主要涉及卵巣大皮質(zhì)片體積玻璃化凍存滲透平衡最佳時間控制技木。進ー步地，本發(fā)明摸索出根據(jù)卵巢大皮質(zhì)片的冷凍組織面積大小來確定其在玻璃化冷凍保護液中滲透平衡時間的規(guī)律，方便大皮質(zhì)片卵巢組織的玻璃化冷凍時間的掌握并保證了凍存效果。本發(fā)明人將2 6月齡的綿羊卵巢皮質(zhì)樣本按體積分為小樣(40mm3=5mmX 4mmX 2mm)、中樣(80mm3=IOmm X 4mm X 2mm)、大樣(160mm3=10mmX 8mmX 2mm)，采用兩步滲透平衡法進行玻璃化凍存，全過程在室溫(22 24°C)下進行。I.預(yù)滲透平衡I. 5mol/Lこニ醇(EG)+20%小牛血清(ICS)，小樣15min、中樣20min、大樣25min ；2.玻璃化滲透平衡EG 5. 5/30液(5. 5mol/L EG+30%聚蔗糖+0. 5mol/L蔗糖玻璃化液),小樣4min 8min、中樣IOmin 13min、大樣17min 20min ；3.直接投入液氮。解凍后，對玻璃化凍存結(jié)果的判斷對解凍后的卵巢進行普通光學顯微鏡、及凋亡相關(guān)的免疫組織化學檢測三種不同體積的卵巣皮質(zhì)塊在玻璃化冷凍液中經(jīng)適宜的滲透平衡后，進行玻璃化凍存。凡玻璃化液滲透欠佳的，玻璃化凍存解凍后組織學表現(xiàn)卵泡細胞的脫落、排列紊亂；卵母細胞胞漿出現(xiàn)裂痕、卵母細胞變形等。這是卵泡細胞及卵母細胞內(nèi)滲透的EG未達到玻璃化濃度，使冷凍和解凍時細胞內(nèi)外有冰晶形成，造成細胞的機械性損傷而使大量的卵泡結(jié)構(gòu)破壞。滲透時間過長，則表現(xiàn)為原始卵泡出現(xiàn)大量的固縮深染的細胞核，說明脫水過度，皺縮死亡。小體積組最佳的滲透平衡7min組，中體積為Ilmin組，大體積為19min組。對凋亡結(jié)果的判斷與對正常卵泡的觀察結(jié)果相同，最佳的滲透平衡時間凍存卵巢組織中凋亡的卵泡最少，與新鮮卵巢組間無統(tǒng)計學差異。從實驗結(jié)果中本發(fā)明總結(jié)出在22 24°C范圍和厚度彡2mm的恒定條件下，玻璃化液中的適宜的滲透平衡時間T (min)與最大面積S (mm2)存在這樣的關(guān)系T=l/5 S+3。本發(fā)明還提供了ー種適用于卵巢大皮質(zhì)片的玻璃化冷凍方法，該方法具體為玻璃化滲透平衡時所用的玻璃化冷凍保護液為常用玻璃化液EG5. 5/30(5. 5mol/L EG+30%聚蔗糖+0. 5mol/L蔗糖玻璃化液)的基礎(chǔ)上添加了促性腺激素； 滲透平衡時間T (min)與卵巢大皮質(zhì)片面積S (mm2)的關(guān)系為T=l/5 S+3 ;滲透平衡溫度為22 24°C ；所述的卵巢大皮質(zhì)片體積為80mm3以上，厚度彡2mm。使用上述添加促性腺激素的EG5. 5/30玻璃化冷凍保護液的基礎(chǔ)上，摸索出根據(jù)卵巢大皮質(zhì)片的冷凍組織面積大小來確定其在玻璃化冷凍保護液中滲透平衡時間的規(guī)律，結(jié)合滲透平衡公式，可方便、有效地玻璃化凍存不同體積的小動物卵巣器官及大卵巢皮質(zhì)組織。本發(fā)明的玻璃化冷凍保護液和玻璃化冷凍方法特別適用于卵巢大皮質(zhì)片，提供了用玻璃化凍存卵巣的最適宜的滲透平衡時間，方便實驗動物、良種大家畜、突然死亡的野生瀕危物種卵巢的凍存；通過使用添加促性腺激素的EG5. 5/30玻璃化液，可提高卵泡存活，縮短移植物的血流再灌注的時間，提高凍存大皮質(zhì)片的存活率。


圖I :對解凍后的卵巢大皮質(zhì)片普通光學顯微鏡圖A :綿羊卵巢40mm3皮質(zhì)片(小樣)在不同玻璃化凍存滲透平衡時間下凍存解凍后的形態(tài)學表現(xiàn)，7min-8min組最佳；B :綿羊卵巢80mm3皮質(zhì)片(中樣)在不同玻璃化凍存滲透平衡時間下凍存解凍后的形態(tài)學表現(xiàn)，llmin-12min組最佳；C :綿羊卵巢160mm3皮質(zhì)片(大樣)在不同玻璃化凍存滲透平衡時間下凍存解凍后的形態(tài)學表現(xiàn)，18min-19min組最佳。圖2 :玻璃化凍存后各組卵泡的組織學圖像(X400)
其中A :新鮮對照組(fresh control group, FCG) ;B :非干預(yù)玻璃化凍存組(vitrification control group, VCG) ;C :FSH 干預(yù)下玻璃化組(FSH treatmentvitrification group, FSH-VG)；圖中“一”表示原始卵泡，“ ★”表示初級卵泡，“ ▲”表示次級卵泡，Bar為50 y m。圖3 :0. 3IU/FSH干預(yù)下玻璃化凍存解凍后，卵巢活化的caspase-3免疫組化結(jié)果其中A:新鮮對照組，B:非干預(yù)玻璃化組，CiFSH干預(yù)下的玻璃化組，顯示活化的caspase-3表達低于非干預(yù)組；Bar為50 ii m。圖4 :0. 3IU/FSH干預(yù)下玻璃化凍存解凍后，卵巢縫隙連接蛋白CX43免疫組化結(jié)果 (Cx43蛋白主要表達于卵泡顆粒細胞膜上)其中A:新鮮對照組，B:非干預(yù)玻璃化組，CiFSH干預(yù)下的玻璃化組，顯示CX43表達優(yōu)于非干預(yù)組；Bar為50 ii m。圖中“一”表示原始卵泡，“ ★”表示初級卵泡，“ ▲”表示次級卵泡。圖5 :FSH干預(yù)下玻璃化凍存解凍后卵巢Cx43蛋白western免疫印跡結(jié)果。FCG為新鮮對照組，VG為無干預(yù)玻璃化組，F(xiàn)SH-VG為FSH干預(yù)下的玻璃化組。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例和附圖，進ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用干限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。實施例I :卵巢大皮質(zhì)片玻璃化冷凍方法(一)玻璃化冷凍將2 6月齡的綿羊卵巢大皮質(zhì)片樣本固定為2mm厚,按體積分為小樣(40mm3=5mmX4mmX2mm)、中樣(8Omm3=IOmmX4mm X 2mm)、大樣(160mm3=IOmmX 8mm X 2mm)，采用兩步滲透平衡法進行玻璃化凍存，全過程在室溫(22 24°C)下進行第一步是預(yù)滲透平衡1.5mol/Lこニ醇(EG)+20%小牛血清(ICS)，小樣15min、中樣20min、大樣25min ；第二步是玻璃化滲透平衡EG 5. 5/30液(EG 5. 5/30液具體配方是EG+30%聚蔗糖 +0. 5mol/L 鹿糖),小樣5min 8min、中樣IOmin 13min、大樣17min 20min(姆樣皮質(zhì)片的玻璃化滲透平衡時間以一分鐘為ー個小組，即小樣皮質(zhì)片滲透時間分組為5min、6min、7min、8min組；中樣皮質(zhì)片的滲透時間分組為lOmin、llmin、12min、13min ;大樣皮質(zhì)片的滲透時間分組為17min、18min、19min、20min。)；然后直接投入液氮。(ニ)解凍卵巣組織大皮質(zhì)片出液氮后，在37°C水浴中解凍，具體解凍步驟依次為A至B至C至D :表I :卵巣組織大皮質(zhì)片出液氮后的解凍步驟
權(quán)利要求
1.ー種適用于卵巢大皮質(zhì)片的玻璃化冷凍保護液，在5. 5mol/Lこニ醇+30%聚蔗糖+0. 5mol/L蔗糖的玻璃化液中添加促性腺激素，所述的卵巢大皮質(zhì)片體積為80mm3以上，厚度 < 2_。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種適用于卵巢大皮質(zhì)片的玻璃化冷凍保護液，其特征在于所述的促性腺激素是人絕經(jīng)期促性腺激素、黃體生成素或促卵泡刺激激素。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的ー種適用于卵巢大皮質(zhì)片的玻璃化冷凍保護液，其特征在于所述的卵巢大皮質(zhì)片是成年小鼠卵巢大皮質(zhì)片，所述的促性腺激素是0. 2IU/mL 0.6IU/mL的人絕經(jīng)期促性腺激素、黃體生成素或促卵泡刺激激素。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的ー種適用于卵巢大皮質(zhì)片的玻璃化冷凍保護液，其特征在于所述的促性腺激素是0. 3IU/mL的促卵泡刺激激素。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的ー種適用于卵巢大皮質(zhì)片的玻璃化冷凍保護液，其特征在于所述的卵巣大皮質(zhì)片是綿羊卵巢大皮質(zhì)片，所述的促性腺激素是5 u g/mL 20 y g/mL的促卵泡刺激激素。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的ー種適用于卵巢大皮質(zhì)片的玻璃化冷凍保護液，其特征在于促性腺激素是10 U g/mL的促卵泡刺激激素。
7.ー種適用于卵巢大皮質(zhì)片的玻璃化冷凍方法，其特征在于該方法為 玻璃化滲透平衡時所用的玻璃化冷凍保護液如權(quán)利要求I至6任一所述； 滲透平衡溫度為22 24°C;滲透平衡時間T (min)與卵巣大皮質(zhì)片面積S (mm2)的關(guān)系為 T=l/5 S+3 ； 所述的卵巢大皮質(zhì)片體積為80mm3以上,厚度< 2mm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種卵巢大皮質(zhì)片玻璃化冷凍保護液及冷凍方法。雖然玻璃化冷凍法已廣泛應(yīng)用于實驗動物中，但目前還沒有一個通用的冷凍方法和標準的冷凍液配置方案，導致玻璃化凍存的體積移植徘徊在小體積階段，而卵巢小皮質(zhì)片所含卵泡有限，影響移植卵泡的壽命。本發(fā)明提供了適用于卵巢大皮質(zhì)片的玻璃化冷凍保護液，在常用玻璃化液的基礎(chǔ)上添加了促性腺激素，本發(fā)明進一步提供了適用于卵巢大皮質(zhì)片的玻璃化冷凍方法，特別是玻璃化凍存不同體積卵巢大皮質(zhì)片的最適宜的滲透平衡時間，方便實驗動物、良種大家畜、突然死亡的野生瀕危物種卵巢的凍存；采用此方法能夠提高卵泡存活，縮短移植物的血流再灌注的時間，提高凍存卵巢移植回體內(nèi)的存活率。
文檔編號A01N1/02GK102771471SQ20121019357
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月22日
發(fā)明者黨玲, 王燕蓉, 王紅燕 申請人:寧夏醫(yī)科大學