專利名稱：一種紅豆杉成熟胚乳誘導(dǎo)單倍體胚乳愈傷組織的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種紅豆杉成熟胚乳誘導(dǎo)單倍體胚乳愈傷組織的方法。
背景技術(shù)：
紫杉醇(Paclitaxel,商品名Taxol)是20世紀(jì)六七十年代從紅豆杉科(Taxaceae)紅豆杉屬(Taxus L.)植物樹皮中分離出來的一種天然的四環(huán)二萜類生物堿，其在治療宮頸癌、乳腺癌、小細(xì)胞肺癌、黑素瘤和結(jié)腸癌等方面有顯著的療效。紫杉醇首先在太平洋短葉紅豆杉的樹皮和形成層中提取出來。按照目前的純化技術(shù)，生產(chǎn)Ikg的紫杉醇大約需要10噸紅豆杉樹皮。這大約需要從2000到4000棵60-70年生的紅豆杉中才能獲得。據(jù)相關(guān)資料介紹，每年全球大約需要消耗250kg紫杉醇純品。這需要從250萬千克樹皮或者75萬棵 紅豆杉中提取才能滿足這一市場的需要。隨著對紫杉醇需求量的日益遞增，目前僅僅從天然的紅豆杉林樹體中提取分離紫杉醇的產(chǎn)量已經(jīng)不能滿足醫(yī)藥市場需要，加之大肆的開采使紅豆杉自然資源日趨枯竭、紅豆杉資源自然更新能力差、生長緩慢、瀕危滅絕，各國政府已明文規(guī)定禁止砍伐野生紅豆杉資源。自從1921年意大利植物學(xué)家Blakesly在自然界中發(fā)現(xiàn)曼陀羅的單倍體植株以來，單倍體材料因其較高的利用價(jià)值，例如控制雜種后代分離、提高選擇效率、簡化遺傳分析、染色體操作、作為轉(zhuǎn)基因材料以及基因組學(xué)研究材料而受到重視，相續(xù)在植物已有報(bào)道。但目前報(bào)道的單倍體材料的獲得除自發(fā)突變產(chǎn)生的單倍體外，其主要途徑是通過花粉培養(yǎng)、胚珠離體培養(yǎng)和小孢子培養(yǎng)獲得，而紅豆杉屬裸子植物，因材料自身的特殊性其胚乳為單倍體組織(張宗勤等，紅豆杉，西北農(nóng)林科技大學(xué)出版社，2010)，故通過胚乳的離體培養(yǎng)便可以獲得單倍體愈傷組織。紅豆杉種子中含有較多抑制種子萌發(fā)的物質(zhì)，如南方紅豆杉種子中含有正庚酸、壬酸、乙酸等發(fā)芽抑制物質(zhì)，其種皮、內(nèi)種皮和胚乳的浸泡液對白菜種子發(fā)芽率和幼苗的生長、根生長均有抑制作用，并且與浸提液濃度呈正比(張艷杰等，南方紅豆杉種子種發(fā)芽抑制物的研究，南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2007，4(31) :51-58)。根據(jù)目前的研究報(bào)道還沒有成功報(bào)道通過紅豆杉胚乳愈傷組織誘導(dǎo)獲得單倍體愈傷組織的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種紅豆杉成熟胚乳誘導(dǎo)單倍體胚乳愈傷組織的方法。本發(fā)明的目的是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的?！N紅豆杉成熟胚乳誘導(dǎo)單倍體胚乳愈傷組織的方法，包括以下步驟( I)種子種胚的剝離將南方紅豆杉種子從外種皮中剝離出來；(2)外植體消毒取步驟(I)得到的種子，用70%的酒精和O. 1%的氯化汞表面消毒，再用無菌水清洗；
(3)種子的預(yù)處理將步驟(2)消毒的種子用無菌水浸泡1-5天；(4)胚乳組織的分離在無菌條件下剝?nèi)》N子的胚乳組織；(5)胚乳愈傷組織的離體誘導(dǎo)將剝離的胚乳組織接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基+Piculoram (毒莠定)2-5mg/L+6_BA O. 5mg/L+GA33mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂7g/L，培養(yǎng)條件為24± 1°C條件下暗培養(yǎng)。所述步驟(I)中的紅豆杉種子為當(dāng)年生或者4°C保存1-2年的南方紅豆杉種子。所述步驟(2)清洗消毒過程具體如下先將去除外種皮的種子放入無菌的容器中，在超凈工作臺(tái)內(nèi)依次經(jīng)70%酒精消毒90s和O. 1%氯化汞消毒12min，無菌水沖洗5次后備用。
所述步驟(3)種子預(yù)處理具體過程如下將去掉外種皮的種子經(jīng)過步驟(2)的表面消毒處理后，用無菌的蒸餾水在室溫條件下無菌密封浸泡1-5天。步驟(5)得到胚乳愈傷組織后可以進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為=B5培養(yǎng)基 +Piculoram 2-3mg/L+6_BA O. 5mg/L+GA3lmg/L+ 鹿糖 20g/L+ 瓊脂 7g/L ;培養(yǎng)條件為24±1°C條件下暗培養(yǎng)。該發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)外植體污染率極低；(2)種子預(yù)處理簡單，用靜水處理可以大量節(jié)約水資源；(3)通過一步培養(yǎng)可以獲得紅豆杉單倍體愈傷組織；誘導(dǎo)率達(dá)到97. 92% ； (4)為簡化遺傳分析、染色體操作、作為轉(zhuǎn)基因材料以及基因組學(xué)研究材料打下基礎(chǔ)，(4)為獲得紅豆杉單倍體愈傷組織進(jìn)行紅豆杉全基因組測序打下基礎(chǔ)。


圖I是采用本發(fā)明方法利用紅豆杉成熟胚乳誘導(dǎo)單倍體胚乳愈傷組織的過程，其中A.紅豆杉種子及去種皮的種子；B.胚乳組織在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)12d ；C.胚乳組織在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)20d ；D.胚乳組織在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)30d ；E.胚乳愈傷組織在繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)IOd ；圖2是本發(fā)明中獲得的紅豆杉胚乳單倍體愈傷組織的流式細(xì)胞儀細(xì)胞檢測結(jié)果，其中F.種胚來源的二倍體植株倍性檢測結(jié)果；G.南方紅豆杉單倍體愈傷組織倍性檢測結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明，而不會(huì)限制本發(fā)明。實(shí)施例I(I)種子種胚的剝離收集當(dāng)年生的南方紅豆杉種子，使用機(jī)械結(jié)合手工方法破殼，將種子從外種皮中剝離出來；(2)外植體消毒先將去除外種皮的種子放入無菌的容器中，在超凈工作臺(tái)內(nèi)經(jīng)70%酒精消毒90s和O. 1%氯化汞消毒12min，無菌水沖洗5次后備用，清洗時(shí)每次浸種5分
鐘左右。(3)種子的預(yù)處理將去掉外種皮的種子經(jīng)過步驟(2)的表面消毒處理后，用無菌的蒸餾水在室溫條件下密封浸泡1-3天。(4)胚乳組織的分離在無菌條件下剝?nèi)》N子的胚乳組織，其他部分棄除；(5)胚乳愈傷組織的誘導(dǎo)將胚乳組織接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上24土1°C條件下暗培養(yǎng)，經(jīng)過30天的培養(yǎng)可以獲得紅豆杉 胚乳愈傷組織，誘導(dǎo)率達(dá)到97. 92% ;誘導(dǎo)培養(yǎng)基是B5培養(yǎng)基 +Piculoram3mg/L+6-BA O. 5mg/L+GA33mg/L+ 鹿糖 20g/L+ 瓊脂 7g/L ;當(dāng)其他條件不變，而誘導(dǎo)培養(yǎng)基中Piculoram的含量在2_5mg/L范圍內(nèi)變化時(shí)，愈傷組織均生長良好，誘導(dǎo)率均能達(dá)到97%以上。(6)胚乳愈傷組織的繼代培養(yǎng)將胚乳愈傷組織接種到繼代培養(yǎng)基上24土1°C條件下暗培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)基是B5培養(yǎng)基+Piculoram 2mg/L+6-BA O. 5mg/L+GA3lmg/L+鹿糖20g/L+瓊脂7g/L ;紅豆杉胚乳愈傷組織能正常增殖培養(yǎng)；當(dāng)其他條件不變，而繼代培養(yǎng)基中Piculoram的含量在2_3mg/L范圍內(nèi)變化時(shí)，紅豆杉胚乳愈傷組織也能正常增殖培養(yǎng)。結(jié)果請見附圖。
權(quán)利要求
1.一種紅豆杉成熟胚乳誘導(dǎo)單倍體胚乳愈傷組織的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)種子種胚的剝離將南方紅豆杉(Taxaleschinensis var. mairei)種子從外種皮中剝離出來； (2)外植體消毒取步驟(I)得到的種子，用70%的酒精和O.1%的氯化汞表面消毒，再用無菌水清洗； (3)種子的預(yù)處理將步驟(2)消毒的種子用無菌水浸泡1-5天； (4)胚乳組織的分離在無菌條件下剝?nèi)》N子的胚乳組織； (5)胚乳愈傷組織的離體誘導(dǎo)將剝離的胚乳組織接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基+Piculoram 2-5mg/L+6_BA O. 5mg/L+GA3 3mg/L+鹿糖 20g/L+瓊脂7g/L，培養(yǎng)條件為24± 1°C條件下暗培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于， 所述步驟(I)中的紅豆杉種子為當(dāng)年生或者4°C保存1-2年的南方紅豆杉種子。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于， 所述步驟(2)清洗消毒過程具體如下先將去除外種皮的種子放入無菌的容器中，在超凈工作臺(tái)內(nèi)依次經(jīng)70%酒精消毒90s和O. 1%氯化汞消毒12min，無菌水沖洗5次后備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于， 所述步驟(3)種子預(yù)處理具體過程如下將去掉外種皮的種子經(jīng)過步驟(2)的表面消毒處理后，用無菌的蒸餾水在室溫條件下無菌密封浸泡1-5天。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于， 步驟(5)得到胚乳愈傷組織后進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為=B5培養(yǎng)基+Piculoram2-3mg/L+6-BA O. 5mg/L+GA3lmg/L+鹿糖 20g/L+瓊脂 7g/L ;培養(yǎng)條件為 24± 1°C條件下暗培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種紅豆杉成熟胚乳誘導(dǎo)單倍體胚乳愈傷組織的方法。包括(1)種子外種皮剝離利用機(jī)械破殼，手工剝離外種皮；(2)外植體消毒依次經(jīng)70%酒精消毒90s和0.1%氯化汞消毒12min，無菌水沖洗5次后備用；(3)種子預(yù)處理用無菌水密封常溫浸種1-5天；(4)胚乳組織的分離；(5)胚乳愈傷組織的離體誘導(dǎo)將種子胚乳接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，30天后可以獲得97.92%的誘導(dǎo)率。本發(fā)明能簡便、快速獲得紅豆杉成熟胚乳愈傷組織，為簡化遺傳分析、染色體操作、作為轉(zhuǎn)基因材料以及基因組學(xué)研究材料打下基礎(chǔ)。
文檔編號A01H4/00GK102687667SQ20121020308
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月19日
發(fā)明者張家銀, 李炎林, 熊興耀, 石夢蝶, 秦宇 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)