專利名稱：用于湖羊母性行為分子標(biāo)記輔助選擇的引物及輔助選擇方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一種評價湖羊母性行為的方法及應(yīng)用，具體涉及一種用于湖羊母性行為分子標(biāo)記輔助選擇的引物及輔助選擇方法。
背景技術(shù)：
母性行為(Maternal behavior)屬于一種本能行為,是親代撫育(parental care)的主要組成部分，指雌性動物在分娩前后所表現(xiàn)出來的一系列撫育后代的行為性狀(趙曉蓮，齊淑芳，賈秀月.母性行為的研究進展[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2010，33 (5): 90-91)，如 母羊?qū)Ω嵫蛱蝮隆⒉溉?、踩踏和拒絕哺乳等行為，其中舔舐和哺乳行為為優(yōu)良母性行為，踩踏和拒絕哺乳為不良母性行為。母羊舔舐行為可使新生仔羊被毛干燥，起到保溫作用；母仔接觸可增強母羊識別仔羊的能力；此外，舔舐是很強的刺激，可起到按摩效果，令仔羊排出胎糞，促進生理機能的完善。分娩后的哺乳行為可使仔羊盡早吃到初乳可提高其對疾病的抵抗力以及促進消化道功能成熟。而踩踏和拒絕哺乳是導(dǎo)致羔羊死亡的重要原因，應(yīng)避免其產(chǎn)生。在家畜的生產(chǎn)和繁殖過程中，良好的母性行為對子代的成活和生長，在現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖過程中良好的母性行為能夠提高仔畜的存活率，進而提高養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟收入。湖羊繁殖能力強，四季均可配種繁殖，且湖羊適應(yīng)性廣，我國大部分地區(qū)均適宜養(yǎng)殖。湖羊生性溫順，好管理，適宜集約化飼養(yǎng)，其產(chǎn)肉性能理想，肉質(zhì)鮮美多汁。其以母性好著稱，故研究評價湖羊母性行為的方法可為評價其他羊品種母性行為提供一個借鑒的方法。Alcock認(rèn)為某些表型變異是由基因型變異導(dǎo)致的(Alcock，J·，2001. AnimalBehaviour. An Evolutionary Approach, 7th ed. Sinauer Associates Inc. , Sunderland)。Per Jensen認(rèn)為很多性狀的巨大變化可能是由調(diào)節(jié)基因的突變導(dǎo)致的，并且現(xiàn)代基因組學(xué)搭配行為性狀的分析方法，可為育種提供分析行為和生產(chǎn)性狀等關(guān)聯(lián)性的途徑(Per Jensen. Animal Behaviour. Domestication-From behaviour to genes and backagain, 2006(97)3-15)。催乳素受體(prolactin receptor,PRLR)基因總長度大于IOOkb,由10個外顯子和9個內(nèi)含子組成,其中外顯子I是可變的(Hu Z Z, Zhuang L, Meng J, et al. The humanProlactin receptor gene structure and alternative promoter utilization:thegeneric promoter HPIII and a novel human promoter hP(N)[J]. J Clin Endocrinol.Metab, 1999，84(3) :1153-1156)。Boutin 和 Kelly 等首次克隆大鼠的 PRLR cDNA(BoutinJM, Jolicoeur C, Okamura H, et al. Cloning and expression of the rat prolactinreceptor, a member of the growth hormone/prolactin receptor gene family[J].Cell. 1988，53:69-77)。綿羊的催乳素受體基因位于16號染色體(Jenkins Z A, Henry HM, Sise J A, etal. Follist at in (FST), growth hormone receptor(GH R)and prolact inreceptor (PRLR) genes map to the same region of sheep chromosome 16[J]. AnimalGenetics，2000，31. 280)，其配體之一是催乳素。催乳素的主要作用是刺激乳腺發(fā)育和促進泌乳，增強雌性動物的母性行為，如禽類抱性、鳥類反哺行為等(Vincent AL，WangL，Tuggle CK，Rothschild MF. Prolactin receptor maps to pig chromosome 16. Mamm.Genome, 1997,8(10) :793-794)。鑒于催乳素受體基因在母性行為表達中的重要作用，其深受國內(nèi)外研究學(xué)者的重視。但對湖羊母性行為的研究很少，主要集中在對其他物種母性的研究在Lucas B K等(1998年)的研究中，通過對小鼠進行試驗，抑制PRLR基因的表達，利用基因定位技術(shù)能夠直接檢測到PRLR基因?qū)π∈竽感孕袨榈挠绊憽Ｑ芯勘砻?，PRLR基因的一個無義突變會導(dǎo)致小鼠母性行為的缺陷(Lucas BK, Ormandy CJ, Binart N, et al. Null mutation of the prolactin receptor gene produces a defect in maternalbehavior[J]. Endocrinology,1998, 139(10):4012-4017)。侯鑫等(2010年)對母豬催乳素受體基因與母性行為關(guān)系的研究中根據(jù)PRLR(prolactin receptor, PRLR)基因?qū)Υ菩詣游锬感孕袨榈挠绊?，采用PCR — RFLP方法分析了 PRLR基因不同基因型與母性行為的相關(guān)性。通過二項回歸分析結(jié)果顯示，PRLR基因外顯子10的突變與5個母性行為之間無顯著相關(guān)(侯鑫.4個群體母豬催乳素受體基因與母性行為關(guān)系的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011，53-55.)。陳從英等(2010年)研究了 PRL、PRLR基因的遺傳變異及其與母豬殺嬰行為的關(guān)聯(lián)性。通過TDT分析發(fā)現(xiàn)，PRL和PRLR基因所有檢測SNP位點，無論基因型還是單倍型均與母豬殺嬰行為無顯著相關(guān)。原因可能是PRLR基因附近區(qū)域內(nèi)可能不存在影響母豬母性行為的主效基因，不同品種母豬的差異會對PRLR基因的表達有一定影響(陳從英，朱萬成，李平華，等.白色杜洛克X 二花臉F2資源群體中催乳素(PRL)和催乳素受體(PRLR)基因與母豬殺嬰行為和產(chǎn)仔數(shù)關(guān)聯(lián)性研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43 (II) :2347 — 2354.)。崔世泉等(2007年)研究了民豬和長白豬的PRLR基因cDNA第1620位點單核苷酸的突變，分析了 PRLR基因的cDNA第1620位點存在Nae I多態(tài)性。研究表明，AB基因型母豬與其他2種基因型母豬相比，由較低的側(cè)臥轉(zhuǎn)為其他姿勢的頻率以及由母豬結(jié)束哺乳的頻率差異顯著(P < 0. 05)，其他母性行為在基因型間差異不顯著(P > 0. 05)(崔世泉，李劍虹，崔衛(wèi)國，等.母豬哺乳初期的母性行為與催乳素受體基因多態(tài)性關(guān)系的初探[J].HEREDITAS(Beijing). 2007，29(1) :47-51.)。Chiang等(2002年)運用小鼠作為模型動物，研究對母豬母性行為選擇的相關(guān)反應(yīng)，結(jié)果表明小鼠花費在建窩、哺育幼仔、舔舐幼仔、找回幼仔、與幼仔一起休息的時間比率的遺傳力均為0. 20左右，并且它與斷奶幼鼠數(shù)量的遺傳相關(guān)達0. 78，這說明行為指數(shù)也具有相對較高的遺傳力(Chiang C H, Johnson R K, Nielsen M K. Selection formaternal behaviour in mice-direct and correlated responses[J]. Appl Anim BehavSci,2002，79:311-323.)。隨分子生物學(xué)及遺傳學(xué)研究手段、研究方法不斷進步，篩選和定位與復(fù)雜行為相關(guān)的基因已成為可能，分子標(biāo)記輔助選擇是提高選擇效率、加快育種進度的好方法。因此從分子水平開展遺傳學(xué)研究工作將成為湖羊母性行為研究的一個新領(lǐng)域
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于湖羊母性行為分子標(biāo)記輔助選擇的引物及輔助選擇方法。本發(fā)明所提供的湖羊母性行為分子標(biāo)記輔助選擇方法，是檢測湖羊PRLR基因外顯子10的第284位和第339位核苷酸為C還是突變?yōu)門，確定湖羊的基因型，再通過基因型對湖羊母性行為進行輔助選擇；所述PRLR基因外顯子10的核苷酸序列為GENBANKACCESSION NUMBER 為 FJ901298. I 的第 I 至 891 位核苷酸；所述確定湖羊的基因型的方法為若湖羊PRLR基因第10外顯子的第284位和339位核苷酸均為C時，其純合體的基因型為AA ;若第284位和第339位核苷酸均為T時，其純合體基因型為BB ;它們的雜合體基因型為AB ；通過基因型輔助選擇湖羊母性行為的標(biāo)準(zhǔn)為所述AA基因型湖羊的母性行為舔舐和哺乳行為(優(yōu)良母性行為)觀察值高于AB和BB基因型湖羊，而AA基因型湖羊的母性行為踩踏和拒絕哺乳行為(不良母性行為)觀察值低于AB和BB基因型湖羊。
所述方法中，檢測湖羊PRLR基因第10外顯子的第284位和第339位核苷酸為C還是突變?yōu)門的方法是利用PCR方法擴增待測湖羊PRLR基因外顯子10的核苷酸序列為GENBANK ACCESSION NUMBER為FJ901298. I的第224至456位的核苷酸片段。將該擴增產(chǎn)物進行單鏈構(gòu)象多態(tài)法檢測，若得到3條電泳條帶，即為AB基因型，得到分別與所述AB基因型電泳方向第一條電泳帶和第三條電泳帶具有相同遷移距離的兩條電泳條帶的為BB ；若與AB基因型的第二和第三條的遷移距離一致的為AA基因型。本發(fā)明所述用于湖羊母性行為分子標(biāo)記輔助選擇的引物對，其序列如序列表中序列I和序列2所示。所述方法中，所述母性行為觀察值為運用監(jiān)控設(shè)備記錄湖羊分娩期間的一系列母性行為，再通過視頻觀察所記錄的數(shù)據(jù)。本發(fā)明方法，采用單鏈構(gòu)象多態(tài)(single strand conformationpolymorphism, SSCP)方法對在PRLR基因第10外顯子部分進行單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotide polymorphism, SNP)檢測，從而比較PRLR基因第10外顯子在湖羊中的多態(tài)性，并對具有SSCP多態(tài)性的PCR擴增產(chǎn)物進行測序比較分析，需找到與母性行為相關(guān)的遺傳標(biāo)記，數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果表明，該遺傳標(biāo)記可評價湖羊的母性行為。本發(fā)明的方法即利用該遺傳標(biāo)記，建立SSCP檢測湖羊群體的基因型，并利用該基因型評價其母性行為的有效方法，實驗證明，該方法結(jié)合了監(jiān)控設(shè)備的使用，可迅速、簡便的檢測和評價湖羊的母性行為。本發(fā)明為湖羊的分子育種提供了一個準(zhǔn)確簡便的評價其母性的方法，并為其他羊品種的母性評價提供借鑒。


圖I為PRLR基因外顯子10對應(yīng)部分引物(P2、P3)擴增結(jié)果，其中M-PBR3 2 2marker。圖2為引物3擴增片斷的SSCP分析，其中1、2、4為AB型；3為AA型;5、6、7為BB型。圖3為舔舐行為的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分析圖。圖4為哺乳行為的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分析圖。
圖5為踩踏行為的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分析圖。圖6為拒絕哺乳的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分析圖。
具體實施例方式下述實施例中提到的試驗方法，如無特別說明均為常規(guī)方法。所述母性行為中，舔舐和哺乳行為為優(yōu)良母性行為，踩踏和拒絕哺乳為不良母性行為。實施例I評價湖羊母性行為的方法的建立及應(yīng)用效果驗證I材料與方法I. I實驗材料 選用2011年12月2012年到I月份期間分娩的湖羊作為研究對象，共81頭，其中63頭參與母性行為的關(guān)聯(lián)分析。全部來自蘇州種羊場。I. 2行為觀察及行為觀察數(shù)據(jù)的設(shè)定選擇有試驗記錄的湖羊母羊63頭，提前將其安排在固定羊舍，做好相應(yīng)記錄。在羊預(yù)產(chǎn)期來臨前將監(jiān)控設(shè)備安裝調(diào)試好，在羊分娩前進行預(yù)實驗，以確保視頻可正常觀察及儲存。實驗所用的漢邦高科16路錄像機以及索尼芯片的攝像頭均由漢邦高科公司提供。每個個體的錄像資料進行連續(xù)觀察。表I產(chǎn)仔后觀察時間表
時間產(chǎn)后0-24h 產(chǎn)后24-48h 產(chǎn)后48-72h-
時間段第I天第2天第3天觀察行為性狀包括①舔舐母羊用唇部或舌尖對出生后的仔羊頭部、耳朵、背部等身體進行舔舐。②哺乳母羊愿意給仔羊哺乳，并幫助仔羊?qū)ふ业饺轭^。③拒絕哺乳母羊拒絕給仔羊哺乳，或當(dāng)仔羊靠近母羊欲吃奶時，母羊不是把后軀暴露給仔羊，而是采用“頭對頭”的姿勢令仔羊無法接觸到乳房?；蛘吣秆驈娦兄袛嘧醒虻牟溉樾袨楹蟛贿M行其他有意義的行為。④踩踏(頂撞、踢蹴仔羊)母羊因乳房腫脹疼痛或其他原因，當(dāng)仔羊接近時，表現(xiàn)為頂撞或踢蹴仔羊。注舔舐和哺乳行為為優(yōu)良母性行為，拒絕哺乳和踩踏(頂撞、踢蹴仔羊)為不良母性行為；以上所有行為完成的計“1”，未完成的或者被中斷的不記錄。1.3DNA 提取湖羊耳組織樣蘇州種羊場分娩母羊81只。采用酚-氯仿法抽提綿羊的基因組DNA,滅菌TE溶解稀釋后-20°C保存?zhèn)溆谩Ｔ趯嶋H分析時采用有完整行為記錄的個體。I. 4主要試劑PCRlOXbuffer, dNTP, Taq DNA 聚合酶，DNA Ladder Marker 等均購自上海生物工程公司。I. 5引物的設(shè)計和產(chǎn)物的擴增
根據(jù) Bignon 等(Bignon C，Binart N, Ormandy C，Etal. Long and short formsof the ovine prolactin receptor:cDNA cloning and genomic analysis reveal thatthe two forms arise by different alternative splicing mechanisms inruminantsand in rodents [J]. J Mol Endocrinol, 1997, 19 (2) : 109-120.)發(fā)表的綿羊 PRLR mRNA 序列(GNEBANK ACCESSION NUMBER 為 AF041257)和 Terhi Iso-Touru 等發(fā)表的綿羊 PRLR 外顯子 10 序列(GNEBANK ACCESSION NUMBER 為 FJ901298. I) (Terhi, Iso-Touru, Juh, etal.Divergent evolution in the cytoplasmic domains of PRLR and GHR genes inArtiodactyla[J]. BMC Evolutionary Biology, 2009，9:172.),設(shè)計 4 對引物。其中 Pl 擴增片段為GNEBANK ACCESSION NUMBER為FJ901298. I的第366-561位核苷酸序列；P2擴增片段為GNEBANK ACCESSION NUMBER為AF041257的第1362-1630位核苷酸序列；P3擴增片段為GNEBANK ACCESSION NUMBER為FJ901298. I的第224-456位核苷酸序列；P4擴增片段為 GNEBANK ACCESSION NUMBER 為 FJ901298. I 的第 486-805 位核苷酸序列。表2綿羊催乳素受體基因PCR-SSCP分析選用的引物
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權(quán)利要求
1.一種湖羊母性行為分子標(biāo)記輔助選擇方法，是檢測湖羊PRLR基因外顯子10的第.284位和第339位核苷酸為C還是突變?yōu)門，確定湖羊的基因型，再通過基因型對湖羊母性行為進行輔助選擇；所述PRLR基因外顯子10的核苷酸序列為GENBANK ACCESSION NUMBER為FJ901298. I的第I至891位核苷酸； 所述確定湖羊的基因型的方法為若湖羊PRLR基因第10外顯子的第284位和339位核苷酸均為C時，其純合體的基因型為AA ;若第284位和第339位核苷酸均為T時，其純合體基因型為BB ;它們的雜合體基因型為AB ； 通過基因型輔助選擇湖羊母性行為的選擇標(biāo)準(zhǔn)為所述AA基因型湖羊的舔舐和哺乳行為高于AB和BB基因型湖羊，AA基因型湖羊的踩踏和拒絕哺乳行為低于AB和BB基因型湖羊。
2.一種用于權(quán)利要求I所述湖羊母性行為分子標(biāo)記輔助選擇的引物，其特征在于該引物的序列如列表中序列I和序列2示。
全文摘要
本發(fā)明公開了湖羊母性行為分子標(biāo)記輔助選擇方法及引物。該方法是檢測湖羊PRLR基因外顯子10的第284位和第339位核苷酸為C還是突變?yōu)門，確定湖羊的基因型，再通過基因型對湖羊母性行為進行選擇；若第284位和339位均為C時，其純合體的基因型為AA；若均為T時，其純合體基因型為BB；它們的雜合體基因型為AB；對于舔舐、哺乳行為AA基因型的多于AB基因型，AB基因型的多于BB基因型；對于踩踏行為和拒絕哺乳則AA基因型的低于AB基因型，AB基因型的低于BB基因型。本發(fā)明的方法利用遺傳標(biāo)記多態(tài)性評價湖羊母性行為，可簡便、迅速地檢測湖羊母性，為評價湖羊母性行為提供了一個簡便準(zhǔn)確的方法。
文檔編號A01H1/04GK102690890SQ20121020344
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月19日
發(fā)明者丁家桐, 吳文忠, 周洪, 孫偉, 孫煒, 左其生, 張向楠, 張有法, 李碧春, 王蘭萍, 耿榮慶, 陳玲 申請人:揚州大學(xué)