專利名稱：滇青岡與牛肝菌純共生體的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種滇青R與牛肝菌純共生關(guān)系建立的培養(yǎng)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是屬于植物組織培養(yǎng)及大型真菌菌絲體培養(yǎng)范疇。
背景技術(shù)：
在菌根真菌的研究中，植物與真菌的共生關(guān)系是研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)，很多學(xué)者曾嘗試建立一個(gè)穩(wěn)定的純共生體，以在排除其他雜菌及環(huán)境干擾的前提下對(duì)真菌的侵染機(jī)制、真菌與植物的共生背景以及共生機(jī)理等進(jìn)行深入的了解，但是在自然環(huán)境下符合上述條件的共生體幾乎是不存在的。
牛肝菌屬(Boletus)隸屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，傘菌綱(Agaricomycetes),牛肝菌目(Boletales),牛肝菌科(Boletaceae),為世界廣布大屬。牛肝菌子實(shí)體體型較大、肉質(zhì)肥厚、味道鮮美，是人類生活史中長(zhǎng)期采食的一類美味食用真菌，另外，該屬某些種類的子實(shí)體中還含有抗氧化、抗腫瘤等功能的特殊活性物質(zhì)，因而具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和研究前景。牛肝菌目前尚難以進(jìn)行人工栽培，屬于一類與植物共生的菌根真菌，在自然條件下與松科、殼斗科等植物形成共生關(guān)系。牛肝菌子實(shí)體的生長(zhǎng)發(fā)育與共生植物關(guān)系密切，對(duì)牛肝菌和其共生植物進(jìn)行生物學(xué)關(guān)系的研究是探討牛肝菌子實(shí)體發(fā)生機(jī)制的可行途徑。但當(dāng)研究牛肝菌與植物共生時(shí)，自然環(huán)境下根系微生物種類復(fù)雜，無法排除其它微生物對(duì)植物根系的干擾作用，這局限了一批現(xiàn)代技術(shù)在牛肝菌與植物共生機(jī)制研究上的運(yùn)用。漠青同{Cyclobalanopsisglaucoides )為殼斗科(Fagaceae)，青網(wǎng)屬(Cyclobalanopsis Oerst.)植物，其種子大、發(fā)芽率高；美味牛肝菌(B. edulis s. I.)為著名的可食用真菌，在牛肝菌屬中具有典型代表性，且在云南分布廣泛。因此本發(fā)明分別以武定獅子山采集的滇青R種子及一株廣義美味牛肝菌子實(shí)體為材料，誘導(dǎo)了愈傷組織及菌絲體，并對(duì)二者進(jìn)行了共培養(yǎng)，在無菌狀態(tài)下建立了一個(gè)愈傷組織與菌絲體的穩(wěn)定純共生體系。為今后利用基因敲除或其他技術(shù)研究牛肝菌與滇青網(wǎng)植物的共生關(guān)系、共生機(jī)理、牛肝菌子實(shí)體發(fā)生的分子機(jī)制等奠定了重要基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，在無菌條件下建立一種簡(jiǎn)單穩(wěn)定的牛肝菌與滇青網(wǎng)植物的共生體系。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案利用殼斗科滇青網(wǎng)植物種子，成功得到了無菌苗及愈傷組織，利用美味牛肝菌子實(shí)體誘導(dǎo)了菌絲體，將愈傷組織與菌絲體進(jìn)行共培養(yǎng)，室內(nèi)建立了共培養(yǎng)體系，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的主要步驟如下
(I)滇青R愈傷組織的誘導(dǎo)及培養(yǎng)于云南武定獅子山闊葉林中采集滇青R種子；將種子放至清水中，洗凈泥沙及污物，清除漂浮在水面上的爛種；將選出的種子自然干燥，把種皮剔除，挑選子葉中無明顯菌斑的種子；將挑選后的種子放置于75%乙醇溶液中，搖晃浸泡30 s，取出種子，用無菌水清洗2次；將種子放置于O. 1% HgCl2溶液中，搖晃浸泡10 min,取出種子，用無菌水清洗2 3次；將消毒處理后的種子芽胚朝上接進(jìn)種子萌發(fā)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，無糖，6-BA I. 00 I. 50mg/L，NAA O. 08 O. 10mg/L，瓊脂 7. 50 g/L，pH 為 6. 80)，每瓶接種I 2顆，未污染的褐化種子于21 22°C下暗培養(yǎng)9 12天后開始萌發(fā)，轉(zhuǎn)入2000 2500Lux的光照下培養(yǎng)20 23天，長(zhǎng)成8 IOcm的高莖桿小苗(葉少莖長(zhǎng));將小苗的莖截下，裁剪成I. O I. 5 Cm長(zhǎng)的小莖段，將其接種至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，蔗糖 30. 00 g/L，6-BA O. 80 I. 00mg/L, IAA2. 00 2. 50 mg/L，瓊脂 7. 50g/L, pH 為5. 40 5. 60)中，每瓶接種I 2個(gè)莖段，21 22°C下暗培養(yǎng)10 13天后，與培養(yǎng)基接觸的莖段基部開始膨大，并逐漸分化出愈傷組織，30 35天愈傷組織直徑達(dá)2. O 3. O cm；將已長(zhǎng)成的愈傷組織均勻切分成6 8小塊，接種至繼代培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，蔗糖30. 00 g/L，6-BA O. 80 I. 00 mg/L, NAA I. 50 2. 00mg/L，瓊脂 7. 50 g/L，pH 為 5. 40 5. 60)中，19 23天，形成疏松的團(tuán)塊狀組織，48 51天愈傷組織逐漸老化，色澤加深；
(2)美味牛肝菌菌絲體的誘導(dǎo)及培養(yǎng)于獅子山采摘生長(zhǎng)優(yōu)良、無蟲害、未開傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的美味牛肝菌子實(shí)體；將子實(shí)體帶回實(shí)驗(yàn)室，于超凈臺(tái)上用酒精棉球， 輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實(shí)體從菌蓋中部一分為二，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內(nèi)部組織塊，切成約0. 30 0. 50cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導(dǎo)培養(yǎng)基(馬鈴薯200. 00g/L、葡萄糖20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2L 00g /UKH2PO4O. 50g/L、NH4NO3 0.40g/L、KN03 0 . 40g /L、VB1 0. 10mg/L、麥芽汁 150ml/L、谷氨酸0. 16g/L、瓊脂13. 00g/L,pH5. 40)表面，培養(yǎng)溫度為22 23°C，暗培養(yǎng)7天，菌塊周圍開始萌發(fā)出白色菌絲，60天菌絲體基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)基；將以上誘導(dǎo)的菌絲轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，用擴(kuò)大培養(yǎng)基(淀粉5.00g/L，葡萄糖2. 50g/L，蛋白胨4. 13g/L，MgSO4L 00g /L,CaCl2 I. 00g /LjKH2PO4 0. 50g /L,VB1 0.10mg/L，谷氨酸 0. 16g/L，瓊脂 10. 00g/L，ρΗ5· 40)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；
(3)滇青R愈傷組織與牛肝菌菌絲體的共培養(yǎng)將上面已繼代生長(zhǎng)30 35天的滇青岡愈傷組織取出，切分成大小相近的8 10塊，分別將切好的愈傷組織接種進(jìn)共培養(yǎng)培養(yǎng)基(1/2MS 培養(yǎng)基，蔗糖 10. 00 13. 00 g/L,淀粉 2. 00 3. 00g/L,葡萄糖 I. 00 2. 00g/L,蛋白胨 2. 00 3. 00g/L，VB1 0.05 0. 10mg/L，谷氨酸 0. 08 0. 12g/L，6-BA0. 80 I. 00mg/L, NAA1. 70 2. 50 mg/L，瓊脂 8. 00 10. 00 g/L, pH 5· 4 5· 6)中，每瓶接一個(gè)，將培養(yǎng)皿中已擴(kuò)繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將截取的4個(gè)菌絲塊圍繞已接種的愈傷組織進(jìn)行4個(gè)方向的等距離接種，30 35天建立起一個(gè)無菌穩(wěn)定的共生體系。本發(fā)明的有益效果是創(chuàng)新性地建立了滇青網(wǎng)與牛肝菌的無菌共培養(yǎng)體系，其特點(diǎn)如下，
(O以滇青R為例，摸索出了一套共生植物的愈傷組織誘導(dǎo)方法，該方法簡(jiǎn)單、快速、成功率聞;
(2)提供了一種同時(shí)適合愈傷組織和菌絲體生長(zhǎng)的共培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基配制簡(jiǎn)單，易操
作；
(3)提供了一種植物與真菌共生關(guān)系建立的方法，為其它大型真菌與共生植物的研究提供了方法借鑒。
具體實(shí)施方式
以下的實(shí)施例子是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，不是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)例一
于云南武定獅子山闊葉林中采集滇青R種子；將種子放至清水中，洗凈泥沙及污物，清除漂浮在水面上的爛種； 將選出的種子自然干燥，把種皮剔除，挑選子葉中無明顯菌斑的種子；將挑選后的種子放置于75%乙醇溶液中，搖晃浸泡30 S，取出種子，用無菌水清洗2次；將種子放置于0.1% HgCl2溶液中，搖晃浸泡10 min，取出種子，用無菌水清洗2 3次；將消毒處理后的種子芽胚朝上接進(jìn)種子萌發(fā)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，無糖，6-BA I. 50mg/L, NAAO. 10mg/L，瓊脂7.50 g/L，pH為6. 80)，每瓶接種I 2顆，未污染的褐化種子于21 22°C下暗培養(yǎng)10天后開始萌發(fā)，轉(zhuǎn)入2000 2500LUX的光照下培養(yǎng)20天，長(zhǎng)成IOcm的高莖桿小苗(葉少莖長(zhǎng));將小苗的莖截下，裁剪成I. O I. 5 cm長(zhǎng)的小莖段，將其接種至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS 培養(yǎng)基，蔗糖 30.00 g/L，6-BA I. 00mg/L, IAA2. 00mg/L，瓊脂 7. 50g/L, pH為5. 60)中，每瓶接種I 2個(gè)莖段，21 22°C下暗培養(yǎng)10天后，與培養(yǎng)基接觸的莖段基部開始膨大，并逐漸分化出愈傷組織，30天愈傷組織直徑達(dá)3. O cm ;將已長(zhǎng)成的愈傷組織均勻切分成6 8小塊，接種至繼代培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，蔗糖30. 00 g/L，6-BA I. 00 mg/L,NAA I. 50mg/L,瓊脂7. 50 g/L, pH為5. 60)中，20天，形成疏松的團(tuán)塊狀組織，50天愈傷組織逐漸老化，色澤加深；
于獅子山采摘生長(zhǎng)優(yōu)良、無蟲害、未開傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的美味牛肝菌子實(shí)體；將子實(shí)體帶回實(shí)驗(yàn)室，于超凈臺(tái)上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實(shí)體從菌蓋中部一分為二，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內(nèi)部組織塊，切成約0. 30 0. 50cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導(dǎo)培養(yǎng)基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2L 00g /L、KH2PO4O. 50g/L、NH4NO30. 40g/L、KNO3O. 40g /L、VB10. 10mg/L、麥芽汁 150 ml/L、谷氨酸 0. 16g/L、瓊脂 13. OOg/L,pH5. 40)表面，培養(yǎng)溫度為22 23°C，暗培養(yǎng)7天，菌塊周圍開始萌發(fā)出白色菌絲，60天菌絲體基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)基；將以上誘導(dǎo)的菌絲轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，用擴(kuò)大培養(yǎng)基(淀粉5. 00g/L,葡萄糖 2. 50g/L，蛋白胨 4. 13g/L，MgSO4L 00g /L, CaCl2 I. 00g /L, KH2PO4 0. 50g /L, Vbi0. 10mg/L，谷氨酸 0. 16g/L，瓊脂 10. 00g/L, pH5. 40)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；
將上面已繼代生長(zhǎng)30天的滇青R愈傷組織取出，切分成大小相近的8 10塊，分別將切好的愈傷組織接種進(jìn)共培養(yǎng)培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基，蔗糖10. 00g/L,淀粉2. 50g/L,葡萄糖 I. 25g/L，蛋白胨 2. 06g/L,VB10. 05mg/L，谷氨酸 0. 08g/L，6_BAl. 00mg/L，NAAl. 70mg/L，瓊月旨10.00 g/L, pH 5.6)中，每瓶接一個(gè)，將培養(yǎng)皿中已擴(kuò)繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將截取的4個(gè)菌絲塊圍繞已接種的愈傷組織進(jìn)行4個(gè)方向的等距離接種，35天建立起一個(gè)無菌穩(wěn)定的共生體系。實(shí)例二
于云南武定獅子山闊葉林中采集滇青R種子；將種子放至清水中，洗凈泥沙及污物，清除漂浮在水面上的爛種；將選出的種子自然干燥，把種皮剔除，挑選子葉中無明顯菌斑的種子；將挑選后的種子放置于75%乙醇溶液中，搖晃浸泡30 S，取出種子，用無菌水清洗2次；將種子放置于0.1% HgCl2溶液中，搖晃浸泡10 min，取出種子，用無菌水清洗2 3次；將消毒處理后的種子芽胚朝上接進(jìn)種子萌發(fā)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，無糖，6-BA I. 30mg/L, NAA
0.10mg/L，瓊脂7.50 g/L，pH為6. 80)，每瓶接種I 2顆，未污染的褐化種子于21 22°C下暗培養(yǎng)11天后開始萌發(fā)，轉(zhuǎn)入2000 2500LUX的光照下培養(yǎng)22天，長(zhǎng)成IOcm的高莖桿小苗(葉少莖長(zhǎng));將小苗的莖截下，裁剪成I. O I. 5 cm長(zhǎng)的小莖段，將其接種至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS 培養(yǎng)基，蔗糖 30.00 g/L，6-BA O. 80mg/L, IAA2. 20mg/L，瓊脂 7. 50g/L, pH為5. 40)中，每瓶接種I 2個(gè)莖段，21 22°C下暗培養(yǎng)12天后，與培養(yǎng)基接觸的莖段基部開始膨大，并逐漸分化出愈傷組織，32天愈傷組織直徑達(dá)2. 5cm ;將已長(zhǎng)成的愈傷組織均勻切分成6 8小塊，接種至繼代培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，蔗糖30. 00 g/L，6-BA O. 80mg/L, NAA
1.80mg/L,瓊脂7. 50 g/L, pH為5. 40)中，19天，形成疏松的團(tuán)塊狀組織，48天愈傷組織逐漸老化，色澤加深；
于獅子山采摘生長(zhǎng)優(yōu)良、無蟲害、未開傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的美味牛肝菌子實(shí)體；將子實(shí)體帶回實(shí)驗(yàn)室，于超凈臺(tái)上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實(shí)體從菌蓋中部一分為二，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內(nèi)部組織塊，切成約O. 30 O. 50cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導(dǎo)培養(yǎng)基(馬 鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2L 00g /L、KH2PO4O. 50g/L、NH4NO30. 40g/L、KNO3O. 40g /L、VB10. 10mg/L、麥芽汁 150 ml/L、谷氨酸 0. 16g/L、瓊脂 13. OOg/L,pH5. 40)表面，培養(yǎng)溫度為22 23°C，暗培養(yǎng)7天，菌塊周圍開始萌發(fā)出白色菌絲，60天菌絲體基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)基；將以上誘導(dǎo)的菌絲轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，用擴(kuò)大培養(yǎng)基(淀粉5. 00g/L,葡萄糖 2. 50g/L，蛋白胨 4. 13g/L，MgSO4L 00g /L, CaCl2 I. 00g /L, KH2PO4 0. 50g /L, Vbi0. 10mg/L，谷氨酸 0. 16g/L，瓊脂 10. 00g/L, pH5. 40)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；
將上面已繼代生長(zhǎng)35天的滇青R愈傷組織取出，切分成大小相近的8 10塊，分別將切好的愈傷組織接種進(jìn)共培養(yǎng)培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基，蔗糖12.00 g/L，淀粉2. 00g/L，葡萄糖 I. 00g/L，蛋白胨 2. 00g/L, VB10. 10mg/L，谷氨酸 0. 10g/L，6_BA0. 80mg/L, NAA2. 00 mg/L,瓊脂8.00g/L，pH 5.6)中，每瓶接一個(gè)，將培養(yǎng)皿中已擴(kuò)繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將截取的4個(gè)菌絲塊圍繞已接種的愈傷組織進(jìn)行4個(gè)方向的等距離接種，32天建立起一個(gè)無菌穩(wěn)定的共生體系。實(shí)例三
于云南武定獅子山闊葉林中采集滇青R種子；將種子放至清水中，洗凈泥沙及污物，清除漂浮在水面上的爛種；將選出的種子自然干燥，把種皮剔除，挑選子葉中無明顯菌斑的種子；將挑選后的種子放置于75%乙醇溶液中，搖晃浸泡30 S，取出種子，用無菌水清洗2次；將種子放置于0.1% HgCl2溶液中，搖晃浸泡10 min，取出種子，用無菌水清洗2 3次；將消毒處理后的種子芽胚朝上接進(jìn)種子萌發(fā)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，無糖，6-BA I. 00mg/L, NAA
0.08mg/L，瓊脂7.50 g/L，pH為6. 80)，每瓶接種I 2顆，未污染的褐化種子于21 22°C下暗培養(yǎng)9天后開始萌發(fā)，轉(zhuǎn)入2000 2500LUX的光照下培養(yǎng)23天，長(zhǎng)成8cm的高莖桿小苗(葉少莖長(zhǎng));將小苗的莖截下，裁剪成I. O I. 5 cm長(zhǎng)的小莖段，將其接種至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，蔗糖 30.00 g/L，6-BA 0. 90mg/L, IM2. 30 mg/L，瓊脂 7. 50g/L，pH為5. 60)中，每瓶接種I 2個(gè)莖段，21 22°C下暗培養(yǎng)13天后，與培養(yǎng)基接觸的莖段基部開始膨大，并逐漸分化出愈傷組織，35天愈傷組織直徑達(dá)3.0 cm ；將已長(zhǎng)成的愈傷組織均勻切分成6 8小塊，接種至繼代培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，蔗糖30. 00 g/L, 6-BA 0. 90mg/L, NAA
2.00mg/L,瓊脂7. 50 g/L, pH為5. 60)中，23天，形成疏松的團(tuán)塊狀組織，51天愈傷組織逐漸老化，色澤加深；于獅子山采摘生長(zhǎng)優(yōu)良、無蟲害、未開傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的美味牛肝菌子實(shí)體；將子實(shí)體帶回實(shí)驗(yàn)室，于超凈臺(tái)上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實(shí)體從菌蓋中部一分為二，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內(nèi)部組織塊，切成約O. 30 O. 50cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導(dǎo)培養(yǎng)基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2L 00g /L、KH2PO4O. 50g/L、NH4NO30. 40g/L、KNO3O. 40g /L、VB10. 10mg/L、麥芽汁 150 ml/L、谷氨酸 0. 16g/L、瓊脂 13. OOg/L,pH5. 40)表面，培養(yǎng)溫度為22 23°C，暗培養(yǎng)7天，菌塊周圍開始萌發(fā)出白色菌絲，60天菌絲體基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)基；將以上誘導(dǎo)的菌絲轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，用擴(kuò)大培養(yǎng)基(淀粉5. 00g/L,葡萄糖 2.50g/L，蛋白胨 4. 13g/L，MgSO4L 00g /L, CaCl2 l.OOg /L, KH2PO4 0. 50g /L, Vbi0. 10mg/L，谷氨酸 0. 16g/L，瓊脂 10. 00g/L, pH5. 40)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；
將上面已繼代生長(zhǎng)32天的滇青R愈傷組織取出，切分成大小相近的8 10塊，分別將切好的愈傷組織接種進(jìn)共培養(yǎng)培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基，蔗糖13.00 g/L，淀粉2. 00g/L，葡萄糖 I. 00g/L，蛋白胨 3. 00g/L, Vbi 0. 08mg/L，谷氨酸 0. 12g/L，6_BA0. 90mg/L，NAA2. 30 mg/L,瓊脂9.00g/L，pH 5.4)中，每瓶接一個(gè)，將培養(yǎng)皿中已擴(kuò)繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器 截取，將截取的4個(gè)菌絲塊圍繞已接種的愈傷組織進(jìn)行4個(gè)方向的等距離接種，30天建立起一個(gè)無菌穩(wěn)定的共生體系。實(shí)例四
于云南武定獅子山闊葉林中采集滇青R種子；將種子放至清水中，洗凈泥沙及污物，清除漂浮在水面上的爛種；將選出的種子自然干燥，把種皮剔除，挑選子葉中無明顯菌斑的種子；將挑選后的種子放置于75%乙醇溶液中，搖晃浸泡30 S，取出種子，用無菌水清洗2次；將種子放置于0.1% HgCl2溶液中，搖晃浸泡10 min，取出種子，用無菌水清洗2 3次；將消毒處理后的種子芽胚朝上接進(jìn)種子萌發(fā)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，無糖，6-BA I. 20mg/L, NAA
0.08mg/L，瓊脂7.50 g/L，pH為6. 80)，每瓶接種I 2顆，未污染的褐化種子于21 22°C下暗培養(yǎng)12天后開始萌發(fā)，轉(zhuǎn)入2000 2500LUX的光照下培養(yǎng)21天，長(zhǎng)成9cm的高莖桿小苗(葉少莖長(zhǎng));將小苗的莖截下，裁剪成I. O I. 5 cm長(zhǎng)的小莖段，將其接種至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS 培養(yǎng)基，蔗糖 30.00 g/L，6-BA I. 00mg/L, IAA2. 50mg/L，瓊脂 7. 50g/L, pH為5. 40)中，每瓶接種I 2個(gè)莖段，21 22°C下暗培養(yǎng)13天后，與培養(yǎng)基接觸的莖段基部開始膨大，并逐漸分化出愈傷組織，33天愈傷組織直徑達(dá)2. 7cm ;將已長(zhǎng)成的愈傷組織均勻切分成6 8小塊，接種至繼代培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，蔗糖30. 00 g/L，6-BA 1.00 mg/L, NAA
1.60mg/L,瓊脂7. 50 g/L, pH為5. 40)中，21天，形成疏松的團(tuán)塊狀組織，49天愈傷組織逐漸老化，色澤加深；
于獅子山采摘生長(zhǎng)優(yōu)良、無蟲害、未開傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的美味牛肝菌子實(shí)體；將子實(shí)體帶回實(shí)驗(yàn)室，于超凈臺(tái)上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實(shí)體從菌蓋中部一分為二，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內(nèi)部組織塊，切成約0. 30 0. 50cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導(dǎo)培養(yǎng)基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2L 00g /L、KH2PO4O. 50g/L、NH4NO30. 40g/L、KNO3O. 40g /L、VB10. 10mg/L、麥芽汁 150 ml/L、谷氨酸 0. 16g/L、瓊脂 13. OOg/L,pH5. 40)表面，培養(yǎng)溫度為22 23°C，暗培養(yǎng)7天，菌塊周圍開始萌發(fā)出白色菌絲，60天菌絲體基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)基；將以上誘導(dǎo)的菌絲轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，用擴(kuò)大培養(yǎng)基(淀粉5. 00g/L,葡萄糖 2.50g/L，蛋白胨 4. 13g/L，MgSO4L OOg /L, CaCl2 l.OOg /L, KH2PO4 0. 50g /L, Vbi0. 10mg/L，谷氨酸 0. 16g/L，瓊脂 10. OOg/L, pH5. 40)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；
將上面已繼代生長(zhǎng)33天的滇青R愈傷組織取出，切分成大小相近的8 10塊，分別將切好的愈傷組織接種進(jìn)共培養(yǎng)培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基，蔗糖11. 00g/L,淀粉3. 00g/L,葡萄糖 2. 00g/L，蛋白胨 2. 50g/L,VB1 0.05mg/L，谷氨酸 0. 08g/L，6-BA1. 00 mg/L,NAA2. 50 mg/L，瓊脂10.00 g/L, pH 5.4)中，每瓶接一個(gè)，將培養(yǎng)皿中已擴(kuò)繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將截取的4個(gè)菌絲塊圍繞已接種的愈傷組織進(jìn)行4個(gè)方向的等距離接種，34天建 立起一個(gè)無菌穩(wěn)定的共生體系。
權(quán)利要求
1.一種滇青岡與牛肝菌純共生關(guān)系的建立方法，其特征為，利用野外采集的滇青岡(Cyclobalanopsis glaucoides )種子培養(yǎng)無菌苗,誘導(dǎo)愈傷組織,利用野外采集的美味牛肝菌(Boletus edulis s. I.)子實(shí)體誘導(dǎo)菌絲體,將愈傷組織與菌絲體進(jìn)行共培養(yǎng),室內(nèi)建立共生關(guān)系，主要包括下列步驟 (1)滇青R愈傷組織的誘導(dǎo)及培養(yǎng)于云南武定獅子山闊葉林中采集滇青R種子；將種子放至清水中，洗凈泥沙及污物，清除漂浮在水面上的爛種；將選出的種子自然干燥，把種皮剔除，挑選子葉中無明顯菌斑的種子；將挑選后的種子放置于75%乙醇溶液中，搖晃浸泡30 S，取出種子，用無菌水清洗2次；將種子放置于0. 1% HgCl2溶液中，搖晃浸泡10 min,取出種子，用無菌水清洗2 3次；將消毒處理后的種子芽胚朝上接進(jìn)萌發(fā)培養(yǎng)基，每瓶接種I 2顆，未污染的褐化種子于21 22°C下暗培養(yǎng)9 12天后開始萌發(fā)，轉(zhuǎn)入2000 2500Lux的光照下培養(yǎng)20 23天，長(zhǎng)成8 IOcm的高莖桿小苗(葉少莖長(zhǎng))；將小苗的莖截下，裁剪成I. 0 I. 5 cm長(zhǎng)的小莖段，將其接種至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種I 2個(gè)莖段，21 22°C下暗培養(yǎng)10 13天后，與培養(yǎng)基接觸的莖段基部開始膨大，并逐漸分化出愈傷組織，30 35天愈傷組織直徑達(dá)2. 0 3. 0 cm ;將已長(zhǎng)成的愈傷組織均勻切分成6 8小塊，接種至繼代培養(yǎng)基中，19 23天，形成疏松的團(tuán)塊狀組織，48 51天愈傷組織逐漸老化，色澤加深； (2)美味牛肝菌菌絲體的誘導(dǎo)及培養(yǎng)于獅子山采摘生長(zhǎng)優(yōu)良、無蟲害、未開傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的美味牛肝菌子實(shí)體；將子實(shí)體帶回實(shí)驗(yàn)室，于超凈臺(tái)上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實(shí)體從菌蓋中部一分為二，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內(nèi)部組織塊，切成約0. 30 0. 50cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)溫度為22 23°C，暗培養(yǎng)7天，菌塊周圍開始萌發(fā)出白色菌絲，60天菌絲體基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)基；將以上誘導(dǎo)的菌絲轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，用擴(kuò)大培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)； (3)滇青R愈傷組織與牛肝菌菌絲體的共培養(yǎng)將上面已繼代生長(zhǎng)30 35天的滇青岡愈傷組織取出，切分成大小相近的8 10塊，分別將切好的愈傷組織接種進(jìn)共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，每瓶接一個(gè)，將培養(yǎng)皿中已擴(kuò)繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將截取的4個(gè)菌絲塊圍繞已接種的愈傷組織進(jìn)行4個(gè)方向的等距離接種，30 35天建立起一個(gè)無菌穩(wěn)定的共生體系。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的滇青網(wǎng)與牛肝菌共生關(guān)系的建立方法，其特征在于步驟(I)中的 滇青岡種子萌發(fā)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，無糖，6-BA I. 00 I. 50mg/L，NAA 0. 08 0.10mg/L，瓊脂7. 50 g/L，pH為6. 80 ;愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為=MS培養(yǎng)基，蔗糖30. 00 g/L，6-BA 0. 80 I. 00mg/L, IAA2. 00 2. 50 mg/L,瓊脂 7. 50g/L, pH 為 5. 40 5. 60 ;愈傷組織繼代培養(yǎng)基為=MS培養(yǎng)基，蔗糖30. 00 g/L，6-BA 0. 80 I. 00 mg/L, NAA I. 50 2.00mg/L,瓊脂 7. 50 g/L, pH 為 5. 40 5. 60。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的滇青網(wǎng)與牛肝菌共生關(guān)系的建立方法，其特征在于步驟(2)中的 美味牛肝菌菌絲體的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為馬鈴薯200. 00g/L、葡萄糖20. 00g/L、MgS04l. OOg/L、CaCl2L 00g /L、KH2PO4O. 50g/L、NH4NO3 0. 40g/L、KNO3 0. 40g /L、Vbi 0. 10mg/L、麥芽汁150ml/L、谷氨酸0. 16g/L、瓊脂13. OOg/L, pH5. 40 ;擴(kuò)大培養(yǎng)基為淀粉5. 00g/L，葡萄糖·2.50g/L，蛋白胨 4. 13g/L, MgSO4L OOg /L, CaCl2 I. OOg /L, KH2PO4 0. 50g /L, Vbi 0. IOmg/L，谷氨酸 0. 16g/L，瓊脂 10. OOg/L, pH5. 40。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的滇青網(wǎng)與牛肝菌共生關(guān)系的建立方法，其特征在于步驟(3)中的共培養(yǎng)培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基，蔗糖10. 00 13. 00 g/L，淀粉2. 00 3. 00g/L，葡萄糖 I. 00 2. 00g/L，蛋白胨 2. 00 3. 00g/L，Vbi 0. 05 0. 10mg/L，谷氨酸 0.08 0.12g/L，6-BA0. 80 I. 00 mg/L, NAA1. 70 2. 50 mg/L，瓊脂 8. 00 10. 00 g/L, pH 5. 4 5. 6。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種滇青岡與牛肝菌純共生關(guān)系的建立方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域(植物組織與真菌培養(yǎng))。在菌根真菌的研究中，尚難以建立一個(gè)穩(wěn)定的植物與真菌的純共生體。牛肝菌目前尚難以人工栽培，屬于一類與植物共生的菌根真菌，在自然條件下與松科、殼斗科等植物形成共生關(guān)系。本發(fā)明以武定獅子山采集的滇青岡種子及一株廣義美味牛肝菌子實(shí)體為材料，成功地分別誘導(dǎo)了愈傷組織、菌絲體，并對(duì)愈傷組織與菌絲體進(jìn)行了創(chuàng)新性共培養(yǎng)，在無菌狀態(tài)下建立了一個(gè)簡(jiǎn)單穩(wěn)定的純共生體系。這為今后進(jìn)一步研究牛肝菌與滇青岡等植物的共生關(guān)系、共生機(jī)理、牛肝菌子實(shí)體發(fā)生的分子機(jī)制等奠定了重要基礎(chǔ)，也為其它大型真菌與共生植物的研究提供了方法借鑒。
文檔編號(hào)A01G1/04GK102754596SQ201210205939
公開日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2012年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月21日
發(fā)明者吳鵬, 周文, 張曦予, 李宗菊, 李彪, 王鵬飛 申請(qǐng)人:云南大學(xué)