專利名稱：一種防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于林業(yè)害蟲生物防治技術(shù)領(lǐng)域，具體為ー種防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制備方法。
背景技術(shù)：
松墨天牛及其傳播的松材線蟲病對我國松林造成了非常嚴(yán)重的危害，防治松墨天牛和持續(xù)控制松材線蟲是林業(yè)工作者當(dāng)前急需解決的一大難題。目前防治松墨天牛的方法主要有以下三種化學(xué)防治、利用引誘劑防治天牛成蟲與生物防治。化學(xué)防治存在較大的負(fù)面影響。生物防治是ー種環(huán)境友好型的植保技木，尋找可傳染并降低害蟲種群數(shù)量的病原微生物等生態(tài)控制因子顯得尤為重要。
關(guān)于松墨天牛的防治研究，國內(nèi)外做了大量的工作，歸納起來有以下幾條防治途徑。(I)化學(xué)防治飛機(jī)空中施藥(成片林分面積在3萬hm2以上適用)和地面機(jī)械噴藥方式殺滅松墨天牛。日本于70年代始采用殺螟松(MEP)、倍硫磷(MPP)、西維因(NAC)等飛機(jī)噴灑，一天內(nèi)可殺死80%天牛成蟲。江蘇采用3%殺螟松連續(xù)幾年噴灑，但效果不明顯。近些年來我國研究開發(fā)了長效緩劑型，先后有21%滅殺斃微膠囊，30%敵ー馬微膠囊，DFM-21 (溴氰菊酯一倍硫磷)與FFM — 20 (氰戍菊酯一倍硫磷)微膠囊等。南京林業(yè)大學(xué)曾開發(fā)出觸雷式微膠囊劑型，經(jīng)小面積和飛防試驗效果較好。(2)利用引誘劑防治天牛成蟲日本已開發(fā)天牛引誘劑商品以及不育劑商品，效果較好。廣東省和浙江省也開展了研究，并開 發(fā)出自產(chǎn)的引誘劑，效果比日產(chǎn)的好，目前已在生產(chǎn)上使用。⑶生物防治日本與我國采用球孢白僵菌和管氏腫腿蜂防治天牛幼蟲，取得了較好的成果。自然界中，松墨天牛往往還受到病原微生物的侵染而得病死亡。松墨天牛的天敵微生物資源比較豐富，主要有真菌、細(xì)菌和寄生性線蟲，其中最重要的是真菌類。利用微生 物防治害蟲具有以下獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)(I)害蟲不易產(chǎn)生抗藥性，由于微生物殺蟲是多種因素和成分發(fā)揮作用，同時在與害蟲長期共同生活的過程中適應(yīng)了昆蟲的防衛(wèi)體系，昆蟲對病原微生物的免疫カ長期保持低水平；(2)具有良好的環(huán)境安全性，對寄主有較強(qiáng)的選擇性，不殺害天敵和有益生物，一般對脊椎動物無害，有利于保護(hù)天敵，保持生態(tài)平衡；(3)昆蟲是各類病原體理想的培養(yǎng)基，病原體在昆蟲體內(nèi)増殖，可通過病蟲或蟲尸擴(kuò)散傳播，在時間和空間上具有擴(kuò)散蔓延能力，通過再侵染，形成不同程度的流行病，便于引種定殖，達(dá)到持續(xù)控制害蟲的效果；(4)易于通過基因工程改造獲得致病力強(qiáng)的品系。因此，利用微生物控制松墨天牛越來越受到人們的關(guān)注和重視。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計提供一種防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制備方法的技術(shù)方案，其生產(chǎn)成本低，殺蟲和驅(qū)蟲效果好，且對環(huán)境影響小，對人體安全可靠。所述的ー種防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制備方法，其特征在于具體包括以下步驟
1)將球孢白僵菌菌株接種在PPDA培養(yǎng)基上，于22-25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14_18d后，刮下分生孢子，用無菌水稀釋成O. 8-1. 2X108個^mL- I的孢子懸浮液，按孢子懸浮液發(fā)酵培養(yǎng)基體積比為O. 5-1. 5:100的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基上，再將其置于23-26°C、120-150rpm的恒溫振蕩培養(yǎng)箱里培養(yǎng)5. 5-8d,備用；
2)取步驟I)發(fā)酵液，3-5°C、3500-4500rpm離心10_15min，收集上清液，用3層濾紙真空抽濾，除去發(fā)酵液中懸浮的菌絲，收集的濾液得胞外全蛋白粗提液，備用；
3)取步驟2)胞外全蛋白粗提液，每IOOmL中加入IOpLこニ胺四こ酸 ，并在冰浴條件下加入硫酸銨粉末至其飽和度達(dá)85-95% ;同時用磁力攪拌器不斷攪拌以加速硫酸銨的溶解，控制加入速度使不起泡沫；最后，3-5°C下靜置過夜，而后將該粗提液3-5°C、9500-10000rpm離心10_15min，棄上清液，將沉淀用其重量4_5%的O. 04mol じSpH =6. 6的磷酸緩沖液溶解，即得胞外全蛋白粗提濃縮液，備用；
4)取步驟3)胞外全蛋白粗提濃縮液裝入透析袋中，3-5°C下透析15-18h，透析液為稀釋3. 5-4. 5倍的O. 04mol ·じpH =6. 6的磷酸緩沖液，透析后的濃縮液，經(jīng)3_5°C、5000-6000rpm離心10_15min,棄沉淀，收集上清液，并經(jīng)O. 21-0. 26 μ m細(xì)菌過濾器過濾除菌，最終所得濾液即為胞外全蛋白提取液。所述的ー種防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制備方法，其特征在干步驟O中培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)溫度為23-24°C，培養(yǎng)時間為15-16d，孢子懸浮液的濃度為IXlO8個· mL- I，恒溫振蕩培養(yǎng)箱的培養(yǎng)溫度為24-25°C，轉(zhuǎn)速為130_140rpm，培養(yǎng)時間6_7d。所述的ー種防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制備方法，其特征在于步驟2)中離心轉(zhuǎn)速為3800-4000rpm,離心時間為12_13min。所述的ー種防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制備方法，其特征在于步驟3)中離心轉(zhuǎn)速為9700-9900rpm，離心時間為12_13min，
所述的ー種防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制備方法，其特征在于步驟4)中透析溫度為4-4. 5°C，透析時間為16-17h，離心轉(zhuǎn)速5500-5800rpm，離心時間12_13min。上述PPDA培養(yǎng)基可以從市場上直接購得。上述一種防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制備方法，以硫酸銨沉淀法提取了球孢白僵菌中對松墨天牛具有高毒力的胞外全蛋白提取液，具有強(qiáng)烈的殺蟲活性，能防治松墨天牛，保護(hù)松林免受破壞，解決了目前松墨天牛傳播松材線蟲的防治難題，該藥劑即使長期使用也不會使害蟲產(chǎn)生抗藥性。其在環(huán)境中能自動降解，使用安全高效，不會對環(huán)境造成污染，防治效果較好，是良好的生物防治藥劑。本申請文件中涉及的百分含量除另有說明外，其它的均為純物質(zhì)的重量百分含量。
具體實施例方式現(xiàn)結(jié)合本發(fā)明的藥效試驗，進(jìn)ー步說明本發(fā)明的有益效果。該防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制備方法，包括以下步驟
I)將球孢白僵菌菌株接種在PPDA培養(yǎng)基上，于23°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16d后，刮下分生孢子，用無菌水稀釋成I. OX IO8個的孢子懸浮液，按孢子懸浮液發(fā)酵培養(yǎng)基體積比為1:100接種于發(fā)酵培養(yǎng)基上，再將其置于25°C、130rpm的恒溫振蕩培養(yǎng)箱里培養(yǎng)7d，備用；
2)取步驟I)發(fā)酵液,4°C、4000rpm離心13min,收集上清液,用3層濾紙真空抽濾,除去發(fā)酵液中懸浮的菌絲，收集的濾液得胞外全蛋白粗提液，備用；
3)取步驟2)胞外全蛋白粗提液，每IOOmL中加入IOpLこニ胺四こ酸，并在冰浴條件下加入硫酸銨粉末至其飽和度達(dá)90%，同時用磁力攪拌器不斷攪拌以加速硫酸銨的溶解，控制加入速度使不起泡沫；最后，4°C下靜置過夜，而后將該粗提液4°C、9500rpm離心13min，棄上清液，將沉淀用其重量4%的O. 04mol じ1，pH =6. 6的磷酸緩沖液溶解，即得胞外全蛋白粗提濃縮液，備用； 4)取步驟3)胞外全蛋白粗提濃縮液裝入透析袋中，4°C下透析16h，透析液為稀釋4倍的O. 04mol じ1, pH =6. 6的磷酸緩沖液,透析后的濃縮液,經(jīng)4°C、5500rpm離心13min,棄沉淀，收集上清液，并經(jīng)O. 24 μ m細(xì)菌過濾器過濾除菌，最終所得濾液即為胞外全蛋白提取液。上述步驟I)中培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)溫度為22°C或25°C，培養(yǎng)時間為14 d或18d，孢子懸浮液的濃度為I X 108個·ΙΛ- 1，恒溫振蕩培養(yǎng)箱的培養(yǎng)溫度為23°C或26°C，轉(zhuǎn)速為120或150rpm，培養(yǎng)時間5. 5或8d;步驟2)中離心轉(zhuǎn)速為3500或4500rpm，離心時間為10或15min ;胞外全蛋白粗提液在冰浴條件下加入硫酸銨粉末至其飽和度達(dá)85或95% ;步驟3)中離心轉(zhuǎn)速為9500或lOOOOrpm，離心時間為10或15min ;步驟4)中透析溫度為3或5°C，透析時間為15或18h，離心轉(zhuǎn)速5000或6000rpm，離心時間10或15min ;其它同上，也能取得本發(fā)明所述的技術(shù)效果。試驗一
將IOPL樣品通過IOOPL注射器從4齡松墨天牛腹部第四腹節(jié)處注入其血腔，然后將天牛單頭單瓶飼養(yǎng)，設(shè)空白對照組，。每天定時觀察記錄松墨天牛幼蟲死亡與癥狀情況。胞外全蛋白提取液，如從菌株BI得到的胞外全蛋白提取液即記為“B/’。采用血腔注射法測定14個菌株的全蛋白提取液對松墨天牛4齡幼蟲的毒力，計算處理后的校正死亡率，結(jié)果見表I。根據(jù)每天的校正死亡率計算LT5tl，結(jié)果見表2。
權(quán)利要求
1.一種防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制備方法，其特征在于具體包括以下步驟 1)將球孢白僵菌菌株接種在PPDA培養(yǎng)基上，于22-25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14_18d后，刮下分生孢子，用無菌水稀釋成O. 8-1. 2 X 108個^mL- I的孢子懸浮液，按孢子懸浮液發(fā)酵培養(yǎng)基體積比為O. 5-1. 5:100的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基上，再將其置于23-26°C、120-150rpm的恒溫振蕩培養(yǎng)箱里培養(yǎng)5. 5-8d,備用； 2)取步驟I)發(fā)酵液，3-5°C、3500-4500rpm離心10_15min，收集上清液，用3層濾紙真空抽濾，除去發(fā)酵液中懸浮的菌絲，收集的濾液得胞外全蛋白粗提液，備用； 3)取步驟2)胞外全蛋白粗提液，每IOOmL中加入IOpLこニ胺四こ酸，并在冰浴條件下加入硫酸銨粉末至其飽和度達(dá)85-95% ;同時用磁力攪拌器不斷攪拌以加速硫酸銨的溶解，控制加入速度使不起泡沫；最后，3-5°C下靜置過夜，而后將該粗提液3-5°C、9500-10000rpm離心10_15min，棄上清液，將沉淀用其重量4_5%的O. 04mol じSpH =6. 6的磷酸緩沖液溶解，即得胞外全蛋白粗提濃縮液，備用； 4)取步驟3)胞外全蛋白粗提濃縮液裝入透析袋中，3-5°C下透析15-18h，透析液為稀釋3. 5-4. 5倍的O. 04mol ·じpH =6. 6的磷酸緩沖液，透析后的濃縮液，經(jīng)3_5°C、5000-6000rpm離心10_15min,棄沉淀，收集上清液，并經(jīng)O. 21-0. 26 μ m細(xì)菌過濾器過濾除菌，最終所得濾液即為胞外全蛋白提取液。
2.如權(quán)利要求I所述的ー種防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制備方法，其特征在于步驟I)中培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)溫度為23-24°C，培養(yǎng)時間為15-16d，孢子懸浮液的濃度為IX IO8個· mL- 1，恒溫振蕩培養(yǎng)箱的培養(yǎng)溫度為24-25°C，轉(zhuǎn)速為130_140rpm，培養(yǎng)時間 6-7d。
3.如權(quán)利要求I所述的ー種防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制備方法，其特征在于步驟2)中離心轉(zhuǎn)速為3800-4000rpm，離心時間為12_13min。
4.如權(quán)利要求I所述的ー種防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制備方法，其特征在于步驟3)中離心轉(zhuǎn)速為9700-9900rpm，離心時間為12_13min， 如權(quán)利要求I所述的ー種防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制備方法，其特征在于步驟4)中透析溫度為4-4. 5°C，透析時間為16-17h，離心轉(zhuǎn)速5500_5800rpm，離心時間12-13min。
全文摘要
一種防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制備方法，屬于林業(yè)害蟲生物防治技術(shù)領(lǐng)域。其特征在于具體包括以下步驟1)將球孢白僵菌菌株接種培養(yǎng)得發(fā)酵液；2)發(fā)酵液分離，收集上清液，除去菌絲，濾液為胞外全蛋白粗提液；3)胞外全蛋白粗提液，加入乙二胺四乙酸，并在冰浴條件下加入硫酸銨粉末，攪拌溶解后靜置過夜，沉淀用磷酸緩沖液溶解，即得胞外全蛋白粗提濃縮液；4)胞外全蛋白粗提透析，濃縮液分離，上清液過濾除菌，即為胞外全蛋白提取液。上述一種防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制備方法，制得的胞外全蛋白提取液具有強(qiáng)烈的殺蟲活性，能防治松墨天牛，使用安全高效，無污染，防治效果較好，是良好的生物防治藥劑。
文檔編號A01P17/00GK102731612SQ20121022061
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月29日
發(fā)明者劉洪波, 林海萍, 毛勝鳳 申請人:浙江農(nóng)林大學(xué)