專利名稱：水稻抗病基因OsLYP6及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種水稻抗病基因及其應(yīng)用，特別涉及水稻抗病基因0SLYP6及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物在自然界中受到微生物等病原體侵襲，可在細(xì)胞水平上啟動(dòng)快速的早期防御機(jī)制，即天然免疫反應(yīng)(innate immune) (Iriti and Faoro, 2007 . Iriti, M.,and Faoro, F. Review of innate and specific immunity in plants and animals.Mycopathologia. 2007，164，57-64)。天然免疫反應(yīng)是植物針對(duì)病原侵襲產(chǎn)生的基礎(chǔ)防御反應(yīng)，主要過程包括對(duì)病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern, PAMP)，即病原體細(xì)胞表面成分的識(shí)別(主要涉及PAMPs與PAMP受體)；將入侵信號(hào)由胞外向胞內(nèi)傳遞，啟動(dòng)宿主細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)；進(jìn)而影響下游抗病基因的表達(dá)，最終對(duì)病原產(chǎn)生防御(Boiler and He，2009 Boiler，T.，and He，S. Y. Innate immunity in plants:an arms race between pattern recognition receptors in plants and effectors inmicrobial pathogens. Science，2009，324，742-744; Cui et al.，2009 Cui, H.，Xiang, T. ， and Zhou, J.M. Plant immunity: a lesson from pathogenic bacterialeffector proteins. Cell Microbiol. , 2009，11，1453-1461)。植物PAMPs主要包括脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、肽聚糖(peptidoglycan，PGN)、鞭毛蛋白(flagellin，flg22)、延伸因子 EF_Tu、真菌細(xì)胞壁成分(幾丁質(zhì) / 殼聚糖寡糖)等(Gust et al.，2007 Gust，A. A.，Biswas，R.，Lenz,H. D.，Rauhut, T.，Ranf, S.，Kemmerling，B.，Gotz，F(xiàn).，Glawischnig，E.，Lee,J. ， Felix, G. ， and Nurnberger, T. Bacteria-derived peptidoglycans constitutepathogen-associated molecular patterns triggering innate immunity inArabidopsis. J Biol Chem. ， 2007， 282， 32338-32348; Zipfel and Robatzek， 2010Zipfel， C. ， and Robatzek, S. Pathogen-associated molecular pattern-triggeredimmunity: veni，vidi. Plant Physiol, 2010，154，551-554)。當(dāng)這類物質(zhì)作用于植物細(xì)胞表面，可被相應(yīng)的受體分子感應(yīng)，并通過下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列免疫應(yīng)答(Kishi-Kaboshi et al.，2010 Kishi-Kaboshi，M.，Okada, K.，Kurimoto, L，Murakami，S.，Umezawa, T.，Shibuya, N.，Yamane，H.，Miyao，A.，Takatsuji，H.，Takahashi， A. ， and Hirochika， H. A rice fungal MAMP-responsive MAPK cascaderegulates metabolic flow to antimicrobial metabolite synthesis. Plant J .，2010，63，599-612)。因此，對(duì)外源PAMP的感應(yīng)與識(shí)別是植物天然免疫反應(yīng)的重要起始步驟，對(duì)植物細(xì)胞中感應(yīng)PAMP的受體分子及其作用機(jī)制進(jìn)行研究，是植物免疫反應(yīng)系統(tǒng)研究的重要方面(Kishimoto et al.，2010 Kishimoto, K.，Kouzai, Y.，Kaku, H.，Shibuya,N.，Minami, E.，and Nishizawa, Y. Perception of the chitin oligosaccharidescontributes to disease resistance to blast fungus Magnaporthe oryzae in rice.Plant J . ， 2010， 64， 343-354)。PAMP受體多屬于跨膜激酶受體，如flg22受體FLS2、EF-Tu受體EFR，它們可以識(shí)別病原菌表面分子，通過激活自身激酶活性，將引起胞內(nèi)的信號(hào)傳遞。此外，在真菌PAMP受體的研究中，還發(fā)現(xiàn)一些LysM蛋白參與了幾丁質(zhì)類PAMP的識(shí)別反應(yīng)過程(Kaku et al.,2006 Kaku, H. , Nishizawa, Y. , Ishii-Minami, N. , Akimoto-Tomiyama, C. , Dohmae,N. , Takio, K. , Minami, E. , and Shibuya, N. Plant cells recognize chitinfragments for defense signaling through a plasma membrane receptor. Proc NatlAcad Sci U S A ， 2006， 103， 11086-11091; Miya et al. ， 2007 Miya, A. ， Albert,P., Shinya, T. , Desaki, Y. , Ichimura, K. , Shirasu, K. , Narusaka, Y. , Kawakami,N. , Kaku, H. , and Shibuya, N. CERKl, a LysM receptor kinase, is essential forchitin elicitor signaling in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104,19613-19618)。LysM蛋白，即含有LysM (lysin motif)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。LysM結(jié)構(gòu)域是肽聚糖(peptidoglycan, PGN)結(jié)合結(jié)構(gòu)域,最早發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌中的肽聚糖裂解酶中，其功能是識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖成分。LysM蛋白廣泛存在于古細(xì)菌之外的各物種(Buist et al. , 2008 Buist, G. , Steen, A. , Kok, J. , and Kuipers, 0. P. LysM, a widelydistributed protein motif for binding to (peptido)glycans. Mol Microbiol .,2008，68，838-847)。LysM蛋白的功能可能涉及植物病原防御反應(yīng)，細(xì)菌中LysM蛋白主要是對(duì)細(xì)菌肽聚糖進(jìn)行識(shí)別與結(jié)合，但植物中LysM蛋白主要識(shí)別結(jié)合的PAMP為真菌細(xì)胞壁
成分-幾丁質(zhì)及其寡糖分子(de Jonge et al. , 2010 de Jonge, R., van Esse, H. P.,
Kombrink, A. , Shinya, T. , Desaki, Y. , Bours, R. , van der Krol, S. , Shibuya, N.,Joosten, M. H. , and Thomma, B. P. Conserved fungal LysM effector Ecp6 preventschitin-triggered immunity in plants. Science , 2010, 329, 953-955; Iizasa etal. , 2010 Iizasa, E. , Mitsutomi, M. , and Nagano, Y. Direct binding of a plantLysM receptor-like kinase, LysM RLKI/CERKI, to chitin in vitro. J Biol Chem.,2010，285，2996-3004)。近年研究發(fā)現(xiàn)植物蛋白的LysM結(jié)構(gòu)域還可識(shí)別結(jié)合其他PAMP成分(如細(xì)菌肽聚糖)。水稻(Oryza sativa L.)是極為重要的糧食作物，也是重要的單子葉模式植物，細(xì)菌與真菌導(dǎo)致的病害嚴(yán)重制約水稻的產(chǎn)量，因此研究水稻與病原菌的相互作用及水稻感應(yīng)病原菌入侵的機(jī)理，對(duì)于水稻功能基因組學(xué)及水稻育種都具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種水稻抗病基因及其應(yīng)用。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供一種抗病水稻的培育方法。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是
基因位于6號(hào)染色體上，基因座位號(hào)為L0C_0s06gl0660 (MSU登陸號(hào))，對(duì)應(yīng)的RAP登陸號(hào)為0s06g0208800。其全長基因組序列約為3189bp，包括5個(gè)外顯子，4個(gè)內(nèi)含子。其cDNA全長1230bp，編碼409個(gè)氨基酸。編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO :3所示,存在有LysM (Lysin motif)結(jié)構(gòu)域。
一種培育抗病水稻品種的方法，包括將水稻抗病基因0sLYP6或其cDNA轉(zhuǎn)入水稻基因組中，并使其過表達(dá)；或?qū)⑺究共』?sLYP6或其cDNA轉(zhuǎn)入載體中，使用載體轉(zhuǎn)染水稻細(xì)胞，并使水稻抗病基因0sLYP6或其cDNA過表達(dá)。本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明方法利用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)從水稻中克隆到了一個(gè)含lysin motif (LysM)結(jié)構(gòu)域蛋白的基因0sLYP6,證實(shí)0sLYP6參與了水稻對(duì)病原菌及真菌的防御反應(yīng)，是一種重要的參與水稻天然免疫反應(yīng)的抗病基因。本發(fā)明方法利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，獲得的RNA干涉及過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻，發(fā)現(xiàn)0sLYP6基因的功能缺失可導(dǎo)致水稻對(duì)致病菌(水稻白葉枯病菌Obo-gcM)、細(xì)菌性條斑病菌Obc-gdlV)、水稻稻瘟病株i/Z-A)抵抗力的下降，而AsZ7/ 過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻則表現(xiàn)出明顯抗性。


圖I是0sLYP6基因?qū)Φ景兹~枯病抗性的影響 圖2是0sLYP6基因?qū)?xì)菌性條斑病菌Obc-gdlV)抗性的影響 圖3是0sLYP6基因?qū)λ镜疚敛≈阨/Z-A抗性的影響圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合試驗(yàn)，進(jìn)一步說明本發(fā)明。培養(yǎng)基和營養(yǎng)液
LB培養(yǎng)基*
10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl，調(diào)節(jié)pH至7.0，定溶至I L，在I. 034X IO5Pa高壓下蒸氣滅菌20 min，加入I. 5%的瓊脂粉即為LB固體培養(yǎng)基，室溫保存。培養(yǎng)基
5 g蛋白胨,1 g酵母提取物，5 g牛肉浸膏，5 g鹿糖,0.24 g無水硫酸鎂,調(diào)節(jié)pH至7. 0，加入去離子水至總體積為I L，加I. 5%的瓊脂粉可制成固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基
含有 NH4NO3 (1650 mg/L), KNO3 (1900 mg/L), CaCl2 2H20 (440 mg/L), MgSO4 7H20(370 mg/L), KH2PO4 (170 mg/L), KI (0. 83 mg/L), H3BO3 (6. 2 mg/L), MnSO4 4H20 (22. 3mg/L), ZnSO4 7H20 (8. 6 mg/L), Na2MoO4 2H20 (0. 25 mg/L), CuSO4 5H20 (0. 025 mg/L),CoCl2 6H20 (0. 025 mg/L), Na2EDTA 2H20 (37. 3 mg/L), FeSO4 7H20 (27. 8 mg/L)，肌醇(100 mg/L)，煙酸(0. 5 mg/L),鹽酸批卩多辛(0. 5 mg/L),鹽酸硫胺素(0. I mg/L),甘氨酸(2mg/L)，蔗糖(30%)，用NaOH調(diào)pH至5. 8，加入組培用瓊脂粉(8 g/L)即可制成固體MS培養(yǎng)基。1/2 MS培養(yǎng)基除蔗糖含量不減半外，其余成分均為原來的一半?！痵營養(yǎng)液
四水硝酸韓945 mg,硝酸鉀506 mg,硝酸銨80 mg,磷酸二氫鉀136 mg,硫酸鎂493 mg,鐵鹽溶液2. 5 mL，微量元素液5 mL，溶于800 mL水中，調(diào)節(jié)pH至6. 0后定容至I L。
權(quán)利要求
1.水稻抗病基因OsLYP6，全長3189bp，其序列如SEQID N0:1所示。
2.水稻抗病基因OsLYP6的cDNA，全長1230bp，編碼409個(gè)氨基酸，其序列如SEQ IDNO 2所示。
3.水稻抗病基因OsLYP6編碼蛋白，其序列如SEQID NO:3所示。
4.水稻抗病基因OsLYP6或其cDNA在培育抗病水稻中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于抗病水稻為抗水稻白葉枯病、水稻細(xì)條病、水稻真菌稻瘟病水稻中的至少一種。
6.一種培育抗病水稻品種的方法，包括將水稻抗病基因OsLYP6或其cDNA轉(zhuǎn)入水稻基因組中，并使其過表達(dá)；或?qū)⑺究共』騉sLYP6或其cDNA轉(zhuǎn)入載體中，使用載體轉(zhuǎn)染水稻細(xì)胞，并使水稻抗病基因OsLYP6或其cDNA過表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明公開了水稻抗病基因OsLYP6及其應(yīng)用。OsLYP6基因位于6號(hào)染色體上，基因座位號(hào)為LOC_Os06g10660(MSU登陸號(hào))，對(duì)應(yīng)的RAP登陸號(hào)為Os06g0208800。其全長基因組序列約為3189bp，包括5個(gè)外顯子，4個(gè)內(nèi)含子。其cDNA全長1230bp，編碼409個(gè)氨基酸。OsLYP6編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQIDNO3所示，存在有LysM(Lysinmotif)結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明方法利用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)從水稻中克隆到了一個(gè)含LysM結(jié)構(gòu)域蛋白的基因OsLYP6，證實(shí)OsLYP6參與了水稻對(duì)病原菌及真菌的防御反應(yīng)，是一種重要的參與水稻天然免疫反應(yīng)的抗病基因。該基因有望應(yīng)用于水稻抗病品種的培育。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102747089SQ20121022623
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月2日
發(fā)明者劉兵, 敖英, 王宏斌, 王金發(fā) 申請(qǐng)人:中山大學(xué)