專利名稱：一種發(fā)根農(nóng)桿菌介導真空滲透輔助的大豆遺傳轉化方法
技術領域：
本發(fā)明屬分子生物學與基因工程技術領域，具體涉及利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導真空滲透輔助大豆遺傳轉化的方法及其應用。
背景技術：
大豆是重要的糧食作物和經(jīng)濟作物，但受各種病、蟲害 及各種非生物逆境的影響，大豆的品質和產(chǎn)量難以滿足人們的需求。大豆胞囊線蟲病(soybean cyst nematode,簡稱SCN)，是由大豆胞囊線蟲侵染引起的，是危害世界大豆生產(chǎn)最嚴重的病害之一，其特點是分布廣、危害重、寄主范圍廣、傳播途徑多、休眠體(胞囊)存活時間長，是一種極難防治的土傳病害。在我國東北和黃、淮、海大豆產(chǎn)區(qū)發(fā)生較普遍，一般可使大豆減產(chǎn)5% -10%，嚴重的可達30%以上，甚至絕產(chǎn)(劉維志，2000)。在生產(chǎn)上，目前對大豆胞囊線蟲的防治主要是使用化學農(nóng)藥，但是這種單純的使用化學防治會引發(fā)土壤微生物區(qū)系紊亂、使線蟲的抗藥性增強，因此使人們越來越關注化學農(nóng)藥的殘留和對環(huán)境污染的問題。近年來，現(xiàn)代分子生物學的技術在對植物病蟲害的防治中展現(xiàn)出了很好的發(fā)展前景。利用基因工程的方法對大豆進行抗病蟲品種的培育是非常有必要的，同時對大豆遺傳轉化的條件進行進一步的優(yōu)化也有利于遺傳轉化效率的提高，意義重大。Bt基因是最早應用于抗蟲基因工程的抗蟲基因。蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis,簡稱Bt)是一種分布極其廣泛的革蘭氏陽性細菌,在芽孢形成的過程中可以形成伴胞晶體，此晶體具有殺線蟲的作用，是目前世界上應用最為廣泛的生物殺蟲劑。1990年，Perlak等(1990)獲得了轉Bt基因的棉花。在此之后，轉基因抗蟲水稻也相繼獲得成功。Stewart等(1996)將合成的Bt基因利用基因槍轟擊的方法來轟擊懸浮培養(yǎng)體細胞胚，獲得轉基因大豆株系。后期，人們開始嘗試用具有非競爭性結合關系的復合Bt基因或用Bt基因與其它抗蟲基因構建的復合殺蟲基因載體來轉化大豆，得到相應的轉基因植株?；蚬こ痰姆椒軌蚴刮覀儗⒂幸婺康幕蚨ㄏ虻剞D移到農(nóng)作物中，使農(nóng)作物達到提高抗性和改良品質的目的。但是相對于水稻、煙草等作物來說，大豆的高效遺傳轉化一直是植物基因工程領域的難點之一，自Hinchee等(1988)和McCabe等(1988)分別用兩種方法轉化大豆成功得到轉基因植株以來，雖然也相繼有關于此方面的報告，但是突破性的進展卻很少見到報告。具體來說最重要的一點就是轉化效率沒有顯著提高。盡管目前轉基因大豆已在全球大面積種植，但其遺傳轉化仍局限于根癌農(nóng)桿菌介導的子葉節(jié)轉化系統(tǒng)、基因槍介導的體細胞胚轉化系統(tǒng)、胚懸浮培養(yǎng)轉化系統(tǒng)等方法。這些轉化系統(tǒng)普遍存在嵌合體頻率高、受基因型限制、轉化系統(tǒng)穩(wěn)定性較差等問題，限制了轉基因材料的批量創(chuàng)制和候選基因育種應用價值的快速評價。目前應用較為廣泛的是根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)和發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)兩種。它們的寄主非常廣泛,且為革蘭氏陰性菌；在普通情況下，能通過原有的或后天制造的傷口來感染植物細胞，且分別能夠形成冠癭瘤和生出毛狀根。
根癌農(nóng)桿菌中含有Ti質粒(Tumor-inducing plasmid),它與腫瘤誘導有關。這種Ti質粒可以使T-DNA轉移到植物的細胞中并整合進植物的基因組中得以表達，從而導致冠癭瘤的發(fā)生，而且這些整合進植物基因組的T-DNA片段又可以通過減數(shù)分裂的方式傳遞給子代(賈士榮等，1994)。發(fā)根農(nóng)桿菌與根癌農(nóng)桿菌不同的是它含有Ri質粒，該質粒上包括能夠使發(fā)根瘤自主生長并且使冠癭堿合成的基因。含有Ri質粒的T-DNA通過傷口侵入植物的莖基部，使不定根和側根大量發(fā)生，進而使目的基因整合入植物的基因組中，從而穩(wěn)定表達，出現(xiàn)毛狀根(Chilton et al,1982)。與根癌農(nóng)桿菌相比,發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質粒誘導形成的毛狀根，生長速度快，生長條件可以人為控制且遺傳上穩(wěn)定，因而可以作為研究作物根部寄生的病蟲害病理的良好材料，毛狀根系統(tǒng)在研究與根系相關的理論 中也是理想的實驗系統(tǒng)。因此，自從Ri質粒被人們發(fā)現(xiàn)并認識以來，發(fā)根農(nóng)桿菌現(xiàn)已被廣泛應用于植物基因工程、植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)、植物品種改良和植物栽培等領域，為人類生產(chǎn)作出了巨大貢獻，具有極其重要的研究價值和廣闊的應用前景(杜曼等，2005)。Ackermann(1973)首次利用發(fā)根農(nóng)桿菌進行高等植物的轉化，并獲得了成功。發(fā)根農(nóng)桿菌轉化植物產(chǎn)生毛狀根的方法很多，大體包括直接接種法、外植體共培養(yǎng)法和原生質體共培養(yǎng)法。直接接種法，將植物種子消毒后萌發(fā)長出無菌植株，在莖葉上劃出傷口，將發(fā)根農(nóng)桿菌通過注射或涂抹的方法直接接種在無菌植株傷口處，繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后，在植株接種部位誘導產(chǎn)生毛狀根(王關林等，2002 ;王秀榮等，2009 ;張艷馥等，1997 ；)。該方法最簡便，王莉等(2002)將菌液直接向何首烏無菌苗的莖桿、葉、葉柄處多次注射誘導得到毛狀根。Van de Velde等(2003)和Rodriguez-Llorente等(2003)用新鮮菌液分別直接注射接種田菁和截型苜蓿無菌幼苗下胚軸，誘導出相應的毛狀根。向太和等(2011)利用農(nóng)桿菌直接侵染刺傷的黃瓜子葉節(jié)下方誘導形成毛狀根，建立了一種植物根系相關功能基因研究模型的構建方法。涂抹法常用于毛狀根無菌條件下的誘導，Boisson-Dernier等(2001)和Uhde-Stone等(2005)將萌發(fā)的截型苜蓿和豌豆的種子切除3mm的胚根，切口用發(fā)根農(nóng)桿菌菌斑涂抹侵染得到相應的“復合植株”。在大豆的遺傳轉化研究中，Kereszt (2007)利用菌液直接針刺接種生長在基質中的大豆幼苗的下胚軸，得到了大豆的“復合植株”。王秀榮等(2009)首次將發(fā)根農(nóng)桿菌介導的下胚軸涂抹轉化方法應用于大豆，成功地進行了大豆根部毛狀根轉化。劉艷菊(2010)和王敏娟等(2011)利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導的子葉節(jié)轉化體系，分別向大豆根系導入Bt基因和GmNHXl基因進行了大豆抗蠐螬和耐鹽性的研究。盡管目前尚不能利用該系統(tǒng)獲得可遺傳的大豆轉基因植株，但可批量獲得轉基因發(fā)狀根和復合體轉基因植株，用于基因功能的快速驗證，評價其在大豆育種中的利用價值。自Bechtold等(1993)建立了整株原位真空滲入遺傳轉化方法后，該方法作為農(nóng)桿菌介導遺傳轉化的一種輔助手段，在擬南芥、白菜、油菜等的遺傳轉化中應用廣泛(Tjokrokusumo et al, 2000 ;曹傳增等，2003 ;張燕紅等，2008)。趙東利等(2002)在轉化苦豆子時發(fā)現(xiàn)，采用真空滲透方法可有效提高發(fā)根農(nóng)桿菌對苦豆子的轉化頻率。在大豆的遺傳轉化研究中，武天龍等(2002)采用發(fā)根農(nóng)桿菌分別轉化大豆腋芽分生組織區(qū)和莖尖的方式，在感染過程中采用真空滲透的方法，提高了大豆的遺傳轉化率。利用真空滲透輔助的發(fā)根農(nóng)桿菌介導的抗線蟲基因轉化的方法則尚未見報道
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有大豆遺傳轉化效率較低的難點，提供一種發(fā)根農(nóng)桿菌介導真空滲透輔助的抗線蟲基因轉化大豆的方法以及其應用。本發(fā)明公開了一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導的真空滲透輔助的抗線蟲基因轉化大豆的方法。本發(fā)明首次將發(fā)根農(nóng)桿菌介導的真空滲透輔助的轉化方法應用到大豆，并成功地進行了大豆根部毛狀根轉化。本發(fā)明先將大豆種子消毒后種植在無菌蛭石萌發(fā)，在下胚軸上端造成表皮分生細胞損傷，再進行真空條件下 發(fā)根農(nóng)桿菌侵染，進行遺傳轉化，獲得含有抗線蟲BT基因的大豆轉基因毛狀根。本發(fā)明采用發(fā)根農(nóng)桿菌介導Bt基因轉化大豆下胚軸的方式，在大豆轉化過程中輔助采用真空滲透法，在外植體上制造傷口，可充分提高農(nóng)桿菌入侵的機會，可明顯提高農(nóng)桿菌的感染效率，并有效提高大豆的轉化率。為實現(xiàn)這樣的目的，本發(fā)明的技術方案中，采用發(fā)根農(nóng)桿菌轉化大豆下胚軸的方式，在大豆轉化過程中輔助采用真空滲透法，來達到提高轉化率的效果。本發(fā)明先將大豆種子消毒后種植在無菌蛭石里萌發(fā)5d，在下胚軸上端造成表皮分生細胞損傷，再進行真空條件下發(fā)根農(nóng)桿菌侵染，進行遺傳轉化，獲得含有抗線蟲Bt基因的大豆轉基因毛狀根。本發(fā)明一種發(fā)根農(nóng)桿菌介導真空滲透輔助的大豆遺傳轉化方法，包括下列步驟I.大豆種子的基因型選用、消毒和萌發(fā)，具體包括I. I大豆種子的基因型選用“吉豆2號”，且需挑選發(fā)育飽滿無病害的；I. 2用常溫氯氣熏蒸法，其中氯氣由100ml5. 24% NaCI0+3. 5mll2mol / L HCI產(chǎn)生，置于干燥器中熏蒸14h進行滅菌；I. 3在超凈工作臺中取出無菌大豆，接于無菌濕蛭石表面下方l-2cm處，用保鮮膜封蓋;I. 4置于25°C暗培養(yǎng)室中進行誘芽的培養(yǎng)，5d后，以備進行發(fā)根農(nóng)桿菌侵染；2.含有抗線蟲Bt基因的發(fā)根農(nóng)桿菌K599菌液的制備，具體包括2. I將包含植物雙元表達載體pBI121_Bt06的發(fā)根農(nóng)桿菌K599，在固體LB平板上劃線，28°C倒置培養(yǎng)48h ;所述的包含植物雙元表達載體pBI121-Bt06的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株K599是通過常規(guī)的農(nóng)桿菌凍融法將pBI121-Bt06質粒轉入發(fā)根農(nóng)桿菌K599感受態(tài)細胞獲得。2. 2挑取單菌落于5mL液體LB培養(yǎng)基中，220rpm、28°C振蕩培養(yǎng)24h ；2. 3按I :10的比例將搖好的菌液加入到50mL液體LB培養(yǎng)基中，220rpm、28°C振蕩培養(yǎng)3-6h，使菌液0D_達到I. 3 ；2. 43000rpm離心IOmin,棄上清，沉淀重懸浮于侵染液中MSB+100 y mol/L As,PH5. 4，使其0D_稀釋至0. 5，備用；3.發(fā)根農(nóng)桿菌介導的大豆轉化，具體包括3. I在萌發(fā)的大豆種子的下胚軸的上端，用解剖刀劃傷后放至制備好的農(nóng)桿菌侵染液中，在0. 06-0. 08MPa真空壓力條件下侵染10_20min，同時以無菌水作為對照；3. 2將侵染后的大豆移至花盆中，并用滅菌的混蛭石將其覆蓋，25°C、12h光照，保持濕度在75%以上，溫室培養(yǎng)2-3周，培養(yǎng)期間每天用無菌的B&D溶液澆灌植株，其中B&D溶液是由 500 u L SolutionA, 500 u L Solution B, 500 u L Solution C, 500 u L Solution D組成，其中包含0-2mmol/L硝酸鉀作為氮源,Solution A為2mol/L 二水合氯化|丐，SolutionB 為 lmol/L 憐酸二氧鐘，Solution C 為 20mmol/L 朽1 樣酸鐵，Solution D 為 0. 5mol/L 硫酸鎂、0. 5mol/L硫酸鉀、2mmol/L硫酸猛、4mmol/L硼酸、lmmol/L硫酸鋅、4mmol/L硫酸銅、0. 2mmol/L 硫酸鈷、0. 2mmol/L 鑰酸鈉；3. 3當根長到5-lOcm時，將新發(fā)出的根以下Iem處的初生根切去，并將植株移到新的花盆中，用濕蛭石復蓋后，置于溫室繼續(xù)培養(yǎng)；4.轉基因根的組織化學染色分析4. I取侵染后新發(fā)出的大豆根部和對照 的根部，分別與X-Gluc染色液混合培養(yǎng)，避光37°C放置過夜；所述的X-Gluc染色液的配方為3mg/ml X-gluc、50mM PH=7. 0的磷酸鈉緩沖溶液、IOmM EDTA、0. 5mM鐵氰化鉀、0. 5mM亞鐵氰化鉀、0. 1% TritonX_100、10 %甲醇；其中的X-gluc為5-溴-4-氯-3-吲哚-P -D-葡糖苷酸，其中的百分比為體積百分比。4. 2棄去染色液，用25%、50%、75%和100%酒精浸泡進行脫色，觀察并拍照記錄⑶S的表達情況，其中的百分比為體積百分比；5.轉基因根的PCR檢測5. I根據(jù)Kan序列對其設計引物如下上游序列5’ -TTGGGTGGAGAGGCTAITCG-3’下游序列5’ -TATCACGGGTAGCCAACGCT-3’5. 2用CTAB法提取生長旺盛的毛狀根的DNA，以DNA為模板對Kan基因進行PCR擴增，若PCR擴增出預期大小為641bp的目的條帶，與預計大小一致，測序驗證為Kan基因序列，而野生型根未能擴增出任何條帶，表明獲得的毛狀不定根為轉基因不定根。本發(fā)明首次將發(fā)根農(nóng)桿菌介導的真空滲透輔助的轉化方法應用到大豆，并成功地進行了大豆根部毛狀根轉化；本發(fā)明先將大豆種子消毒后種植在無菌蛭石萌發(fā)，在下胚軸上端造成表皮分生細胞損傷，再進行真空條件下發(fā)根農(nóng)桿菌侵染，進行遺傳轉化，獲得含有抗線蟲BT基因的大豆轉基因毛狀根。實施本發(fā)明能充分提高農(nóng)桿菌入侵的機會，可明顯提高農(nóng)桿菌的感染效率，有效提高大豆的轉化率。


圖I為發(fā)根農(nóng)桿菌侵染大豆下胚軸誘導產(chǎn)生的毛狀根照片圖2為轉基因毛狀根的⑶S組織化學染色照片圖I和圖2中T為發(fā)根農(nóng)桿菌侵染誘導產(chǎn)生的毛狀根；CK為清水對照的毛狀根圖3為轉基因毛狀根的PCR檢測照片其中1.野生型大豆；2和3.轉基因毛狀根；M. DNAMarker
具體實施例方式現(xiàn)對本發(fā)明方法的各步驟的內容作進一步詳細描述I.大豆種子的挑選、消毒和萌發(fā)挑選發(fā)育飽滿無病害的“吉豆2號”大豆種子，利用常溫氯氣熏蒸的方法滅菌(氯氣由100ml5. 24% NaCI0+3. 5mll2mol / L HCI產(chǎn)生)，置于干燥器中熏蒸14h ;在此期間準備無菌土，將草木灰和蛭石按I :1的比例混合，加入適量1/4MS液體培養(yǎng)基(不含蔗糖)至濕潤，攪拌均勻后高溫高壓滅菌(121°C，20min)，分裝于直徑為15cm的花盆中。在超凈工作臺中將無菌大豆取出，接于無菌濕蛭石表面下方l_2cm處，用保鮮膜封好，置于25°C暗培養(yǎng)室中進行誘芽的培養(yǎng)，5d后，以備進行發(fā)根農(nóng)桿菌侵染。2.含有抗線蟲Bt基因的發(fā)根農(nóng)桿菌K599菌液的制備雙元植物表達載體pBI121_Bt06由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所提供，發(fā)根農(nóng)桿菌K599由澳大利亞昆士蘭大學Dr. Gresshoff友情饋贈；包含植物雙元表達載體pBI121_Bt06的發(fā)根農(nóng)桿菌菌 株K599是通過常規(guī)的農(nóng)桿菌凍融法轉化將pBI121-Bt06質粒轉入發(fā)根農(nóng)桿菌K599感受態(tài)細胞獲得。將包含植物雙元表達載體pBI121_Bt06的發(fā)根農(nóng)桿菌K599，在固體LB平板(含Kan 50mg/L)上劃線，28 °C倒置培養(yǎng)48h ;挑取單菌落，于5mL液體LB培養(yǎng)基(含Kan50mg/L)中，220rpm、28°C振蕩培養(yǎng)24h ;按I :10的比例將搖好的菌液加入到50mL液體LB培養(yǎng)基(含Kan50mg/L)中，220rpm、28°C振蕩培養(yǎng)3_6h，使菌液0D_達到 I. 3 ;3000rpm離心 lOmin，棄上清，沉淀重懸浮于侵染液中MSB+100 u mo I/L As，pH5. 4，使其OD6tltl稀釋至0. 5，備用。3.發(fā)根農(nóng)桿菌介導的大豆轉化本發(fā)明所述發(fā)根農(nóng)桿菌介導的真空滲透輔助的抗線蟲基因轉化大豆的方法主要參考Kereszt (2007)利利用菌液直接針刺接種生長在基質中的大豆幼苗的下胚軸獲得大豆的“復合植株”和王秀榮等(2009)用發(fā)根農(nóng)桿菌介導的下胚軸涂抹轉化方法成功地進行了大豆根部毛狀根轉化，以及武天龍等(2002)采用真空滲透的方法將農(nóng)桿菌分別轉化大豆腋芽分生組織區(qū)和莖尖的方式獲得轉基因植株。具體步驟如下(I)在萌發(fā)的大豆種子的下胚軸的上端用解剖刀劃傷后放至制備好的農(nóng)桿菌侵染液中，在0. 06-0. 08MPa真空壓力條件下侵染10_20min，同時以無菌水作為對照；(2)將侵染后的大豆移至花盆中，用滅菌的混蛭石將它們幾乎完全蓋住，25°C、12h光照，保持濕度在75%以上，溫室培養(yǎng)2-3周，培養(yǎng)期間用無菌的B&D溶液(500 y LSolutionA,500 u L Solution B, 500 u L Solution C, 500 u L Solution D，含0_2mmol/L硝酸鉀作為氮源)每天澆灌植株；(3)當根長到5-lOcm時，在新發(fā)出的根以下Iem處將初生根切去，將植株移到新的
花盆中，用濕蛭石蓋好后，置于溫室繼續(xù)培養(yǎng)。通過對大豆無菌苗的下胚軸進行侵染，培養(yǎng)2-3周后，侵染位點所發(fā)出的根均無明顯的向地性，而且觀察發(fā)現(xiàn)用帶有目的片段菌液侵染的部位所發(fā)出的根要多于用無菌水侵染的植株所發(fā)出的根，侵染的外植體下胚軸基部膨大或者產(chǎn)生黃綠色疏松的愈傷組織，從組織中長出毛狀根，而對照只在基部產(chǎn)生根(圖I)，當植株新發(fā)出的根達到5-lOcm時，切去主根,繼續(xù)培養(yǎng)。4.轉基因根的組織化學染色分析取侵染后新發(fā)出的大豆根部和對照的根部，分別與X-Gluc染色液混合培養(yǎng)，避光37°C放置過夜。棄去染色液，用25%、50%、75%和100%酒精浸泡進行脫色，觀察并拍照記錄⑶S的表達情況。X-Gluc染色液的配方3mg/ml X-gluc (5_溴_4_氯_3_卩引哚-0 -D-葡糖苷酸)、50mM磷酸鈉緩沖溶液(PH=7. 0)，IOmM EDTA，0. 5mM鐵氰化鉀、0. 5mM亞鐵氰化鉀、0. I %TritonX-100,10%甲醇，其中的百分比為體積百分比。對大豆下胚軸侵染培養(yǎng)后，將主根剪掉溫室培養(yǎng)1-2個月，使新發(fā)出的根能足夠支撐整個植株生長。將毛狀根剪下，用⑶S染色液進行組織化學染色。結果發(fā)現(xiàn)，轉化后的毛狀根部有明顯的藍色，而用無菌水侵染的根部呈無色，所以可初步認為轉化成功(圖2)。5 轉基因根的PCR檢測根據(jù)Kan序列對其設計引物如下上游序列5’ -TTGGGTGGAGAGGCTAITCG-3’下游序列5’ -TATCACGGGTAGCCAACGCT-3’用CTAB法提取生長旺盛的毛狀根的DNA，以DNA為模 板對Kan基因進行PCR擴增。由結果可知，PCR擴增出的條帶約641bp (圖3)，與預計的Kan基因大小相符，測序結果也與Kan基因相一致。而同時野生型并無該條帶，因此可初步認定擴增出以上片段的毛狀根為陽性。通過步驟4和5發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明中由發(fā)根農(nóng)桿菌感染的部位所產(chǎn)生的毛狀根中，約有80%是轉化根，僅有20%是正常根。
權利要求
1. 一種發(fā)根農(nóng)桿菌介導真空滲透輔助的大豆遺傳轉化方法，其特征在于包括下列步驟 .1)大豆種子的基因型選用、消毒和萌發(fā)，具體包括 .1.1大豆種子的基因型選用“吉豆2號”，且需挑選發(fā)育飽滿無病害的；.1.2用常溫氯氣熏蒸法，其中氯氣由10011115.24%似(10+3.511111211101 / L HCI產(chǎn)生，置于干燥器中熏蒸14h進行滅菌； .1.3在超凈工作臺中取出無菌大豆，接于無菌濕蛭石表面下方l-2cm處，用保鮮膜封蓋； .1.4置于25°C暗培養(yǎng)室中進行誘芽的培養(yǎng)，5d后，以備進行發(fā)根農(nóng)桿菌侵染； .2)含有抗線蟲Bt基因的發(fā)根農(nóng)桿菌K599菌液的制備，具體包括 .2.1將包含植物雙元表達載體pBI121-Bt06的發(fā)根農(nóng)桿菌K599，在固體LB平板上劃線，28°C倒置培養(yǎng)48h ;所述的包含植物雙元表達載體pBI121-Bt06的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株K599是通過常規(guī)的農(nóng)桿菌凍融法將pBI121-Bt06質粒轉入發(fā)根農(nóng)桿菌K599感受態(tài)細胞獲得； .2. 2挑取單菌落于5mL液體LB培養(yǎng)基中，220rpm、28°C振蕩培養(yǎng)24h ； . 2. 3按I :10的比例將搖好的菌液加入到50mL液體LB培養(yǎng)基中，220rpm、28°C振蕩培養(yǎng)3-6h，使菌液OD6tltl達到1.3 ； . 2.43000rpm離心IOmin,棄上清,沉淀重懸浮于侵染液中MSB+100 μ mol/L As, pH5. 4,使其0D_稀釋至0.5，備用； .3)發(fā)根農(nóng)桿菌介導的大豆轉化，具體包括 .3.1在萌發(fā)的大豆種子的下胚軸的上端，用解剖刀劃傷后放至制備好的農(nóng)桿菌侵染液中，在O. 06-0. 08MPa真空壓力條件下侵染10_20min，同時以無菌水作為對照； .3.2將侵染后的大豆移至花盆中，并用滅菌的混蛭石將其覆蓋，25°C、12h光照，保持濕度在75%以上，溫室培養(yǎng)2-3周，培養(yǎng)期間每天用無菌的B&D溶液澆灌植株，其中B&D溶液是由 500 μ L SolutionA, 500 μ L Solution B, 500 μ L Solution C, 500 μ L Solution D 組成，其中包含0-2mmol/L硝酸鉀作為氮源，Solution A為2mol/L 二水合氯化|丐，SolutionB 為 lmol/L 憐酸二氧鐘，Solution C 為 20mmol/L 朽1 樣酸鐵，Solution D 為 0. 5mol/L 硫酸鎂、0. 5mol/L硫酸鉀、2mmol/L硫酸猛、4mmol/L硼酸、lmmol/L硫酸鋅、4mmol/L硫酸銅、.0. 2mmol/L 硫酸鈷、0. 2mmol/L 鑰酸鈉； .3.3當根長到5-lOcm時，將新發(fā)出的根以下Icm處的初生根切去，并將植株移到新的花盆中，用濕蛭石復蓋后，置于溫室繼續(xù)培養(yǎng)； .4)轉基因根的組織化學染色分析，具體包括 .4.1取侵染后新發(fā)出的大豆根部和對照的根部，分別與X-Gluc染色液混合培養(yǎng)，避光.37°C放置過夜；所述的X-Gluc染色液的配方為3mg/ml X_gluc、50mM PH=7. O的磷酸鈉緩沖溶液、IOmM EDTA、0. 5mM鐵氰化鉀、0. 5mM亞鐵氰化鉀、0. 1% TritonX_100、10 %甲醇；其中的X-gluc為5-溴-4-氯-3-吲哚- β -D-葡糖苷酸，其中的百分比為體積百分比； .4.2棄去染色液，用25%、50%、75%和100%酒精浸泡進行脫色，觀察并拍照記錄⑶S的表達情況，其中的百分比為體積百分比； .5)轉基因根的PCR檢測，具體包括 .5.1根據(jù)Kan序列對其設計引物如下上游序列 5’ -TTGGGTGGAGAGGCTATTCG-3’ 下游序列 5’-TATCACGGGTAGCCAACGCT-3’ ； .5.2用CTAB法提取生長旺盛的毛狀根的DNA，以DNA為模板對Kan基因進行PCR擴增，若PCR擴增出預期大小為641bp的目的條帶，與預計大小一致，測序驗證為Kan基因序列，而野生型根未能擴增出任何條帶，表明獲得的毛狀不定根為轉基因不定根。
2.按權利要求I所述的發(fā)根農(nóng)桿菌介導真空滲透輔助的大豆遺傳轉化方法，其特征在于步驟2. I所述的包含植物雙元表達載體pBI121-Bt06的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株K599是通過常規(guī)的農(nóng)桿菌凍融法將pBI121-Bt06質粒轉入發(fā)根農(nóng)桿菌K599感受態(tài)細胞獲得。
3.按權利要求I所述的發(fā)根農(nóng)桿菌介導真空滲透輔助的大豆遺傳轉化方法，其特征在于步驟4. I所述的X-Gluc染色液的配方為3mg/ml X_gluc、50mM PH=7. O的磷酸鈉緩沖溶液、IOmM EDTA、0. 5mM鐵氰化鉀、O. 5mM亞鐵氰化鉀、O. 1% TritonX-100、10%甲醇；其中的X-gluc為5-溴-4-氯-3-吲哚- β -D-葡糖苷酸，其中的百分比為體積百分比。
全文摘要
一種發(fā)根農(nóng)桿菌介導真空滲透輔助的大豆遺傳轉化方法屬分子生物學與基因工程技術領域，本發(fā)明包括的步驟大豆種子基因型選用、消毒和萌發(fā)；含有抗線蟲Bt基因的發(fā)根農(nóng)桿菌K599菌液制備；發(fā)根農(nóng)桿菌介導的大豆轉化；轉基因根的組織化學染色分析；轉基因根的PCR檢測。本發(fā)明首次將發(fā)根農(nóng)桿菌介導的真空滲透輔助轉化方法應用到大豆，并成功進行了大豆根部毛狀根轉化；本發(fā)明先將大豆種子消毒后種植在無菌蛭石萌發(fā)，在下胚軸上端造成表皮分生細胞損傷，再進行真空條件下發(fā)根農(nóng)桿菌侵染，進行遺傳轉化，獲得含有抗線蟲BT基因的大豆轉基因毛狀根，實施本發(fā)明能充分提高農(nóng)桿菌入侵的機會，可明顯提高農(nóng)桿菌的感染效率，有效提高大豆的轉化率。
文檔編號A01H5/00GK102766650SQ20121022763
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月3日 優(yōu)先權日2012年7月3日
發(fā)明者馮頔, 劉金亮, 張世宏, 潘洪玉, 謝麗霞, 賈保磊, 魏毅 申請人:吉林大學