專利名稱：一種甘草北蟲草的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種北蟲草的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
北冬蟲夏草([Cordyceps militarise (L. ) Link])是蟲寄生嗜低溫真菌,是一種天然滋補(bǔ)品和藥食同源的中藥材，含有蟲草多糖、蟲草素、核苷類物質(zhì)、麥角留醇、蟲草酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、S0D、多種微量元素及類胡蘿卜素等活性成分，具有補(bǔ)肺益腎、止血化痰的功效，用于久咳虛喘、勞嗽咳血、陽(yáng)痿遺精、腰膝酸痛。味甘性溫、藥性平和、溫而不燥、補(bǔ)而不滯，是唯一的一種能同時(shí)平衡、調(diào)節(jié)陰陽(yáng)的中藥，比其他種類的補(bǔ)益中藥更具廣泛的藥用價(jià)值，且無(wú)任何不良反應(yīng)。甘草能補(bǔ)脾益氣，滋咳潤(rùn)肺，緩急解毒，調(diào)和諸藥。甘草、北
蟲草常在治療慢性支氣管炎、眩暈癥、低血壓、鼻炎、感冒、久咳不愈及貧血等藥方中配伍應(yīng)用。中醫(yī)臨床上常將北蟲草與各種補(bǔ)益中藥配伍使用以達(dá)到協(xié)同增效的目的，但患者在配伍使用中藥時(shí)常常因?yàn)榉昧看?，服用不便為由中斷使用藥物。因此?jiǎn)化中醫(yī)配伍用藥，提高北蟲草的利用率是必須解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種甘草北蟲草的培養(yǎng)方法；目的是為了簡(jiǎn)化中醫(yī)配伍用藥，提高北蟲草的利用率，增強(qiáng)北蟲草的療效，減少用藥量。甘草北蟲草的培養(yǎng)方法，按以下步驟進(jìn)行一、將北蟲草菌株玉豐二號(hào)接種到PDA固體培養(yǎng)基上，在28°C生化培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)5d，得到活化的菌種；二、將活化好的菌種切成IcmX Icm的菌塊接種到300ml的液體種子培養(yǎng)基中，靜止培養(yǎng)24h后置于溫度為23°C、120r/min的條件下暗培養(yǎng)6d，得到菌懸液，然后加入200ml無(wú)菌水，得液體菌種；三、取5ml液體菌種接種到裝有甘草固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于溫度為22°C、濕度為55% 60%的條件下暗培養(yǎng)10 14d，得菌絲體，然后移至光下并在溫度為23°C、濕度為55% 60%、光照強(qiáng)度為180 2201x、每天光照10 12h、晝夜溫差為10°C的條件下培養(yǎng)至菌絲體全部由白色轉(zhuǎn)為黃色后，增加濕度到85% 95%，繼續(xù)培養(yǎng)至子實(shí)體長(zhǎng)到2cm高，將培養(yǎng)瓶上的通氣開關(guān)打開，繼續(xù)培養(yǎng)至子實(shí)體生長(zhǎng)到4 8cm高、子實(shí)體表面出現(xiàn)黃色粉末狀物質(zhì)且頂端出現(xiàn)小刺，進(jìn)行采收，即完成甘草北蟲草的培養(yǎng)；其中步驟三中甘草固體培養(yǎng)基由40g的大米、O. I O. 6g的甘草粉末和60ml的營(yíng)養(yǎng)液組成，培養(yǎng)瓶的瓶裝量為1/4 1/3 ;所述甘草粉末的制備將甘草粉碎后過(guò)20目篩；所述營(yíng)養(yǎng)液每L由20g的蛋白胨、20g的葡萄糖、Ig的ΚΗ2Ρ04、0· 5g的MgSO4 · 7Η20、0· 5g的硫酸鋅、200g的土豆液、5mg的維生素B1和余量的水組成；所述土豆液的制備200g去皮馬鈴薯，切塊煮沸30min，紗布過(guò)濾后補(bǔ)足至1000ml，pH自然，121°C高壓滅菌30min。本發(fā)明在北蟲草的培養(yǎng)基中添加甘草，并對(duì)比例進(jìn)行優(yōu)選，對(duì)北蟲草生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用。然后，用HPLC法測(cè)定北蟲草中的活性成分，能較好的提高其質(zhì)量；同時(shí)用HPLC法測(cè)定北蟲草中是否轉(zhuǎn)入甘草的活性成分，培育出富含甘草活性成分的北蟲草，達(dá)到增強(qiáng)北蟲草藥用功能的目的，減少用藥量。本發(fā)明甘草北蟲草的培養(yǎng)方法，根據(jù)中醫(yī)配伍理論，在北蟲草的培養(yǎng)基中添加甘草，在北蟲草的生長(zhǎng)過(guò)程中轉(zhuǎn)入甘草的活性成分，以減少服用量，增強(qiáng)北蟲草的藥用價(jià)值。本發(fā)明培養(yǎng)的甘草北蟲草，能大幅度提高北蟲草子實(shí)體蟲草素和腺苷含量，蟲草素可達(dá)4. 6732±0. 0204mg/g,腺苷可達(dá)I. 2326±0. 0013mg/g，商品價(jià)值很高；并且本發(fā)明培養(yǎng)的甘草北蟲草中甘草苷的含量達(dá)O. 1703±0. 0085mg/g,從而起到將甘草有效成分轉(zhuǎn)移至北蟲草子實(shí)體中的目的，提高北蟲草的利用率，增強(qiáng)北蟲草的療效，簡(jiǎn)化了中醫(yī)學(xué)中北蟲草與甘草配伍的方法，并提高了北蟲草的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值；另外，實(shí)施條件容易達(dá)到，能在全行業(yè)推廣。


圖I為具體實(shí)施方式
一中對(duì)照品的HPLC色譜圖，其中曲線I表示甘草苷；圖2為具體實(shí)施方式
一中甘草培養(yǎng)基培養(yǎng)的北冬蟲夏草子實(shí)體的HPLC色譜圖，其中曲線I表示甘草苷；圖3為具體實(shí)施方式
一中加入對(duì)照品后北冬蟲夏草子實(shí)體的HPLC色譜圖，其中曲線I表示甘草苷；圖4為具體實(shí)施方式
一中空白對(duì)照組北冬蟲夏草子實(shí)體的HPLC色譜圖。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式甘草北蟲草的培養(yǎng)方法，按以下步驟進(jìn)行一、將北蟲草菌株玉豐二號(hào)接種到PDA固體培養(yǎng)基上，在28°C生化培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)5d，得到活化的菌種；二、將活化好的菌種切成IcmX Icm的菌塊接種到300ml的液體種子培養(yǎng)基中，靜止培養(yǎng)24h后置于溫度為23°C、120r/min的條件下暗培養(yǎng)6d，得到菌懸液，然后加入200ml無(wú)菌水，得液體菌種；三、取5ml液體菌種接種到裝有甘草固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于溫度為22°C、濕度為55% 60%的條件下暗培養(yǎng)10 14d，得菌絲體，然后移至光下并在溫度為23°C、濕度為55% 60%、光照強(qiáng)度為180 2201x、每天光照10 12h、晝夜溫差為10°C的條件下培養(yǎng)至菌絲體全部由白色轉(zhuǎn)為黃色后，增加濕度到85% 95%，繼續(xù)培養(yǎng)至子實(shí)體長(zhǎng)到2cm高，將培養(yǎng)瓶上的通氣開關(guān)打開，繼續(xù)培養(yǎng)至子實(shí)體生長(zhǎng)到4 8cm高、子實(shí)體表面出現(xiàn)黃色粉末狀物質(zhì)且頂端出現(xiàn)小刺，進(jìn)行采收，即完成甘草北蟲草的培養(yǎng)；其中步驟三中甘草固體培養(yǎng)基由40g的大米、O. I O. 6g的甘草粉末和60ml的營(yíng)養(yǎng)液組成，培養(yǎng)瓶的瓶裝量為1/4 1/3 ;所述甘草粉末的制備將甘草粉碎后過(guò)20目篩；所述營(yíng)養(yǎng)液每L由20g的蛋白胨、20g的葡萄糖、Ig的ΚΗ2Ρ04、0· 5g的MgSO4 · 7Η20、0· 5g的硫酸鋅、200g的土豆液、5mg的維生素B1和余量的水組成；所述土豆液的制備200g去皮馬鈴薯，切塊煮沸30min，紗布過(guò)濾后補(bǔ)足至1000ml，pH自然，121°C高壓滅菌30min。本實(shí)施方式的步驟一是在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌操作。本實(shí)施方式步驟一中北蟲草菌株玉豐二號(hào)，購(gòu)買自哈爾濱玉豐菌業(yè)有限責(zé)任公司。本實(shí)施方式步驟二中每300ml液體種子培養(yǎng)基中接種I個(gè)菌塊。、
本實(shí)施方式步驟三中暗培養(yǎng)10 14d的過(guò)程中，菌絲體長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基的表面并吃透培養(yǎng)基；且接種后前I周不通風(fēng)，以后每天通風(fēng)換氣I 2次。本實(shí)施方式步驟三中移至光下的培養(yǎng)過(guò)程中，如子實(shí)體向一邊倒，則調(diào)整光源方向，或每間隔3天轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基方向，以便采光均勻，保證子實(shí)體生長(zhǎng)到4 8cm高。本實(shí)施方式步驟三中采收后，將北蟲草置于45°C下烘干至恒重。采收的過(guò)程去掉培養(yǎng)瓶的蓋，用無(wú)菌鑷子將子座連同培養(yǎng)基一同取出，再?gòu)淖幼考魯?，整理平直，備用。I、甘草對(duì)北蟲草子實(shí)體干重的影響將從甘草固體培養(yǎng)基和空白培養(yǎng)基培養(yǎng)上采收的北冬蟲夏草子實(shí)體整理干凈，用濾紙吸干表面水分，于45°C條件烘干至恒重，冷卻，分析天平稱重得干重，并確定促進(jìn)子實(shí)體生長(zhǎng)的最適濃度，結(jié)果見表I。表I甘草固體培養(yǎng)基中子實(shí)體干重
權(quán)利要求
1.一種甘草北蟲草的培養(yǎng)方法，其特征在于甘草北蟲草的培養(yǎng)方法，按以下步驟進(jìn)行一、將北蟲草菌株玉豐二號(hào)接種到PDA固體培養(yǎng)基上，在28°C生化培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)5d，得到活化的菌種；二、將活化好的菌種切成IcmXlcm的菌塊接種到300ml的液體種子培養(yǎng)基中，靜止培養(yǎng)24h后置于溫度為23°C、120r/min的條件下暗培養(yǎng)6d，得到菌懸液，然后加入200ml無(wú)菌水，得液體菌種；三、取5ml液體菌種接種到裝有甘草固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于溫度為22°C、濕度為55% 60%的條件下暗培養(yǎng)10 14d，得菌絲體，然后移至光下并在溫度為23°C、濕度為55% 60%、光照強(qiáng)度為180 2201x、每天光照10 12h、晝夜溫差為10°C的條件下培養(yǎng)至菌絲體全部由白色轉(zhuǎn)為黃色后，增加濕度到85% 95%，繼續(xù)培養(yǎng)至子實(shí)體長(zhǎng)到2cm高，將培養(yǎng)瓶上的通氣開關(guān)打開，繼續(xù)培養(yǎng)至子實(shí)體生長(zhǎng)到4 8cm高、子實(shí)體表面出現(xiàn)黃色粉末狀物質(zhì)且頂端出現(xiàn)小刺，進(jìn)行采收，即完成甘草北蟲草的培養(yǎng)； 其中步驟三中甘草固體培養(yǎng)基由40g的大米、0. I 0. 6g的甘草粉末和60ml的營(yíng)養(yǎng)液組成，培養(yǎng)瓶的瓶裝量為1/4 1/3 ;所述甘草粉末的制備將甘草粉碎后過(guò)20目篩；所述營(yíng)養(yǎng)液每L由20g的蛋白胨、20g的葡萄糖、Ig的KH2P04、0. 5g的MgSO4 7H20、0. 5g的硫酸鋅、200g的土豆液、5mg的維生素B1和余量的水組成；所述土豆液的制備200g去皮馬鈴薯，切塊煮沸30min,紗布過(guò)濾后補(bǔ)足至1000ml, pH自然，121°C高壓滅菌30min。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種甘草北蟲草的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟一中PDA固體培養(yǎng)基由200g的土豆液、20g的葡萄糖、18g的瓊脂和IOOOml的水組成,pH自然；所述土豆液的制備200g去皮馬鈴薯，切塊煮沸30min，紗布過(guò)濾后補(bǔ)足至1000ml，pH自然，121°C高壓滅菌30min。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種甘草北蟲草的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟二中液體種子培養(yǎng)基每L由200g的土豆液、20g的葡萄糖、Ig的硫酸鎂、Ig磷酸二氫鉀和余量的水組成，pH自然；所述土豆液的制備200g去皮馬鈴薯,切塊煮沸30min,紗布過(guò)濾后補(bǔ)足至1000ml, pH 自然，121°C高壓滅菌 30min。
全文摘要
一種甘草北蟲草的培養(yǎng)方法，它涉及一種北蟲草的培養(yǎng)方法。它簡(jiǎn)化中醫(yī)配伍用藥，提高北蟲草的利用率，增強(qiáng)北蟲草的療效，減少用藥量。方法一、活化菌種；二、制備液體菌種；三、液體菌種接種到甘草固體培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)，得菌絲體，然后然后移至光下培養(yǎng)至子實(shí)體長(zhǎng)到2cm高，通氣后繼續(xù)培養(yǎng)至子實(shí)體生長(zhǎng)到4～8cm高、子實(shí)體表面出現(xiàn)黃色粉末狀物質(zhì)且頂端出現(xiàn)小刺，進(jìn)行采收即完成。本發(fā)明將甘草有效成分轉(zhuǎn)移至北蟲草子實(shí)體中的目的，提高北蟲草的利用率，增強(qiáng)北蟲草的療效，簡(jiǎn)化了中醫(yī)學(xué)中北蟲草與甘草配伍的方法，并提高了北蟲草的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值；另外，實(shí)施條件容易達(dá)到，能在全行業(yè)推廣。
文檔編號(hào)A01G1/04GK102696402SQ201210227670
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月4日
發(fā)明者吳優(yōu), 楊鵬, 鄭春英 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)