制備癲癇發(fā)作動(dòng)物模型的方法【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種制備癲癇發(fā)作動(dòng)物模型的方法，該方法包括采用立體定向技術(shù)向靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的海馬施用海人酸。本發(fā)明制備的癲癇模型的優(yōu)點(diǎn)在于：1、采用局部注射給藥，劑量??；2、致癇劑量與動(dòng)物性別、年齡先關(guān)不大；3、可重復(fù)性好；4、致癇過(guò)程清晰；5、藥物安全性好?！緦?zhuān)利說(shuō)明】制備癲癇發(fā)作動(dòng)物模型的方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及一種制備癲癇發(fā)作動(dòng)物模型的方法以及使用該方法制備的癲癇發(fā)作動(dòng)物模型。具體地，本發(fā)明涉及一種通過(guò)向靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的海馬微量注射海人酸來(lái)制備癲癇發(fā)作動(dòng)物模型的方法，以及通過(guò)該方法制備的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物癲癇發(fā)作模型?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]癲癇發(fā)作是大腦神經(jīng)元異常放電引起的癲癇發(fā)作性腦功能異常。發(fā)作大多短暫并且有自限性，由于異常放電的腦功能區(qū)不同，臨床可有多種發(fā)作表現(xiàn)，包括部分性發(fā)作或全面性發(fā)作，具體表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)異常，或是行為認(rèn)知、植物神經(jīng)功能障礙。全面性發(fā)作和復(fù)雜部分性發(fā)作，往往伴有不同程度的意識(shí)障礙。[0003]癲癇是神經(jīng)元的過(guò)渡同步異常放電，其發(fā)生機(jī)制主要是由于腦內(nèi)興奮性氨基酸與抑制性氨基酸的失衡引起，即一方面腦內(nèi)興奮性機(jī)制增強(qiáng)，一方面抑制性減弱。前者通過(guò)腦內(nèi)興奮性氨基酸介導(dǎo)，主要是谷氨酸和天冬氨酸，它們通過(guò)與神經(jīng)元上的谷氨酸受體結(jié)合，介導(dǎo)G蛋白耦聯(lián)的離子通道，獲者與興奮性氨基酸受體(N-甲基-D-天門(mén)冬氨酸鹽受體)結(jié)合，導(dǎo)致大量鈣離子和鈉離子內(nèi)流，而鉀離子、鎂離子則外流，產(chǎn)生去極化。后者通過(guò)抑制性氨基酸Y-氨基丁酸(GABA)介導(dǎo)，GABA釋放出來(lái)與其受體結(jié)合后，氯離子通道打開(kāi)，氯離子內(nèi)流使突觸后膜超極化。[0004]目前的癲癇動(dòng)物模型按照發(fā)作表現(xiàn)分為:急性單純部分性發(fā)作，慢性單純性部分性發(fā)作，復(fù)發(fā)部分性發(fā)作，全面強(qiáng)直陣攣發(fā)作，失神發(fā)作，癲癇持續(xù)狀態(tài)，難治性癲癇；按照發(fā)生機(jī)制分為:遺傳性癲癇，癲癇免疫模型，外傷性癲癇模型，皮質(zhì)發(fā)育障礙動(dòng)物模型；按照制備方法分為:化學(xué)藥物模型，金屬植入，電刺激等。難治性癲癇的病因和發(fā)作機(jī)制復(fù)雜，發(fā)作無(wú)預(yù)見(jiàn)性，發(fā)作程度難以控制。Loscher(Loscherff.Animalmodelsofintractableepilepsy.ProgNeurobiol,1997,53:239-258.)提出的在實(shí)驗(yàn)研究中，判斷癲癇動(dòng)物模型是否適合人類(lèi)癲癇的標(biāo)準(zhǔn)有三條:①模型的生物電發(fā)放和發(fā)作形式必須與人類(lèi)癲癇一致。②如若無(wú)發(fā)作癥狀，EEG須顯示有生物電異常發(fā)放，稱(chēng)為癲癇樣放電。③抗癲癇藥不能控制其滿(mǎn)意發(fā)作。目前國(guó)際上唯一被認(rèn)可的耐藥性癲癇模型是由Loscher等建立的大鼠苯妥英鈉杏仁核電點(diǎn)燃癲癇模型，但是該模型的缺點(diǎn)是，動(dòng)物不易飼養(yǎng)，點(diǎn)燃率低，容易死亡，而且大鼠與人的種屬差異，其解剖結(jié)構(gòu)、生理功能及生化代謝與人差別較大，分子生物學(xué)研究生物可信度不高。[0005]至今國(guó)內(nèi)外研究者用海人酸作為致癇劑，已經(jīng)采用不同的給藥途徑和方式在多種動(dòng)物身上建立急性癲癇模型、慢性點(diǎn)燃模型，并廣泛用于癲癇發(fā)生機(jī)制的研究，結(jié)果表明海人酸所致癲癇與臨床顳葉癲癇發(fā)作類(lèi)型相似，具有建立過(guò)程可重復(fù)性強(qiáng)，劑量小，點(diǎn)燃率高等優(yōu)點(diǎn)，是一種較好的癲癇模型。[0006]靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物與人的親緣關(guān)系最近，國(guó)內(nèi)外至今仍無(wú)恒河猴海人酸癲癇模型的相關(guān)報(bào)道。【
發(fā)明內(nèi)容】[0007]為解決現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種制備癲癇發(fā)作動(dòng)物模型的方法。[0008]因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種制備靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物癲癇發(fā)作模型的方法，該方法包括將劑量為6.0-9.0μI的2.0μg/μI海人酸施用于靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的右側(cè)海馬來(lái)誘發(fā)癲癇發(fā)作。[0009]在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過(guò)本發(fā)明的方法制備的癲癇發(fā)作動(dòng)物模型。[0010]在本發(fā)明中，靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物包括但不限于，猴科、猩猩科(包括大猩猩、黑猩猩等)、猿類(lèi)(包括長(zhǎng)臂猿、類(lèi)人猿等)，優(yōu)選恒河猴。[0011]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，海人酸通過(guò)立體定向方法微量注射給藥。[0012]本發(fā)明選擇了與人類(lèi)親緣關(guān)系最近的恒河猴作為受試對(duì)象，初步建立恒河猴癲癇發(fā)作模型，觀察行為學(xué)及腦電圖改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組的4只恒河猴通過(guò)立體定向技術(shù)向海馬微量注射海人酸后8-12分鐘內(nèi)，均發(fā)生了由部分性發(fā)作到全面強(qiáng)直-陣亂發(fā)作即1-5級(jí)癇性發(fā)作，且用腦電圖記錄到了不同時(shí)期的癲癇放電，證實(shí)了海人酸在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中的致癇作用。本次試驗(yàn)，恒河猴經(jīng)歷了伴咀嚼的吞咽動(dòng)作及呼吸加快，并出現(xiàn)惡心嘔吐胃內(nèi)容物等自主神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，逐漸發(fā)展到單側(cè)肢體的不自主抽搐，繼而發(fā)展到雙側(cè)肢體的不自主抽搐，濕狗樣抖動(dòng)以及全身強(qiáng)直-陣攣等即部分性發(fā)作繼發(fā)全面強(qiáng)直陣攣性發(fā)作的全過(guò)程，發(fā)作形式與人類(lèi)的顳葉癲癇極為相似。[0013]腦電圖記錄采用參考電極置`Al，左側(cè)皮層電極:Fpl、F3、C3、P3、01、F7，左側(cè)海馬深部電極:Τ3，左側(cè)顳葉深部電極:Τ5右側(cè)皮層電極:Fp2、F4、C4、P4、02、F8，右側(cè)海馬深部電極:T4，右側(cè)顳葉深部電極:Τ6?；A(chǔ)腦電圖表現(xiàn):可見(jiàn)頻率3-8Ηζ，波幅為200-500uV，Θ波多見(jiàn)，以及10-14ΗΖ，波幅100-20uV，低幅快節(jié)律(圖1)。實(shí)驗(yàn)組注射海人酸后3_5分鐘，右側(cè)皮層可見(jiàn)腦電頻率增快，頻率為16-20ΗΖ，波幅為100-200uV，波形逐漸變尖(圖2)，7分鐘后波幅逐漸增高，達(dá)200-400uV，波形更尖，逐漸出現(xiàn)類(lèi)似尖波節(jié)律(圖3)。15分鐘后出現(xiàn)散發(fā)棘波，棘慢波，頻率為16-18ΗΖ，波幅為300-500uV，此時(shí)行為學(xué)無(wú)明顯變化(圖4)。30-40分鐘左右出現(xiàn)單個(gè)肢體的陣攣，此時(shí)腦電圖表現(xiàn)為右側(cè)02導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)頻率逐漸增快，波幅逐漸增高，波形變尖的低幅快節(jié)律，隨后右側(cè)顳區(qū)導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)節(jié)律性棘波，棘慢波，左側(cè)C3導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)棘波節(jié)律，隨后擴(kuò)展到全導(dǎo)(圖5-7)。此時(shí)行為學(xué)表現(xiàn)為四肢屈曲陣攣發(fā)作，2-3分鐘后逐漸恢復(fù)，腦電圖主要以慢波為主，全導(dǎo)出現(xiàn)頻率為2-4Ηζ，波幅為200-400uV的聞幅慢波(圖8)。[0014]相對(duì)于其他顳葉癲癇模型，本發(fā)明的癲癇發(fā)作動(dòng)物模型具有以下優(yōu)點(diǎn):1、采用局部注射給藥，劑量小；2、致癇劑量與動(dòng)物性別、年齡先關(guān)不大；3、可重復(fù)性好；4、致癇過(guò)程清晰；5、藥物安全性好。【專(zhuān)利附圖】【附圖說(shuō)明】[0015]圖1為恒河猴的基礎(chǔ)腦電圖。[0016]圖2為注射后5分鐘腦電圖:行為學(xué)無(wú)明顯變化。[0017]圖3為注射后7分鐘腦電圖:行為學(xué)無(wú)明顯變化。[0018]圖4為注射后30分鐘腦電圖:單個(gè)肢體陣攣。[0019]圖5為注射后31-32分鐘腦電圖:四肢陣攣。[0020]圖6為注射后31-32分鐘腦電圖:四肢強(qiáng)直、抽搐。[0021]圖7為注射后31-32分鐘腦電圖:四肢強(qiáng)直、抽搐。[0022]圖8為癲癇發(fā)作后腦電圖?！揪唧w實(shí)施方式】[0023]本發(fā)明的恒河猴癲癇模型的建立[0024]1、實(shí)驗(yàn)材料[0025]1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[0026]健康恒河猴5只，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物所，年齡3歲，體重分別為7.9kg，7.8kg，8.0kg,8.1kg，8.2kg，均單獨(dú)飼養(yǎng)于90cmX100cmX110cm猴籠中，每日飼養(yǎng)3次，輔以蔬菜、水果，室內(nèi)平均溫度(20±12.4)°C，相對(duì)濕度87.5±12.5，實(shí)驗(yàn)前均有4周的適應(yīng)時(shí)間，均進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)檢查和腦電圖檢查以排除異常者。[0027]1.2實(shí)驗(yàn)藥物[0028]海人酸:購(gòu)于Sigma公司。[0029]麻醉藥:鹽酸氯胺酮江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司規(guī)格0.lg/2ml[0030]速眠新[0031]阿托品[0032]2、主要儀器、器械[0033]中科新拓NT9200系列便攜式數(shù)字腦電圖儀[0034]20導(dǎo)聯(lián)放大器[0035]EEG記錄軟件N92OO[0036]自制猴固定架[0037]3、動(dòng)物飼養(yǎng)管理[0038]恒河猴飼養(yǎng)于北京市神經(jīng)外科研究所普通動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境并進(jìn)行驅(qū)蟲(chóng)治療，選擇健康雌性恒河猴，不銹鋼猴籠分籠飼養(yǎng)，自來(lái)水瓶裝自由飲用，每日喂飼水果。動(dòng)物掛頸牌和籠上貼標(biāo)簽作為動(dòng)物識(shí)別標(biāo)記。[0039]4實(shí)驗(yàn)方法[0040]4.1癲癇模型制作[0041]將5只恒河猴分為2組:實(shí)驗(yàn)組4只，對(duì)照組I只。[0042]4.2行為學(xué)觀察分級(jí)[0043]分別給實(shí)驗(yàn)組4只猴注射6.0μ1,7.0μl、8.0μl、9.0μl的海人酸，給對(duì)照組注射相同單位劑量生理鹽水。于猴籠中觀察恒河猴癲癇發(fā)作模型的發(fā)作表現(xiàn)形式，觀察癲癇發(fā)作的潛伏期，發(fā)作的表現(xiàn)形式，發(fā)作級(jí)別，持續(xù)時(shí)間以及發(fā)作高峰時(shí)間和發(fā)作停止時(shí)間、發(fā)作后表現(xiàn)，發(fā)作分級(jí)參照Racine的標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)驚厥程度將行為分為5級(jí)，I級(jí):頭面部抽搐，咀嚼；2級(jí):節(jié)律性點(diǎn)頭或全身驚動(dòng)；3級(jí):一側(cè)前肢陣攣；4級(jí):具有后肢站立的全身陣攣性驚厥常伴雙側(cè)前肢陣攣；5級(jí):具有站立伴跌倒或全身強(qiáng)直-陣攣發(fā)作。[0044]4.3電極安置[0045]用鹽酸氯胺酮注射液按肌肉注射0.2ml/kg,速眠新110.15ml/kg,阿托品0.5mg,分別麻醉實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的5只猴，將猴固定于立體定向頭架，脫去頭部毛發(fā)，脫脂后，開(kāi)顱放置皮層電極，左側(cè)皮層電極:Fpl、F3、C3、P3、01、F7，左側(cè)海馬深部電極:T3，左側(cè)顳葉深部電極:Τ5右側(cè)皮層電極:Fp2、F4、C4、P4、02、F8，右側(cè)海馬深部電極:T4，右側(cè)顳葉深部電極:Τ6,以Al為參考電極。[0046]4.4腦電活動(dòng)的觀察[0047]將恒河猴固定于立體定向頭架，安置好電極，基礎(chǔ)腦電圖表現(xiàn):可見(jiàn)頻率3-8ΗΖ，波幅為200-500uV，Θ波多見(jiàn)，以及10-14ΗΖ，波幅100-20uV，低幅快節(jié)律。實(shí)驗(yàn)組注射海人酸后3-5分鐘，右側(cè)皮層可見(jiàn)腦電頻率增快，頻率為16-20ΗΖ，波幅為100-200uV，波形逐漸變尖，7分鐘后波幅逐漸增高，達(dá)200-400uV，波形更尖，逐漸出現(xiàn)類(lèi)似尖波節(jié)律。15分鐘后出現(xiàn)散發(fā)棘波，棘慢波，頻率為16-18ΗΖ，波幅為300-500uV，此時(shí)行為學(xué)無(wú)明顯變化。30-40分鐘左右出現(xiàn)單個(gè)肢體的陣攣，此時(shí)腦電圖表現(xiàn)為右側(cè)02導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)頻率逐漸增快，波幅逐漸增高，波形變尖的低幅快節(jié)律，隨后右側(cè)顳區(qū)導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)節(jié)律性棘波，棘慢波，左側(cè)C3導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)棘波節(jié)律，隨后擴(kuò)展到全導(dǎo)。此時(shí)行為學(xué)表現(xiàn)為四肢屈曲陣攣發(fā)作，2-3分鐘后逐漸恢復(fù)，腦電圖主要以慢波為主，全導(dǎo)出現(xiàn)頻率為2-4Ηζ，波幅為200-400uV的高幅慢波。[0048]5、試驗(yàn)結(jié)果[0049]5.1行為學(xué)表現(xiàn)[0050]實(shí)驗(yàn)組恒河猴均發(fā)生5級(jí)癲癇發(fā)作，行為學(xué)表現(xiàn)為，向海馬內(nèi)注射海人酸3-5分鐘后，首先出現(xiàn)腦電圖變化，右側(cè)皮層可見(jiàn)腦電頻率增快，10分鐘左右出現(xiàn)伴咀嚼的吞咽動(dòng)作及呼吸加快，并出現(xiàn)惡心嘔吐胃內(nèi)容物等自主神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，30分鐘后出現(xiàn)單個(gè)肢體的不自主抽搐，繼而發(fā)展到雙側(cè)肢體的不自主抽搐，濕狗樣抖動(dòng)以及全身強(qiáng)直-陣攣等即部分性發(fā)作繼發(fā)全面強(qiáng)直陣攣性發(fā)作。對(duì)照猴未見(jiàn)癇性發(fā)作。[0051]5.2腦電圖表現(xiàn)[0052]基礎(chǔ)腦電圖表現(xiàn):可見(jiàn)頻率3-8Ηζ，波幅為200-500uV，Θ波多見(jiàn)，以及10_14Ηζ，波幅100-20uV，低幅快節(jié)律。實(shí)驗(yàn)組注射海人酸后3-5分鐘，右側(cè)皮層可見(jiàn)腦電頻率增快，頻率為16-20ΗΖ，波幅為100-200uV，波形逐漸變尖，7分鐘后波幅逐漸增高，達(dá)200-400uV，波形更尖，逐漸出現(xiàn)類(lèi)似尖波節(jié)律。15分鐘后出現(xiàn)散發(fā)棘波，棘慢波，頻率為16-18ΗΖ，波幅為300-500uV，此時(shí)行為學(xué)無(wú)明顯變化(圖3)。30-40分鐘左右出現(xiàn)單個(gè)肢體的陣攣，此時(shí)腦電圖表現(xiàn)為右側(cè)02導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)頻率逐漸增快，波幅逐漸增高，波形變尖的低幅快節(jié)律，隨后右側(cè)顳區(qū)導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)節(jié)律性棘波，棘慢波，左側(cè)C3導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)棘波節(jié)律，隨后擴(kuò)展到全導(dǎo)。此時(shí)行為學(xué)表現(xiàn)為四肢屈曲陣攣發(fā)作，2-3分鐘后逐漸恢復(fù)，腦電圖主要以慢波為主，全導(dǎo)出現(xiàn)頻率為2-4Ηζ，波幅為200-400uV的高幅慢波。(見(jiàn)圖1_8)。[0053]上述結(jié)果說(shuō)明，本實(shí)驗(yàn)首次成功建立了靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物-恒河猴的海人酸癲癇發(fā)作模型，并從行為學(xué)和電生理兩方面予以評(píng)價(jià)，該模型表現(xiàn)為部分繼發(fā)全面性發(fā)作，很好的模擬人類(lèi)顳葉癲癇的發(fā)作形式；且該方法具有局部注射，劑量??；可重復(fù)性強(qiáng)；致癇劑量與動(dòng)物性別、年齡先關(guān)不大；可重復(fù)性好；致癇過(guò)程清晰；藥物安全性好；致癇時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。【權(quán)利要求】1.一種制備癲癇發(fā)作動(dòng)物模型的方法，該方法包括將6.0-9.0μI的2.0μg/μI的海人酸施用于靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的海馬。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物選自猴科，猩猩科，包括大猩猩、黑猩猩，或猿類(lèi)，包括長(zhǎng)臂猿、類(lèi)人猿；優(yōu)選恒河猴。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于海人酸通過(guò)立體定向方法微量注射給藥。4.通過(guò)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法制備的癲癇發(fā)作動(dòng)物模型?！疚臋n編號(hào)】A01K67/027GK103505455SQ201210228629【公開(kāi)日】2014年1月15日申請(qǐng)日期:2012年6月24日優(yōu)先權(quán)日:2012年6月24日【發(fā)明者】孟凡剛,張建國(guó),陳寧,楊岸超,劉煥光,葛燕,劉崇,胡文瀚,張凱申請(qǐng)人:孟凡剛