專利名稱：利用原葉體增殖途徑快速繁育鳥巢蕨種苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用原葉體增殖途徑快速繁育鳥巢蕨種苗的方法。該方法利用鳥巢蕨孢子誘導(dǎo)形成的原葉體，通過(guò)增殖、孢子體誘導(dǎo)、孢子體生根、移栽等過(guò)程，獲得大量可用于生產(chǎn)栽培的種苗。
背景技術(shù)：
鳥巢蕨(Aspleniumnidus)又名山蘇花、雀巢蕨、雀巢養(yǎng)齒，屬于鐵角蕨類，是多年生常綠附生蕨類植物。產(chǎn)于亞洲、非洲和澳洲。鳥巢蕨具有四季常青、株形豐滿、淡雅秀麗、葉色蔥綠等特點(diǎn)，是布置廳堂、會(huì)場(chǎng)和制作花籃的良好觀葉材料，切葉用量大，也是家庭園藝造景常用的材料。近年來(lái)又用作葉菜栽培，為地道的原生蔬菜，其嫩芽鮮綠，炒食質(zhì) 脆爽口，無(wú)苦澀味，頗受消費(fèi)者的喜愛，未來(lái)的應(yīng)用潛力大。在自然條件下，鳥巢蕨的繁殖方法通常用分株繁殖法，也可采用孢子繁殖法，但是孢子繁殖要求條件高，很難分化出苗。而利用組織培養(yǎng)進(jìn)行鳥巢蕨的繁殖可以得到大規(guī)模的整齊瓶苗，且繁殖系數(shù)高，近年來(lái)關(guān)于鳥巢蕨的組織培養(yǎng)均通過(guò)小苗分化小苗的方式進(jìn)行增殖，該方法增殖系數(shù)較低，分化出的小苗不整齊，先分化的小苗容易老化，不利于批量出苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用原葉體增殖途徑快速繁育鳥巢蕨種苗的方法，以原葉體形式進(jìn)行增殖，可獲得大量的原葉體，通過(guò)增殖、孢子體誘導(dǎo)、孢子體生根、移栽等過(guò)程，獲得大量可用于生產(chǎn)栽培的種苗。該方法獲得的孢子體生理年齡一致，生長(zhǎng)整齊，適合工廠化育苗和規(guī)?；耘?。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案一種利用原葉體增殖途徑快速繁育鳥巢蕨種苗的方法，包括原葉體培養(yǎng)過(guò)程、增殖培養(yǎng)過(guò)程、孢子體誘導(dǎo)過(guò)程、生根誘導(dǎo)過(guò)程、移栽和管理過(guò)程，其步驟如下I、原葉體培養(yǎng)過(guò)程取帶未散開孢子的鳥巢蕨葉片，清洗消毒后用無(wú)菌紙吸干水分，取出孢子接種到孢子萌發(fā)培養(yǎng)基培養(yǎng)40 60 d，待孢子萌發(fā)并長(zhǎng)成綠色的原絲體(此時(shí)，在培養(yǎng)基的表面可以看到許多綠色的小點(diǎn));將孢子萌發(fā)后形成的原絲體接種于發(fā)育培養(yǎng)基上，25 30 d后原絲體發(fā)育成原葉體。所述孢子萌發(fā)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加BA O. 5mg/L、蔗糖30 g/L、卡拉膠6.5 g/L, pH 5.8。所述發(fā)育培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加 6-BA I. O mg/L、NAA O. 02 mg/L、鹿糖 30 g/L、卡拉膠 6. 5 g/L, pH 5.8。2、增殖培養(yǎng)過(guò)程將原葉體團(tuán)切割成I cm3的小塊，接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，每40d繼代I次，增殖系數(shù)可達(dá)10以上。所述增殖培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加
6-BA 2. O mg/L、NAA O. 01 mg/L、鹿糖 30 g/L、卡拉膠 6. 5 g/L, pH 5.8。
3、孢子體誘導(dǎo)過(guò)程將經(jīng)過(guò)繼代增殖培養(yǎng)的原葉體切成O. 5 cm3的小塊，接種到孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，20 d后，原葉體精子器和頸卵器發(fā)育成熟，再培養(yǎng)，直至在原葉體團(tuán)中分化出大量孢子體。所述孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加6-BA 3.0 mg/L,NAA 0.01 mg/L、鹿糖 30 g/L、卡拉膠 6. 5 g/L, pH 5.8。4、生根誘導(dǎo)過(guò)程待孢子體的葉片伸長(zhǎng)到2 3 cm時(shí)，將孢子體從原葉體團(tuán)中單個(gè)分離出來(lái)，接種到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30 d后，在苗的基部形成棕色的根，根上有根毛和叉根，生根率95%。所述生根培養(yǎng)基是以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加NAA 0.5 mg/L、IBA 0.3 mg/L、蔗糖 30 g/L、卡拉膠 6. 5 g/L, pH 5.8。 5、移栽和管理過(guò)程A.出瓶將株高在4cm以上的生根苗連瓶放置在室外煉苗，一周后將苗移出培養(yǎng)瓶外，洗凈小苗根部的培養(yǎng)基，進(jìn)行移栽；B.基質(zhì)分別取草炭土、椰糠和河沙，按體積比計(jì)草炭土 椰糠河沙=3:2:1的比例配成基質(zhì)，提前澆透水，并覆蓋薄膜保濕；C.移栽將已經(jīng)濕透的基質(zhì)進(jìn)行淺翻，然后耙平，并用竹簽打孔，孔深O. 5 cm，將小苗輕輕放到孔中，并用周圍的基質(zhì)填充，稍壓實(shí)，并用噴霧的方法淋水；D.管理移栽后7 10 d，覆蓋薄膜保濕，基質(zhì)濕度保持80% 90%左右，然后逐漸降低到70% ;空氣濕度90%以上，然后逐漸降低到60% 70% ;遮陰60% 70%，然后逐漸減少到30% ；E.施肥15 20 d后幼苗生新根，晴天上午采用O. 2% O. 3%尿素溶液噴霧后，并用清水淋洗，每7 d施肥I次；F.病蟲害防治利用500倍多菌靈、500倍百菌清、800倍甲霜靈復(fù)合防病，利用菊酯類殺蟲劑除蟲。本發(fā)明工藝流程簡(jiǎn)單，以原葉體形式進(jìn)行增殖，可獲得大量的原葉體，通過(guò)增殖、孢子體誘導(dǎo)、孢子體生根、移栽等過(guò)程，獲得大量可用于生產(chǎn)栽培的種苗，且獲得的種苗生理年齡一致，生長(zhǎng)整齊，適合工廠化育苗和規(guī)模化栽培。


圖I是鳥巢蕨原葉體增殖效果圖。圖2是鳥巢蕨原葉體誘導(dǎo)出孢子體效果圖。圖3是鳥巢蕨孢子體生長(zhǎng)效果圖。圖4是鳥巢蕨孢子體生根效果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例一I、原葉體培養(yǎng)過(guò)程
取帶未散開孢子的鳥巢蕨葉片,用洗漆劑溶液浸泡10 min,流失沖洗10 min,在超凈工作臺(tái)用O. 1% HgCl2滅菌8 min，無(wú)菌水沖洗4次后，用無(wú)菌紙吸干水分，用解剖刀將孢子刮出，接種到孢子萌發(fā)培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基+ΒΑ0. 5 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉膠6. 5 g/L,pH 5. 8)，培養(yǎng)約6 8周后孢子萌發(fā)并長(zhǎng)成綠色的原絲體，在培養(yǎng)基的表面可以看到許多綠色的小點(diǎn)；將孢子萌發(fā)后形成的原絲體接種于發(fā)育培養(yǎng)基(MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA O. 02mg/L+鹿糖30 g/L+卡拉膠6. 5 g/L, pH 5. 8), 4周后,原絲體發(fā)育成原葉體。2、增殖培養(yǎng)過(guò)程將原葉體團(tuán)切割成I cm3的小塊，接種到增殖培養(yǎng)基(MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA
0.01 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉膠6. 5 g/L, pH 5. 8)上進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，每40 d繼代I次，原葉體在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上可快速增殖，增殖系數(shù)可達(dá)10以上(圖I)。3、孢子體誘導(dǎo)過(guò)程 將經(jīng)過(guò)繼代增殖培養(yǎng)的原葉體切成O. 5 cm3的小塊，接種到孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+6-BA 3. O mg/L+NAA O. 01 mg/L+蔗糖 30 g/L+卡拉膠 6. 5 g/L, pH 5.8)上，20d 后，原葉體精子器和頸卵器發(fā)育成熟，再培養(yǎng)10 d，幼孢子體大量出現(xiàn)，隨著培養(yǎng)進(jìn)程的推進(jìn)，在原葉體團(tuán)中分化出大量孢子體(圖2)。將本發(fā)明所述孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)組，其他培養(yǎng)基(分別為 MS+6-BA I. O mg/L +IAA O. 02 mg/L、MS+6_BA I. O mg/L +IBA O. 02 mg/L、MS+6-BA 1.0 mg/L，其他條件與實(shí)驗(yàn)組相同)為對(duì)照組進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)對(duì)比，所得結(jié)果見表1，實(shí)驗(yàn)組分化率最高，其分化率為96%。表I鳥巢蕨原葉體分化孢子體的頻率
權(quán)利要求
1.一種利用原葉體增殖途徑快速繁育鳥巢蕨種苗的方法，其特征在于，包括原葉體培養(yǎng)過(guò)程、增殖培養(yǎng)過(guò)程、孢子體誘導(dǎo)過(guò)程、生根誘導(dǎo)過(guò)程、移栽和管理過(guò)程，其步驟如下 .1)、原葉體培養(yǎng)過(guò)程 取帶未散開孢子的鳥巢蕨葉片，清洗消毒后用無(wú)菌紙吸干水分，取出孢子接種到孢子萌發(fā)培養(yǎng)基培養(yǎng)40 60 d，待孢子萌發(fā)并長(zhǎng)成綠色的原絲體；將孢子萌發(fā)后形成的原絲體接種于發(fā)育培養(yǎng)基上，25 30 d后原絲體發(fā)育成原葉體；所述孢子萌發(fā)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加BA 0.5 mg/L、蔗糖30 g/L、卡拉膠6.5 g/L, pH 5. 8 ;所述發(fā)育培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加6-BA 1.0 mg/L、NAA O. 02 mg/L、蔗糖30 g/L、卡拉膠 6. 5 g/L, pH 5. 8 ； .2)、增殖培養(yǎng)過(guò)程 將原葉體團(tuán)切割成I cm3的小塊，接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，每40d繼代I次；所述增殖培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加6-BA 2. O mg/L、NAA O. 01 mg/L、鹿糖 30 g/L、卡拉膠 6. 5 g/L, pH 5. 8 ； .3)、孢子體誘導(dǎo)過(guò)程 將經(jīng)過(guò)繼代增殖培養(yǎng)的原葉體切成O. 5 cm3的小塊，接種到孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，20d后，原葉體精子器和頸卵器發(fā)育成熟，再培養(yǎng)，直至在原葉體團(tuán)中分化出大量孢子體；所述孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加6-BA 3. O mg/L、NAA O. 01 mg/L、鹿糖 30 g/L、卡拉膠 6. 5 g/L, pH 5. 8 .4)、生根誘導(dǎo)過(guò)程 待孢子體的葉片伸長(zhǎng)到2 3 cm時(shí)，將孢子體從原葉體團(tuán)中單個(gè)分離出來(lái)，接種到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30 d后，在苗的基部形成棕色的根；所述生根培養(yǎng)基是以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加 NAA O. 5 mg/L、IBA O. 3 mg/L、鹿糖 30 g/L、卡拉膠 6. 5 g/L, pH 5. 8 ； .5)、移栽和管理過(guò)程 A.出瓶將株高在4cm以上的生根苗連瓶放置在室外煉苗，一周后將苗移出培養(yǎng)瓶夕卜，洗凈小苗根部的培養(yǎng)基，進(jìn)行移栽； B.基質(zhì)分別取草炭土、椰糠和河沙，按重量比計(jì)草炭土椰糠河沙=3:2:1的比例配成基質(zhì)，提前澆透水，并覆蓋薄膜保濕； C.移栽將已經(jīng)濕透的基質(zhì)進(jìn)行淺翻，然后耙平，并用竹簽打孔，孔深0.5cm，將小苗輕輕放到孔中，并用周圍的基質(zhì)填充，稍壓實(shí)，并用噴霧的方法淋水； D.管理移栽后7 10d，覆蓋薄膜保濕，基質(zhì)濕度保持80% 90%左右，然后逐漸降低到70% ;空氣濕度90%以上，然后逐漸降低到60% 70% ;遮陰60% 70%，然后逐漸減少到 30% ； E.施肥15 20d后幼苗生新根，晴天上午采用O. 2% O. 3%尿素溶液噴霧后，并用清水淋洗，每7 d施肥I次； F.病蟲害防治利用500倍多菌靈、500倍百菌清、800倍甲霜靈復(fù)合防病，利用菊酯類殺蟲劑除蟲。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用原葉體增殖途徑快速繁育鳥巢蕨種苗的方法，包括原葉體培養(yǎng)過(guò)程、增殖培養(yǎng)過(guò)程、孢子體誘導(dǎo)過(guò)程、生根誘導(dǎo)過(guò)程、移栽和管理過(guò)程。本發(fā)明工藝流程簡(jiǎn)單，以原葉體形式進(jìn)行增殖，可獲得大量的原葉體，通過(guò)增殖、孢子體誘導(dǎo)、孢子體生根、移栽等過(guò)程，獲得大量可用于生產(chǎn)栽培的種苗，且獲得的種苗生理年齡一致，生長(zhǎng)整齊，適合工廠化育苗和規(guī)?；耘?。
文檔編號(hào)A01G31/00GK102715092SQ20121023963
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月6日
發(fā)明者徐立, 李志英, 李騰敏 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所