專利名稱：一種簡(jiǎn)便的腐霉菌快速分離培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種簡(jiǎn)便、快速分離腐霉菌的選擇性培養(yǎng)基。屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腐霉菌是世界性分布的土壤真菌，腐生能力很強(qiáng)，可以侵染150多種蔬菜瓜果作物的根部和幼苗，引起爛種、猝倒、立枯、爛根和爛果。其中，由瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)引起的粹倒病是瓜菜、花丼、藥用植物、煙草和豆類、棉花、玉米、高粱等植物幼苗期一種世界范圍內(nèi)的毀滅性病害。由通常在出苗后，莖基部近地面處產(chǎn)生水潰狀暗色斑，繼而繞莖擴(kuò)展，逐漸縊縮呈細(xì)線狀，使幼苗地上部因失去支撐能力而折倒，俗稱卡脖子病。濕度大時(shí)病部或土表會(huì)產(chǎn)生白色棉絮狀物，即病菌菌絲、孢囊梗和孢子囊。在氣候適宜的條件下，短期內(nèi)就可爆發(fā)，蔓延速度極快，嚴(yán)重情況下可導(dǎo)致植物幼苗大面積死亡，造成缺苗甚至毀種，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。瓜果腐霉(P. aphanidermatum)屬于卵菌門(mén)霜霉目腐霉科腐霉屬。病菌以卵孢子在12-18cm表土層越冬，并在土中長(zhǎng)期存活。猝倒病的初侵染源主要以瓜果腐霉的卵孢子和厚垣孢子在土壤、病殘?bào)w中越冬，其中土壤中的病殘?bào)w帶菌率最高。在適宜條件下可萌發(fā)產(chǎn)生孢子囊，以游動(dòng)孢子或直接長(zhǎng)出芽管侵染幼苗引起猝倒。田間的再侵染主要靠病苗上產(chǎn)出孢子囊及游動(dòng)孢子，借灌溉水或雨水濺附到貼近地面的根莖上引致更嚴(yán)重的損失。該病主要在幼苗出土后、長(zhǎng)出1-2片葉之前發(fā)生。尤其是育苗期出現(xiàn)低溫、高濕條件，利于發(fā)病。為了對(duì)瓜果腐霉進(jìn)行相關(guān)研究，以及調(diào)查病原菌的田間發(fā)病情況，篩選高效的藥齊U，最終達(dá)到有效防治該病害的目的，分離獲得純化的瓜果腐霉是必要的前提條件。常規(guī)的病原菌分離方法是《植病研究方法》介紹的用75%乙醇和0. I %升汞液表面消毒處理。實(shí)際工作中，從田間采集到的樣本除被瓜果腐霉侵染外，不可避免的常常帶有鐮刀菌，立枯絲核菌和疫霉等其他非目標(biāo)真菌和細(xì)菌，按常規(guī)方法進(jìn)行分離組織病原菌時(shí)，由于這些非目標(biāo)真菌或細(xì)菌的污染，造成目標(biāo)菌分離率低或難于分離到目標(biāo)菌。因此，利用普通培養(yǎng)基從病組織上或土壤中分離瓜果腐霉時(shí)，達(dá)不到分離純化的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種殺菌劑組合。本發(fā)明所提供的殺菌劑組合，其活性成分如下述I)、2)所示I)、由多菌靈、五氯硝基苯、氟嗎啉、利福平組成；2)、由咪鮮胺、五氯硝基苯、氟嗎啉、利福平組成；上述殺菌劑中，所述I)中，所述多菌靈、五氯硝基苯、氟嗎啉和利福平的質(zhì)量份數(shù)比為(10-50) (10-50) (5-10) (50-100)，具體為 10 : 10 : 5 : 50 或 20 : 20 : 7 : 70或 50 : 50 : 10 100 ；
所述2)中，所述咪鮮胺、五氯硝基苯、氟嗎啉和利福平的質(zhì)量份數(shù)比為(10-20) (10-50) (5-10) (50-100)，具體為 10 : 10 : 5 : 50 或 15 : 20 : 7 : 70或 20 : 50 : 10 100 ；本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于分離瓜果腐霉(P. aphanidermatum)的培養(yǎng)基。本發(fā)明所提供的 用于分離瓜果腐霉(P. aphanidermatum)的培養(yǎng)基,為如下I或II所示I、是向PDA培養(yǎng)基中添加權(quán)利要求I或2中所述I)所示殺菌劑得到的；II、是向PDA培養(yǎng)基中添加權(quán)利要求I或2中所述2)所示殺菌劑得到的；上述培養(yǎng)基中，所述I所示培養(yǎng)基中，所述多菌靈在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為10 V- g/mL-50 V- g/mL,具體為 10 V- g/mL、20 u g/mL 或 50 ii g/mL ;所述五氯硝基苯在所述 PDA培養(yǎng)基中的濃度為10 V- g/mL-50 V- g/mL,具體為10 V- g/mL>20 u g/mL或50 ii g/mL ;所述氟嗎啉在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為g/mL-10 u g/mL,具體為5 ii g/mL、7 u g/mL或IOy g/mL ;所述利福平在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為50 ii g/mL-IOOu g/mL，具體為50 y g/mL、70 u g/mL 或 100 u g/mL ；上述培養(yǎng)基中，所述II所示培養(yǎng)基中，所述咪鮮胺在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為10 V- g/mL 20 V- g/mL,具體為 10 u g/mL、15 ii g/mL 或 20 ii g/mL ;所述五氯硝基苯在所述 PDA培養(yǎng)基中的濃度為10 V- g/mL-50 V- g/mL,具體為10 V- g/mL>20 u g/mL或50 ii g/mL ;所述氟嗎啉在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為5 V- g/mL-10 u g/mL,具體為5 u g/mL、7 u g/mL或10 ii g/mL ;所述利福平在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為50 u g/mL-100 u g/mL,具體為50 u g/mL、70 u g/mL 或 100 u g/mL ；上述培養(yǎng)基在分離瓜果腐霉(P. aphanidermatum)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所提供的分離瓜果腐霉(P. aphanidermatum)的方法,包括如下步驟用上述任一所述培養(yǎng)基進(jìn)行分離，用于分離的樣本為感染瓜果腐霉(P. aphanidermatum)的植物的根莖或土壤。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的PDA選擇性培養(yǎng)基具有可行性、準(zhǔn)確性、實(shí)用快捷和成本低廉、制備簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。用本發(fā)明的PDA選擇性培養(yǎng)基分離瓜果腐霉，可解決瓜果腐霉等植物病原腐霉分離過(guò)程中各種非目標(biāo)真菌和細(xì)菌污染嚴(yán)重的問(wèn)題，且速度快，效率高，省時(shí)、省力。本發(fā)明為成功分離其他腐霉屬菌株提供了參考，為進(jìn)行田間一次性分離以及室內(nèi)純化瓜果腐霉提供技術(shù)支持。本發(fā)明選擇培養(yǎng)基可用于簡(jiǎn)便、快捷地從病株組織上或病田土壤中一次性分離瓜果腐霉以及室內(nèi)純化瓜果腐霉。


圖I為三種抗生素對(duì)植株根莖表面細(xì)菌的抑制作用。圖2為三種抗生素對(duì)土壤中細(xì)菌的抑制作用。圖3為瓜果腐霉病的發(fā)病情況和分離情況。A為健康的黃瓜幼苗；B為瓜果腐霉引起的猝倒病的病苗；C為田間瓜果腐霉引起的猝倒病的病苗；D為瓜果腐霉引起的草坪腐霉枯萎?。籈為育苗階段瓜果腐霉引起的猝倒??；F為發(fā)病植株中分離到的瓜果腐霉。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。多菌靈原藥購(gòu)自安徽廣信農(nóng)化股份有限公司(安徽廣信農(nóng)化集團(tuán)有限公司)，其主要活性成分物質(zhì)的化學(xué)名稱是N-(2_苯駢咪唑基)_氨基甲酸甲酯，通用名稱為多菌靈，分子式C9H9N302。該藥中主要活性成分物質(zhì)的質(zhì)量百分含量為98. 9%。五氯硝基苯原藥購(gòu)自山西三立化工有限公司(原山西省臨汾有機(jī)化工廠)，其主要活性成分物質(zhì)的化學(xué)名稱是五氯硝基苯，通用名稱為五氯硝基苯，分子式C6C15N02。該藥中五氯硝基苯的質(zhì)量百分含量為95%。咪鮮胺(又叫“咪酰胺”)原藥購(gòu)自海南力智生物工程有限公司，其主要活性成分物質(zhì)的化學(xué)名稱是N-丙基-N-[2-(2，4，6-三氯苯氧基)乙基]-咪唑-I-甲酰胺，分子式C15H16C13N302。該藥中咪鮮胺的質(zhì)量百分含量為97%。氟嗎啉原藥購(gòu)自沈陽(yáng)化工研究院，其主要活性成分物質(zhì)的化學(xué)名稱是4-[3_(3，
4-二甲氧基)-3-(4-氟苯基)丙烯酸]嗎啉，通用名稱為氟嗎啉，分子式C21H22FN04。該藥中主要活性成分物質(zhì)的質(zhì)量百分含量為96%。 青霉素、利福平、氯霉素均購(gòu)自北京拓英坊科技有限公司。實(shí)施例I、三種真菌抑制劑、一種疫霉抑制劑和三種抗生素對(duì)瓜果腐霉抑制作用一、三種真菌抑制劑和一種疫霉抑制劑對(duì)瓜果腐霉的抑制作用以二甲基甲酰胺為多菌靈的溶劑，以丙酮或甲醇為咪鮮胺、五氯硝基苯和氟嗎啉的溶劑，分別配制5000ii g/mL的四種藥劑母液IOml ;其中，將多菌靈、五氯硝基苯和咪鮮胺這三種真菌抑制劑的母液分別配制系列濃度為50 u g/mL、20 u g/mL和10 u g/mL的含藥PDA平板；將氟嗎啉這種疫霉抑制劑的母液分別配制系列濃度為20 u g/mL、10 u g/mL和5 y g/mL的含藥PDA平板，以加有溶劑的平板為對(duì)照；然后采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定瓜果腐霉對(duì)菌靈、五氯硝基苯、咪鮮胺和氟嗎啉的敏感性。將供試的瓜果腐霉菌株在PDA平板上于25°C預(yù)培養(yǎng)2d，用直徑為5mm的打孔器于菌落邊緣的同一圓周上打取菌餅，將菌餅接種到分別含有四種藥劑系列濃度的PDA含藥平板中央(各濃度含等量有機(jī)溶劑)，于25°C下黑暗培養(yǎng)，2-3d后用十字交叉法測(cè)量各處理的菌落增長(zhǎng)直徑(菌落直徑減去菌餅直徑5mm)，每處理重復(fù)3次；最后按照下面公式求出各藥劑濃度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制百分率(％ )，抑制率(%) = [(對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑-處理菌落增長(zhǎng)直徑)/ (對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑)]X 100。測(cè)定了供試的四種真菌抑制劑對(duì)瓜果腐霉的抑制作用，結(jié)果如表I所示，不同濃度的多菌靈、五氯硝基苯對(duì)瓜果腐霉的抑制率均低于10%，因此可以采用10-50ii g/mL的多菌靈、五氯硝基苯作為選擇性藥劑；50ii g/mL咪鮮胺對(duì)瓜果腐霉的抑制率為27%，10-20 ii g/mL濃度的咪鮮胺對(duì)瓜果腐霉抑制率較低，所以可以采用10-20ii g/mL的咪鮮胺為分離腐霉中使用的選擇性藥劑。濃度為20 g/mL氟嗎啉對(duì)瓜果腐霉的抑制率大于
11.2%,IOu g/mL氟嗎啉對(duì)瓜果腐霉抑制率為4. 5%，2 ii g/mL的濃度對(duì)辣椒疫霉沒(méi)有抑制作用，因此，可以采用2-10 ii g/mL濃度的氟嗎啉作為選擇性藥劑；表I四種真囷抑制劑對(duì)瓜果腐霉的抑制作用
權(quán)利要求
1.一種殺菌劑，其活性成分如下述I)或2)所示 1)、由多菌靈、五氯硝基苯、氟嗎啉和利福平組成； 2)、由咪鮮胺、五氯硝基苯、氟嗎啉和利福平組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的殺菌劑，其特征在于 所述I)中，所述多菌靈、五氯硝基苯、氟嗎啉和利福平的質(zhì)量份數(shù)比為(10-20) (10-50) (10-50) (5-10) (50-100)，具體為 10 : 10 : 5 : 50 或 20 : 20 : 7 : 70 或50 50 10 100 ； 所述2)中，所述咪鮮胺、五氯硝基苯、氟嗎啉和利福平的質(zhì)量份數(shù)比為(10-20) (10-50) (5-10) (50-100)，具體為 10 : 10 : 5 : 50 或 15 : 20 : 7 : 70 :或 20 : 50 : 10 : 100。
3.一種用于分離瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)的培養(yǎng)基,為如下I或II所示 I、是向PDA培養(yǎng)基中添加權(quán)利要求I或2中所述I)所示殺菌劑得到的； II、是向PDA培養(yǎng)基中添加權(quán)利要求I或2中所述2)所示殺菌劑得到的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基，其特征在于 上述培養(yǎng)基中，所述I所示培養(yǎng)基中，所述多菌靈在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為IOii g/mL-50 V- g/mL,具體為10 u g/mL、20 u g/mL或50 ii g/mL ;所述五氯硝基苯在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為IOii g/mL-50 V- g/mL,具體為IOy g/mL>20 u g/mL或50 ii g/mL ;所述氟嗎啉在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為g/mL -10 u g/mL,具體為5 ii g/mL、7 u g/mL或IOy g/mL ;所述利福平在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為50 u g/mL-100 u g/mL,具體為50 u g/mL、70 u g/mL或100u g/mL ； 上述培養(yǎng)基中，所述II所示培養(yǎng)基中，所述咪鮮胺在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為10 V- g/mL-20 V- g/mL,具體為 10 u g/mL、15 ii g/mL 或 20 ii g/mL ;所述五氯硝基苯在所述 PDA培養(yǎng)基中的濃度為10 V- g/mL-50 V- g/mL,具體為10 V- g/mL>20 u g/mL或50 ii g/mL ;所述氟嗎啉在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為g/mL-10 u g/mL,具體為5 ii g/mL、7 ii g/mL或IOy g/mL ;所述利福平在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為50 ii g/mL-IOOu g/mL，具體為50 y g/mL、70 u g/mL 或 100 u g/mL。
5.權(quán)利要求3或4所述培養(yǎng)基在分離瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)中的應(yīng)用。
6.一種分離瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)的方法，包括如下步驟用權(quán)利要求3或4中所述培養(yǎng)基進(jìn)行分離，用于分離的樣本為感染瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)的植物的根莖部組織或土壤。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種簡(jiǎn)便、快速的分離腐霉菌的選擇性培養(yǎng)基，尤其適用于瓜果腐霉的分離。屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。該培養(yǎng)基是向PDA培養(yǎng)基中添加如下1)或2)所述殺菌劑得到的1)、由多菌靈、五氯硝基苯、氟嗎啉和利福平組成；2)、由咪鮮胺、五氯硝基苯、氟嗎啉和利福平組成；實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的PDA選擇性培養(yǎng)基具有可行性、準(zhǔn)確性、實(shí)用快捷和成本低廉、制備簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。用本發(fā)明的PDA選擇性培養(yǎng)基分離瓜果腐霉等腐霉屬卵菌，可解決瓜果腐霉等植物病原腐霉分離過(guò)程中各種非目標(biāo)真菌和細(xì)菌污染嚴(yán)重的問(wèn)題，且速度快，效率高，省時(shí)、省力。
文檔編號(hào)A01N47/38GK102754655SQ20121025062
公開(kāi)日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2012年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月19日
發(fā)明者劉鵬飛, 賈睿哲 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)