專利名稱：一株產(chǎn)苦參堿的枝頂孢屬真菌及其應(yīng)用和其發(fā)酵液的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株產(chǎn)苦參堿的枝頂孢屬真菌及其應(yīng)用和其發(fā)酵液的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
苦豆子(Sophora alopecuroides L)為豆科槐屬多年生草本植物,廣泛分布于我國(guó)寧夏、甘肅、內(nèi)蒙古、新疆等西部省區(qū)的荒漠、半荒漠草地?？喽棺尤?、根、種子可入藥，用于抗腫瘤、抗病毒、抗菌消炎、清熱解毒、消腫止痛、止痢、殺蟲(chóng)等，其有效成分主要為苦參堿等喹諾里西啶類生物堿，具有重要的醫(yī)療和研究?jī)r(jià)值?？喽棺涌购秃的望}堿、固氮作用強(qiáng)，是西北地區(qū)防風(fēng)固沙、維持西部草原生態(tài)平衡的重要沙生植物。但近年來(lái)，隨著臨床醫(yī)療對(duì)苦豆子生物堿需求的不斷增加，人為的濫采濫挖致使野生苦豆子儲(chǔ)量急劇下降，大批草場(chǎng)退化，水土流失，嚴(yán)重威脅著苦豆子植物資源的可持續(xù)開(kāi)發(fā)和利用以及西部草地的生態(tài)平衡。目前，人們主要對(duì)苦豆子內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生放線菌進(jìn)行了研究，但苦豆子內(nèi)生真菌的研究較少。王蘭等(2007)對(duì)苦豆子內(nèi)生真菌進(jìn)行研究，分離出I株對(duì)小麥赤霉等6種病原菌具有不同程度抑制作用的內(nèi)生真菌，與苦豆子生物堿的作用相近；顧沛雯等從苦豆子中分離到214株內(nèi)生真菌，167株具有抑菌活性。但苦豆子中合成喹諾里西啶類生物堿內(nèi)生真菌的研究還未見(jiàn)報(bào)道。產(chǎn)生喹諾里西啶生物堿的苦豆子內(nèi)生真菌的開(kāi)發(fā)，將是解決苦豆子植物資源日益匱乏的有效途徑，具有重要的研究?jī)r(jià)值和廣闊應(yīng)用前景
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供一株產(chǎn)苦參堿的枝頂孢屬真菌，利用該枝頂孢屬真菌能夠通過(guò)微生物發(fā)酵合成苦參堿等苦豆子的主要有效成分。本發(fā)明的目的之二是提供一種上述枝頂孢屬真菌的應(yīng)用，其能夠用于通過(guò)微生物發(fā)酵合成苦參堿；本發(fā)明的目的之三是提供一種上述枝頂孢屬真菌發(fā)酵液的應(yīng)用，該發(fā)酵液對(duì)黃瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌具有不同程度的抑菌作用。—株產(chǎn)苦參堿的枝頂孢屬真菌，是枝頂孢屬真菌(Acremonium sp. ) SA_NXE5CCTCC NO. M 2012214。—株用于通過(guò)微生物發(fā)酵合成苦參堿的枝頂孢屬真菌(Acremonium sp. ) SA_NXE5CCTCC NO. M 2012214。一株其發(fā)酵液用于抑制黃瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌的枝頂孢屬真菌(Acremonium sp.)SA_NX E5CCTCC NO. M 2012214。本發(fā)明的枝頂孢屬真菌，可以通過(guò)微生物發(fā)酵合成苦參堿等苦豆子主要有效成分，從而開(kāi)發(fā)新的微生物資源，為野生苦豆子植物資源的保護(hù)和利用提供了依據(jù)。并且本發(fā)明的枝頂孢屬真菌可直接利用真菌發(fā)酵產(chǎn)生苦參堿，與植物栽培產(chǎn)生苦參堿相比，具有效率高，周期短，不受季節(jié)、氣候、地理?xiàng)l件等因素的限制，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)證明，可通過(guò)微生物發(fā)酵合成苦參堿等苦豆子的主要有效成分。


附圖I為本發(fā)明菌株SA_NX E5的菌落圖；附圖2為本發(fā)明菌株SA_NX E5的顯微形態(tài)；附圖3為本發(fā)明菌株SA_NX E5提取物中保留時(shí)問(wèn)為25. 546min的色譜峰的離子碎片質(zhì)譜圖；附圖4為本發(fā)明菌株SA_NX E5提取物在250 800nm范圍的紫外掃描圖；附圖5為本發(fā)明菌株SA_NX E5的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一株枝頂抱屬真菌(Acremonium sp.) SA_NXE5CCTCC NO. M2012214(以下簡(jiǎn)稱“菌株SA_NX E5”)，該菌株保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址為中國(guó)湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC NO. M2012214，保藏(存活)日期為2012年6月18日，經(jīng)真菌分類學(xué)鑒定為枝頂孢屬(Acremonium sp.)。該菌能夠通過(guò)微生物發(fā)酵合成苦參堿等苦豆子的主要有效成分。一、菌株SA_NX E5的分離和培養(yǎng)(I)樣品準(zhǔn)備采集寧夏鹽池縣沙地生長(zhǎng)的新鮮無(wú)病害的盛花期全株苦豆子，放入冰盒中，于12h內(nèi)進(jìn)行內(nèi)生真菌分離。用自來(lái)水沖去植物表面泥土,用剪刀將葉、莖、種子、根分離，分別用滅菌的紗布將各組織部分包裹，進(jìn)行表面消毒。(2)植物樣品表面消毒先用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精浸泡20 30s ;再用有效氯質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I %的次氯酸鈉溶液浸泡2 3min，最后用滅菌去離子水漂洗2 3次，每次Imin0(3)真菌的分離分別將表面消毒后的葉、莖、種子、根用手術(shù)刀切成3_2大小的組織塊，用滅菌鑷子壓放在內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)基表面，然后置20°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 20d。待組織塊周圍長(zhǎng)出菌落后，挑去菌落邊緣菌絲接種于PDA培養(yǎng)基表面，置20°C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，若挑取的菌落在新的PDA表面生長(zhǎng)出現(xiàn)不同的菌落，則分別挑取各菌落接種于新的PDA培養(yǎng)基表面進(jìn)一步培養(yǎng)，待培養(yǎng)基表面僅長(zhǎng)出一種菌落時(shí)，可確定該菌株已被純化，進(jìn)而得到純化的菌株SA_NX E5菌株。SA_NX E5菌株的菌落扁平，初呈白色，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色、紅褐色(參見(jiàn)附圖I)。菌落呈氈狀，氣生菌絲較少，生長(zhǎng)較慢，生長(zhǎng)速度為0. 4cm/d。將SA_NXE5菌株接種于PCA培養(yǎng)基斜面，置20°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 20d，挑取少許菌絲，以水或棉蘭乳酸酚染色液為浮載劑，置顯微鏡下觀察。該菌株在PCA培養(yǎng)基上培養(yǎng)能產(chǎn)生分生孢子及分生孢子梗等結(jié)構(gòu)。菌絲較細(xì)，具橫隔；分生孢子及分生孢子梗無(wú)色，分生孢子梗具分支。分生孢子頂生或側(cè)生，或單生或聚集成團(tuán)，呈橢球狀或梭形，分生孢子大小為I I. 2X0. 8 Iiim(參見(jiàn)附圖2)所述的真菌分離培養(yǎng)基、PDA、PCA培養(yǎng)基的組分及配比為真菌分離培養(yǎng)基葡萄糖40g，蛋白胨10g，酵母粉2g，MgSO4. 7H200. 5g，K2HPO4Ig,瓊脂15g,蒸懼水IOOOmL, pH為6 7,121 °C高壓滅菌20min。
PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，蒸餾水lOOOmL，pH為6 7，121 °C高壓滅菌20min。PCA培養(yǎng)基馬鈴薯20g，胡蘿卜20g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH為6 7，121°C高壓滅菌20min。(4)真菌富集培養(yǎng)挑取PCA斜面上的SA_NX E5菌株的菌落，放入裝有10 15粒滅菌的玻璃珠和IOml滅菌去離子水的具塞離心管中，置渦旋器上振蕩I 2min，分散真菌孢子，并在顯微鏡下記錄每毫升液體中孢子的數(shù)量。吸取該孢子懸液5ml加入新的滅菌試管中，在試管中加入適量的滅菌去離子水，輕輕振蕩混勻，使真菌孢子的終濃度為I X IO5 I X IO6個(gè)/ml。取Iml真菌孢子懸液加入到裝有IOOml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，置25°C搖床中，150r/min振蕩培養(yǎng)15d。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及配比為葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母粉2g，MgS04. 7H20
0.5g, KCl 0. 5g, FeSO4. 7H20 0. Olg, K2HPO4Ig,蒸餾水 IOOOmL, pH 為 6 7，121 °C高壓滅菌20mino二、菌株SA_NX E5抑菌活性的檢測(cè)(I)菌株SA_NX E5的發(fā)酵培養(yǎng)分別在10支裝有IOOml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中各加入孢子懸液1ml，置25°C搖床中，150r/min振蕩培養(yǎng)15d。(2)發(fā)酵液的處理待培養(yǎng)結(jié)束后，用濾紙將發(fā)酵液過(guò)濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀80°C減壓濃縮。濃縮殘?jiān)?0ml去離子水超聲振蕩使其充分溶解,然后3000r/min離心lOmin，取上清液。用孔徑為
0.22 um的微孔濾膜過(guò)濾除菌，制成待檢液，加入到50 60°C的PDA培養(yǎng)基中，搖勻并鋪制含有待檢液的PDA平板。(3)抑菌試驗(yàn)將黃瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌分別接種于PDA培養(yǎng)基表面，置25°C培養(yǎng)72h。用打孔器在培養(yǎng)黃瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌的培養(yǎng)基上截取的6_的菌餅，分別接種于含有待檢液的PDA培養(yǎng)基和不含待檢液的PDA培養(yǎng)基表面，置25°C培養(yǎng)72h，測(cè)量菌落直徑。結(jié)果表明，在不含待檢液的PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的黃瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌的菌落直徑 分別為33. 5 ±4mm和27. 3 ± 3mm，而在含有待檢液的PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的黃瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌的菌落直徑分別為16. 2±3mm和20. 5±5mm，菌株SA_NX E5發(fā)酵液對(duì)黃瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌的抑制率分別為51. 6%和24. 9%。三、菌株SA_NX E5中生物堿的檢測(cè)(I)真菌菌絲中苦參堿的提取與分離將發(fā)酵培養(yǎng)的真菌過(guò)濾，收集真菌菌絲2 3g，用液氮冷凍菌絲并研磨成粉末，置60°C水浴30min烘干。分別用干凈濾紙包裹真菌粉末，置索氏提取器中，加入50ml甲醇，75°C提取24h。將提取液濃縮揮干，用5ml甲醇溶解，溶液與0. 5 Ig中性氧化鋁混勻，并置60°C水浴上加熱揮干甲醇。將吸附了樣品的中性氧化鋁粉末干法裝于5g的中性氧化鋁柱上，用V氯仿V鴨=7 : 3的混合溶劑30 50ml洗脫樣品，洗脫液分為2份，分別濃縮揮干，I份用Iml吡啶溶解，經(jīng)0. 22 y m微孔濾膜過(guò)濾后，再用吡啶定容至5ml，制成樣品待檢液用于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析。另I份用Iml乙醇溶解，經(jīng)0. 22 y m微孔濾膜過(guò)濾后，再用乙醇定容至5ml，制成樣品待檢液用于酸性染料比色法分析。(2)真菌發(fā)酵液中苦參堿的提取與分離將發(fā)酵培養(yǎng)的真菌過(guò)濾，收集濾液500ml，用lmol/L的氨水溶液調(diào)節(jié)pH至9 10，然后加入分液漏斗中。在漏斗中加入200 300ml的氯仿溶劑，振蕩萃取3 5次，回收氯仿萃取液，濃縮揮干氯仿，殘?jiān)?ml吡啶超聲振蕩使其充分溶解，經(jīng)0. 22 微孔濾膜過(guò)濾后，再用吡啶定容至IOml，制成樣品待檢液用于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析。(3)真菌菌絲和發(fā)酵液中苦參堿的氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析將按上述方法制備的樣品待檢液按如下條件進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析。分析條件為 Agilent HPSMS (190915-433)石英毛細(xì)管柱(30mX0. 25mmX0. 25 y m)，載氣為氦氣，流速 lmL/min。柱溫為100°C保持 Imin ；100 200。。，5。。/min，200 270°C, 20°C /min ；270°C保持lOmin。進(jìn)樣口溫度250°C，進(jìn)樣量luL，分流比50 I ;質(zhì)譜離子源溫度230°C，掃描范圍30 550，EI電壓為70eV。經(jīng)色譜分離后，菌株SA_NX E5的菌絲和發(fā)酵液提取物分別在色譜保留時(shí)間為25. 580min和25. 546 min出現(xiàn)色譜峰，且該色譜峰的離子碎片質(zhì)譜圖與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)中苦參堿的離子碎片質(zhì)譜圖吻合(參見(jiàn)附圖3)，說(shuō)明菌株SA_NX E5的菌絲和發(fā)酵液中均含有苦參堿，確定菌株SA_NX E5能夠產(chǎn)生苦參堿。(4)真菌菌絲中苦參堿含量的測(cè)定取lmg/ml苦參堿標(biāo)準(zhǔn)液10、20、30、40、50、60、70、80 U I分別置于25ml的具塞試管中，揮盡乙醇，分別加入pH = 7.6的溴麝香草酚藍(lán)緩沖液6. 00ml，氯仿6. 00ml，密塞，劇烈振搖2min提取，加入到酸式滴定管中靜置2h，分取氯仿層，以未加苦參堿液管為空白，取空白管中的氯仿層溶液放入紫外分光光度計(jì)中進(jìn)行基線校正，然后分別將各樣品氯仿層置于紫外分光光度計(jì)下進(jìn)行250 SOOnm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定苦參堿出現(xiàn)最大吸收峰時(shí)對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)為414nm，在該波長(zhǎng)下，測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)品提取液的吸光度值。以氯仿提取液中苦參堿濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，構(gòu)建線性回歸方程，得回歸方程y =47. 312x-0. 016 (R2 = 0. 9969)。吸取(I)中制備的菌絲提取物乙醇溶液IOOii L，加入到25ml具塞玻璃試管中，揮干乙醇。在試管中分別加入6. OOml溴麝香草酚藍(lán)pH = 7. 6緩沖液和6. OOml氯仿，密塞，劇烈振搖2min，然后將混合液體加入到酸式滴定管中靜置2h，分取氯仿層。將該樣品氯仿層置于紫外分光光度計(jì)下250 SOOnm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果表明菌絲提取物也在414nm處有最大吸收峰(參見(jiàn)附圖4)，將該波長(zhǎng)下測(cè)得的吸光度值代入線性回歸方程，計(jì)算得出菌絲中苦參堿的含量為37. 6 u g/g。四、菌株SA_NX E5的分子生物學(xué)鑒定采用引物ITSl和ITS4擴(kuò)增內(nèi)部轉(zhuǎn)錄區(qū)間序列(internal transcribedsequence, ITS)，采用引物NSl和NS2擴(kuò)增核糖體小亞基編碼序列。PCR反應(yīng)體系為TaKaRaTaq DNA 聚合酶 2. 5 U，10XPCR Buffer 5 u L, MgCl2 3 u L, dNTP 4 y L，弓丨物各 2 y L，模板DNA 0. L，加雙蒸水至50ii L ;反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)；最后72°C延長(zhǎng)IOmin使其完全反應(yīng)。將擴(kuò)增的片段凝膠回收后，送上海英駿生物技術(shù)公司測(cè)序。核苷酸序列測(cè)定結(jié)果顯示，菌株SA_NX E5的ITS-5. 8SrDNA序列和SSU rDNA序列長(zhǎng)度分別為573bp和50Ibp，其GenBank登錄號(hào)分別為JX021664和 JX040872。
菌株SA_NX E5的ITS-5. 8S rDNA核苷酸序列為序列表中序列I所示,菌株SA_NXE5的SSU rDNA核苷酸序列為序列表中序列2所示。登錄http//:www. ncbi. nlm. nih. gov,分別應(yīng)用 BLAST 程序?qū)y(cè)定的 ITS 和 SSUrDNA序列與GenBank中的ITS和SSU rDNA序列進(jìn)行同源性比較，選取同源性較高的菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。采用鄰接法(neighbor-j0ining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。BLAST比對(duì)結(jié)果顯不，菌株 SA_NX E5 的 ITS-5. 8SrDNA 序列與 Acremonium sp. CB90 (HM989951)、Acremoniumsp. YT03 (EF577237)、Acremonium sp. XSD-85 (EU326199)、Acremonium sp. B26 (HQ696028)等枝頂孢屬真菌的序列同源性高達(dá)98%。菌株SA_NX E5的SSU rDNA序列與AcremoniumguiIlematii CBS 756. 69(HQ232186)、Acremonium guiIlematii CBS 766.69(HQ232194)等枝頂孢屬真菌的序列同源性高達(dá)99%。NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(參見(jiàn)附圖5)表明，SA_NX E5菌株與 Acremonium sp. CB 90 (HM989951)、Acremonium sp. YT03 (EF577237)、Acremoniumsp. XSD-85 (EU326199)、Acremonium sp. B26 (HQ696028)等枝頂抱屬真菌的遺傳距離最近。根據(jù)SA_NX E5菌株的形態(tài)特點(diǎn)、ITS-5. 8S rDNA和SSU rDNA序列信息及其系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，確定SA_NX E5菌株為枝頂孢屬真菌(Acremonium sp.)。權(quán)利要求
1.一株產(chǎn)苦參堿的枝頂孢屬真菌,是枝頂孢屬真菌(Acremonium sp.) SA_NX E5 CCTCCNO. M 2012214。
2.一株用于通過(guò)微生物發(fā)酵合成苦參堿的枝頂孢屬真菌(Acremonium sp.) SA_NX E5CCTCC NO. M 2012214。
3.一株其發(fā)酵液用于抑制黃瓜枯萎病菌、番爺枯萎病菌的枝頂孢屬真菌(Acremoniumsp.)SA_NX E5 CCTCC NO. M 2012214。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株產(chǎn)苦參堿的枝頂孢屬真菌及其應(yīng)用和其發(fā)酵液的應(yīng)用。是枝頂孢屬真菌(Acremonium sp.)SA_NX E5CCTCCNO.M2012214。本發(fā)明的枝頂孢屬真菌，可以通過(guò)微生物發(fā)酵合成苦參堿等苦豆子主要有效成分，從而開(kāi)發(fā)新的微生物資源，為野生苦豆子植物資源的保護(hù)和利用提供了依據(jù)。并且本發(fā)明的枝頂孢屬真菌可直接利用真菌發(fā)酵產(chǎn)生苦參堿，與植物栽培產(chǎn)生苦參堿相比，具有效率高，周期短，不受季節(jié)、氣候、地理?xiàng)l件等因素的限制，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)證明，可通過(guò)微生物發(fā)酵合成苦參堿等苦豆子的主要有效成分。
文檔編號(hào)A01N63/04GK102746996SQ201210261938
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月26日
發(fā)明者趙清梅 申請(qǐng)人:北方民族大學(xué)