一種能夠表達(dá)人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備方法【專利摘要】本發(fā)明涉及能產(chǎn)生人抗體的小鼠的制備方法，該方法包括將攜帶包含人抗體重鏈基因座的部分片段的轉(zhuǎn)基因小鼠，與攜帶插入到小鼠基因組DNA中具有未經(jīng)重排的人抗體輕鏈基因座部分片段的小鼠雜交，所述人抗體重鏈和輕鏈基因座在轉(zhuǎn)基因小鼠中可以進(jìn)行基因重排和基因轉(zhuǎn)變，以產(chǎn)生各種人源免疫球蛋白。其中小鼠內(nèi)源抗體重鏈基因座、小鼠內(nèi)源抗體κ輕鏈基因座和Lamda輕鏈基因座被失活?！緦＠f明】一種能夠表達(dá)人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及的是一種產(chǎn)生人抗體的小鼠的制備方法。【
背景技術(shù)：
】[0002]由細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲導(dǎo)致的感染性疾病的治療很大程度基于抗生素的治療。然而，抗藥性的出現(xiàn)要求不斷開發(fā)新的抗生素。患有惡性疾病和癌癥的患者的治療主要基于化療，然而，這些治療中的許多是無效的，并且患者的死亡率高，對(duì)于感染性疾病和癌癥，需要改進(jìn)和創(chuàng)新的治療。抗移植器官排斥的甾體類治療需要使用生物試劑(單克隆或多克隆抗體制劑)，該生物試劑在移植受體中逆轉(zhuǎn)正在進(jìn)行的同種異體免疫應(yīng)答。從動(dòng)物獲得的抗體制劑的主要問題是人類患者中非人免疫球蛋白的免疫原性。為了減少非人免疫球蛋白的免疫原性，提出了在動(dòng)物中對(duì)抗體基因進(jìn)行改構(gòu).例如，已經(jīng)證明通過融合鼠源抗體可變(V)區(qū)外顯子和人恒定(C)區(qū)外顯子，可以獲得嵌合抗體基因。然而，該方法只能去除由非人Fe區(qū)導(dǎo)致的免疫原性，而其余的非人Fab序列仍然可以是免疫原性的。在另一種方法中，將人免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因?qū)肓诵∈蠡蚪M中。已經(jīng)有幾種將人免疫球蛋白基因?qū)胄∈蠡蚪M中使人各種抗體所有組成組件在基因工程化小鼠中的表達(dá)的方法。我們提供了一種利用細(xì)菌人工染色體載體(BAC)將人免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因?qū)肓诵∈蠡蚪M中的方法。在小鼠血清中可以檢測(cè)到人抗體的分泌。【
發(fā)明內(nèi)容】[0003]本發(fā)明提供包含兩個(gè)人免疫球蛋白基因座部分片段的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動(dòng)物，其中所述兩個(gè)人免疫球蛋白基因座中的一個(gè)是人重鏈基因座，而另一個(gè)基因座是人輕鏈基因座的。在某些轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動(dòng)物中，所述人免疫球蛋白基因座包含人類14號(hào)和2號(hào)染色體的片段，所述人免疫球蛋白重鏈與輕鏈基因座隨機(jī)整合在非人哺乳動(dòng)物基因組DNA中。在這些轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動(dòng)物中，所述人重鏈和輕鏈基因座的被克隆到細(xì)菌人工染色體(BAC)載體中，所克隆的人免疫球蛋白重鏈基因座部分片段包含至少一個(gè)非重組過的可變區(qū)基因(V)、D區(qū)基因(D)、連接區(qū)基因(J)和恒定區(qū)基因(C)以及重鏈基因座的3增強(qiáng)子核心序列，所述序列可以在不同的BAC載體中。所克隆的人免疫球蛋白輕鏈基因座部分片段包含至少一個(gè)非重組過的可變區(qū)基因(V)、連接區(qū)基因(J)和恒定區(qū)基因(C)以及輕鏈基因座的3增強(qiáng)子核心序列，所述序列可以在不同的BAC載體中。在某些轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動(dòng)物中，所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動(dòng)物是小鼠。在轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動(dòng)物中，所述內(nèi)源哺乳動(dòng)物重鏈基因座和至少一個(gè)哺乳動(dòng)物輕鏈基因座被失活。在某些這樣的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動(dòng)物中，所述內(nèi)源哺乳動(dòng)物重鏈基因座(IgH)和K輕鏈基因座(IgK)和Lamda輕鏈基因座(IgL)被失活。[0004]本發(fā)明還提供檢測(cè)轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物血清中人抗體表達(dá)的方法，所述方法包括:小鼠血清的制備，酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)的方法檢測(cè)小鼠血清中人抗體IgM的濃度。[0005]本發(fā)明還提供用于產(chǎn)生多種表達(dá)人抗體序列的B細(xì)胞的方法，所述方法包括:提供包含兩個(gè)人免疫球蛋白基因座部分序列的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動(dòng)物，其中所述兩個(gè)人免疫球蛋白基因座中的一個(gè)是人重鏈基因座，而另一個(gè)基因座是人輕鏈基因座；并且其中所述基因座中至少一個(gè)是由BAC載體導(dǎo)入的；并且對(duì)所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動(dòng)物免疫，可以產(chǎn)生多種表達(dá)人抗體序列的B細(xì)胞并收集多種表達(dá)人抗體表達(dá)序列的B細(xì)胞。這些方法還包括使所述多種B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合形成可以分泌人單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的方法。其它這樣的方法還包括從所述雜交瘤細(xì)胞中克隆和純化所述人抗體序列，所述編碼人抗體的序列是全長(zhǎng)的。在某些方法中，所述編碼人抗體的序列在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)。在某些這樣的方法中，所述人輕鏈基因座包含得自天然人K輕鏈基因座的未經(jīng)重排的序列。在某些這樣的方法中，所述人K輕鏈基因座是插入的BAC載體介導(dǎo)的人輕鏈基因座片段轉(zhuǎn)基因。在某些這樣的方法中，所述多種B細(xì)胞至少包含編碼具有選自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM中某種抗體類型的B細(xì)胞。在某些方法中，所述IgA同種型是IgAl或IgA2。在某些方法中，所述IgG同種型是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。在某些這樣的方法中，所述多種B細(xì)胞至少包含編碼具有選自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的不同于所述第一同種型的第二同種型的抗體的第二B細(xì)胞。在某些方法中，所述多種B細(xì)胞至少包含5種B細(xì)胞，每種B細(xì)胞編碼一種具有不同同種型的抗體，其中所述抗體的類型分別為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。[0006]本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了改進(jìn)的BAC轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體或載體，所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體或載體含有至少一種人抗體重鏈和輕鏈基因座的部分片段，其中該片段或片段的部分經(jīng)或未經(jīng)基因修飾而含有至少一種人抗體重鏈和輕鏈基因座的片段。這些片段具有在非人動(dòng)物中進(jìn)行基因重排和基因突變的能力，從而產(chǎn)生多樣的人源免疫球蛋白所有組成成分.[0007]本發(fā)明提供的一種人源Ig基因座是含有一個(gè)或多個(gè)V基因片段、一個(gè)或多個(gè)D基因片段、一個(gè)或多個(gè)J基因片段、以及一個(gè)或多個(gè)恒定區(qū)基因片段的人源化重鏈基因座，其中至少一個(gè)基因片段是人重鏈基因片段。人源化重鏈基因座中的基因片段以未重排、部分或完全重排的構(gòu)型彼此并列。優(yōu)選的人源化重鏈基因座含有人恒定區(qū)基因片段，優(yōu)選含Ca或Cy。更優(yōu)選的人源化基因座含有多個(gè)V基因片段和至少一個(gè)人V基因片段，以及一個(gè)人重鏈恒定區(qū)片段。人V基因片段位于非人V基因片段下游。[0008]另一種人源Ig基因座是含有一個(gè)或多個(gè)V基因片段、一個(gè)或多個(gè)J基因片段、以及一個(gè)或多個(gè)恒定區(qū)基因片段的人源化輕鏈基因座，其中至少一個(gè)基因片段是人輕鏈基因片段。人源化輕鏈基因座中的基因片段以未重排或重排的構(gòu)型彼此并列.優(yōu)選的人源化輕鏈基因座含有人恒定區(qū)基因片段，優(yōu)選含Ca或Cy。更優(yōu)選的人源化輕鏈基因座進(jìn)一步含有多個(gè)V基因片段和至少一個(gè)人V基因片段。人V基因片段位于非人V基因片段下游。甚至更優(yōu)選的人源化輕鏈基因座含重排的人VJ片段，置于許多(如10-100)非人或人來源的VL基因片段下游。[0009]本發(fā)明的另一種實(shí)施方案涉及通過從非人動(dòng)物分離Ig基因座或Ig基因座的一部分，并且將需要的人Ig基因片段整合至分離的動(dòng)物Ig基因座或Ig基因座的分離部分而制備含人源化Ig基因座的轉(zhuǎn)基因載體的方法。通過以保持基因座在非人動(dòng)物中進(jìn)行有效基因重排和基因轉(zhuǎn)變的方式進(jìn)行連接或同源重組，將人Ig基因片段整合至分離的動(dòng)物Ig基因座或Ig基因座的分離部分。通過同源重組進(jìn)行的人Ig基因片段的整合可以通過使用本發(fā)明的重組載體而完成。[0010]在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備能夠產(chǎn)生人源抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以通過將含人源Ig基因座的轉(zhuǎn)基因載體或含人Ig基因片段的重組載體導(dǎo)入受體細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞，并且從基因修飾的受體細(xì)胞或細(xì)胞得到動(dòng)物而獲得。[0011]提供了含一種或多種人源Ig基因座的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和來源于所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞(例如來自于免疫的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的B細(xì)胞).本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以對(duì)轉(zhuǎn)基因的人源Ig基因座進(jìn)行基因重排和基因轉(zhuǎn)變，以產(chǎn)生多樣的人源免疫球蛋白分子所有組成成分。[0012]人免疫球蛋白重鏈基因座位于人14號(hào)染色體上，全長(zhǎng)1.5mb，有50個(gè)左右的可變區(qū)基因，D區(qū)和J區(qū)基因以及9種恒定區(qū)(C)區(qū)基因組成。用于顯微注射的BAC克隆I為人工構(gòu)建的含6個(gè)可變區(qū)基因的Ig序列；BAC2和BAC3分別帶有原始的和/或人工構(gòu)建的人抗體重鏈基因座D區(qū)、J區(qū)和C區(qū)基因序列，可以帶有人工克隆的人抗體重鏈基因座3‘_增強(qiáng)子核心序列或基因組序列(紅色部分)(見圖1)。[0013]人免疫球蛋白輕鏈基因座K位于人2號(hào)染色體上，由多個(gè)V區(qū)基因、J區(qū)基因和I個(gè)C區(qū)基因組成。BAC3是人工構(gòu)建的帶有6個(gè)人抗體輕鏈基因座Kappa(IgK)可變區(qū)基因的DNA序列，BAC4是帶有原始的和/或人工構(gòu)建的帶有人輕鏈基因座Kappa(IgK)J區(qū)和C區(qū)的DNA序列，可以帶有人工構(gòu)建的人抗體輕鏈基因座(IgK)3’_端增強(qiáng)子核心序列或基因組序列(如圖2所示)[0014]經(jīng)純化的BACDNA在脈沖場(chǎng)凝膠電泳場(chǎng)中分離鑒定其大約濃度和完整性。這個(gè)純化的BACDNA分子帶有人抗體重鏈基因座中的D區(qū)和J區(qū)基因(如圖3所示)。[0015]4號(hào)、5號(hào)和7號(hào)轉(zhuǎn)基因小鼠同時(shí)帶有人人抗體重鏈和輕鏈基因座片段(如圖4、圖5所示)。[0016]3只小鼠血清中中人IgM的濃度分別達(dá)到36.5ug/ml,44.lug/ml和45.7ug/ml(如圖6所示)。[0017]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了可以產(chǎn)生人源免疫球蛋白(抗體)的轉(zhuǎn)基因小鼠。[0018]“人源抗體”或“人源免疫球蛋白”表示具有完全人免疫球蛋白多肽序列(或由人Ig基因片敷編碼的多肽序列)的免疫球蛋白分子。本發(fā)明的人源免疫球蛋白分子可以從經(jīng)基因工程化而產(chǎn)生人源免疫球蛋白分子的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物中分離。相對(duì)于從動(dòng)物制備或從來源于動(dòng)物的細(xì)胞制備的非人源免疫球蛋白，這些人源免疫球蛋白分子對(duì)靈長(zhǎng)類動(dòng)物，特別是人的免疫原性較低。[0019]此處用到的“非人哺乳動(dòng)物”包括，但不限于，大鼠、小鼠、兔、豬、綿羊、山羊、牛和馬。優(yōu)選的非人哺乳動(dòng)物是主要依賴于組成抗體各組分，如V區(qū)、D區(qū)、J區(qū)和C區(qū)的基因重排，基因轉(zhuǎn)變和或體細(xì)胞超變而產(chǎn)生抗體多樣性的哺乳動(dòng)物，如小鼠、大鼠、兔、豬、綿羊、山羊、和牛。特別優(yōu)選的非人動(dòng)物是小鼠和大鼠。[0020]在人和小鼠等動(dòng)物中，在重鏈基因座上有多個(gè)拷貝的V，D(只在重鏈基因座中)和J基因片段，在輕鏈基因座上有多個(gè)拷貝的V和J基因片段。這些動(dòng)物中的抗體多樣性主要由基因重排產(chǎn)生，即由基因片段的不同組合形成重排的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。重排的Ig基因的進(jìn)一步多樣化通過基因轉(zhuǎn)變而完成，基因轉(zhuǎn)變是一種過程，其中來源于上游V基因片段的短序列替代了重排Ig基因中V基因片段內(nèi)的短序列。[0021]此處用到的“Ig基因片段精是指編碼Ig分子各部分的DNA的片段及非編碼的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列，這些片段存在于動(dòng)物和人的種系中，并且一起進(jìn)入B細(xì)胞以形成重排的Ig基因。因此，此處用到的Ig基因片段包括V基因片段、D基因片段(輕鏈基因座中不含)、J基因片段和C區(qū)基因片段，以及非編碼的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列。[0022]本發(fā)明的優(yōu)選人源抗體來自于轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，該動(dòng)物的抗體多樣性主要由基因重排和基因突變產(chǎn)生，該動(dòng)物如大鼠、小鼠、兔、綿羊和牛；優(yōu)選為小鼠。[0023]一旦制備了能夠產(chǎn)生多樣化的人源免疫球蛋白分子的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，通過用抗原免疫該動(dòng)物就可以容易獲得抗該抗原的人源免疫球蛋白和人源抗體制劑.可以用各種抗原免疫轉(zhuǎn)基因宿主動(dòng)物。這些抗原包括，存活的、減毒的或死亡的微生物，如病毒和單細(xì)胞生物(如細(xì)菌和真菌)，微生物片段或從微生物分離的抗原性分子。[0024]可以采用任意方便的方式將這些抗原可以給予轉(zhuǎn)基因宿主動(dòng)物，可以使用或不使用佐劑，并且可以根據(jù)預(yù)定的方式給藥。[0025]免疫后，可以對(duì)被免疫的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的血清進(jìn)行分級(jí)分離，以便純化特異于抗原的藥物級(jí)多克隆抗體，可以通過層析(親和層析、離子交換層析、凝膠過濾層析等)，用硫酸銨等鹽、乙醇等有機(jī)溶劑或聚乙二醇等聚合物進(jìn)行選擇性沉淀而獲得濃縮的、純化的免疫球蛋白級(jí)分。[0026]為制備單克隆抗體，從被免疫的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分離脾細(xì)胞，用于與轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系融合產(chǎn)生雜交瘤，或通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)克隆編碼抗體的cDNA并且在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)。制備單克隆抗體的程序是本領(lǐng)域公知的。例如歐洲專利申請(qǐng)O583980Al("MethodForGeneratingMonoclonalAntibodiesFromRabbits”)，美國(guó)專利N0.4,977,081("StableRabbit-MouseHybridomasAndSecretionProductsThereof”)，WO97/16537("StableChickenB-cellLineAndMethodofUseThereofu).和EP049105781(uHybridomaWhichProducesAvianSpecificImmunoglobulinGu),在此引入其公開內(nèi)容作為參考，從克隆的cDNA分子體外產(chǎn)生單克隆抗體的方法描述于Andris-ffidhopfetal.,"Methodsforthegenerationofchickenmonoclonalantibodyfragmentsbyphagedisplay",TmmunolMethods242:159(2000),和Burton,D.R.,"Phagedisplay"，Immunotechnology1:87(1995),在此引入其公開內(nèi)容作為參考。[0027]本發(fā)明進(jìn)一步涉及新的核苷酸序列和載體，以及該序列扣載體在制備產(chǎn)生人源化免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物中的用途。簡(jiǎn)言之，非人哺乳動(dòng)物的基因工程包括將一個(gè)或多個(gè)人Ig基因片段整合至動(dòng)物基因組，以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)人源Ig基因座。應(yīng)該理解的是，根據(jù)基因修飾中所使用的方法，人Ig基因片段可以被整合在動(dòng)物的內(nèi)源性Ig基因座(例如作為定向插入的結(jié)果)，或整合在動(dòng)物的不同基因座。也就是說，人源Ig基因座可以位于動(dòng)物內(nèi)源性Ig基因座通常所在的染色體位置，或位于動(dòng)物內(nèi)源性Ig基因座通常所在位置以外的染色體位置。不論在染色體上的什么位置，本發(fā)明的人源Ig基因座具有在非人哺乳動(dòng)物中進(jìn)行基因重排和基因轉(zhuǎn)變的能力，從而能夠產(chǎn)生多樣化的人源化免疫球蛋白分子所有組成成分。具有進(jìn)行基因重排和基因轉(zhuǎn)變的能力的Ig基因座此處也稱作“功能性”Ig基因座，由功能性Ig基因座產(chǎn)生的具有多樣性的抗體此處也稱作“功能性抗體”。[0028]在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含人源Ig重鏈基因座的轉(zhuǎn)基因載體，所述人源Ig重鏈基因座含有一個(gè)或多個(gè)V基因片段、一個(gè)或多個(gè)D基因片段、一個(gè)或多個(gè)J基因片段、以及一個(gè)或多個(gè)恒定區(qū)基因片段，一個(gè)或多個(gè)3端增強(qiáng)子的核心序列。這種人源重鏈基因座中的基因片段是未經(jīng)重排的基因組序列。人源重鏈基因座在非人動(dòng)物中具有進(jìn)行基因重排(如果基因片段沒有完全重排)和基因轉(zhuǎn)變的能力，從而產(chǎn)生具有人多肽序列的多樣化的重鏈所有組成成分，或“人源重鏈”。[0029]在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，人源重鏈基因座含有5種C區(qū)基因片段，該片段為人恒定區(qū)基因片段，分別為C、C、C，C和C(包括C亞類1，2，3和4的任意一種)。[0030]在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含人源輕鏈基因座的轉(zhuǎn)基因載體，所述人源輕鏈基因座能夠在宿主動(dòng)物中進(jìn)行基因重排和基因轉(zhuǎn)變，從而產(chǎn)生具有人多肽序列的多樣化的輕鏈所有組成成分，或“人源輕鏈”。[0031]人源輕鏈基因座含有一個(gè)或多個(gè)V基因片段、一個(gè)或多個(gè)J基因片段、以及一個(gè)或多個(gè)恒定區(qū)基因片段。這種人源輕鏈基因座中的基因片段以未重排的方式彼此并列。[0032]在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，人源輕鏈基因座含有至少一種C區(qū)基因片段，該片段為人恒定區(qū)基因片段，優(yōu)選為C。[0033]本發(fā)明的另一方面涉及制備含人源Ig基因座的轉(zhuǎn)基因載體的方法。這些方法包括從人基因組DNA中分離人Ig基因座或其一部分，并將這些DNA片段連接成具有有效基因重排和基因轉(zhuǎn)變的能力的人源Ig基因座的方法。[0034]優(yōu)選地，這些大的DNA片段可以通過篩選從人基因組DNA制備的質(zhì)粒、粘粒、YACs或BACs等文庫(kù)而分離。具有功能的的人源Ig基因座可以包含在一個(gè)或多個(gè)質(zhì)?；蛘沉？寺≈?。YAC克隆可以攜帶最多至2兆堿基的DNA片段，因此完整的人重鏈基因座和輕鏈基因座可以在一個(gè)YAC克隆中分離。BAC克隆攜帶的DNA片段較小，約150_250kb，而且操作簡(jiǎn)便，因此含Ig基因座的重·疊片段的多個(gè)BAC克隆可以被同時(shí)注射至動(dòng)物受精卵細(xì)胞，其中重疊片段整和到動(dòng)物基因組中后可以重組,從而產(chǎn)生完整的Ig基因座,其中的各DNA組分可以通過基因重排和基因轉(zhuǎn)變導(dǎo)致多樣化的人源抗體所有組成成分的產(chǎn)生。[0035]可以通過各種方法將人Ig基因片段整合至載體(如BAC克隆)上的Ig基因座中，所述方法包括通過同源重組連接DNA片段或采用經(jīng)典的分子生物學(xué)方法將不同的片段插入到BAC載體中。[0036]優(yōu)選地，通過同源重組將人Ig基因片段整合至Ig基因座中.同源重組可以在細(xì)菌、酵母和其它細(xì)胞中通過高頻率的重組事件而進(jìn)行。例如，用含有人Ig基因座或其大部分的BAC轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞。隨后，用前面所描述的重組載體進(jìn)一步轉(zhuǎn)化所述大腸桿菌細(xì)胞，該載體攜帶與人的可變區(qū)序列或3’-端增強(qiáng)子序列。重組載體中的5和3’-端序列與BAC上的人Ig基因片段的側(cè)翼序列同源。作為同源重組的結(jié)果，可以形成有基本功能的人Ig基因座。人源的YACs和BACs可以容易從細(xì)胞分離，并且用于制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。[0037]在本發(fā)明的另一方面，提供了制備能夠產(chǎn)生人源免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。[0038]根據(jù)本發(fā)明，可以將上述一種或多種攜帶人源Ig基因座的轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)受體細(xì)胞，并且從一個(gè)或多個(gè)受體細(xì)胞衍生動(dòng)物，然后通過隨機(jī)整合或定向整合而整合至一個(gè)或多個(gè)受體細(xì)胞的基因組，從而制備能夠產(chǎn)生人源免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。[0039]對(duì)于隨機(jī)整合，可以通過標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將舍有人源Ig基因座的轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入動(dòng)物的受體細(xì)胞。例如，可以將轉(zhuǎn)基因載體直接注射至受精卵的原核中。也可以通過在卵受精之前將精子與轉(zhuǎn)基因載體共孵育而導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因載體。可以從受精卵發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因載體的另一種方式是通過轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞(ES)或誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPS)并且隨后將基因修飾的胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPS)注射至發(fā)育中的胚胎。替代地，可以直接將轉(zhuǎn)基因載體(裸露的或與促進(jìn)劑結(jié)合)注射至發(fā)育中的胚胎。最終，從含有整合至轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的至少一些體細(xì)胞的基因組中的人源Ig轉(zhuǎn)基因的胚胎產(chǎn)生嵌合的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。[0040]在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，將含有人源Ig基因座的轉(zhuǎn)基因隨機(jī)整合至來源于內(nèi)源性免疫球蛋白基因失活的動(dòng)物的受體細(xì)胞(如受精卵或發(fā)育中的胚胎)的基因組中。這些動(dòng)物的使用允許來自于人源轉(zhuǎn)基因Ig基因座的免疫球蛋白分子的優(yōu)先表達(dá)。這些動(dòng)物的例子包括Alicia和Basilea兔，內(nèi)源性抗體重鏈和輕鏈基因座敲除的小鼠和大鼠等?？梢允咕哂腥嗽疵庖咔虻鞍邹D(zhuǎn)基因或基因座的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與內(nèi)源性免疫球蛋白表達(dá)受損的動(dòng)物交配，獲得對(duì)于失活的內(nèi)源性Ig基因座和人源轉(zhuǎn)基因Ig基因座為整合的后代。[0041]對(duì)于定向整合，可以將轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)膭?dòng)物受體細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞或已經(jīng)分化的體細(xì)胞。此后，可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法選擇其中的轉(zhuǎn)基因被整合至動(dòng)物基因組并且通過同源重組被相應(yīng)的內(nèi)源性Ig基因座替代的細(xì)胞。然后可以將所選擇的細(xì)胞與去核的受體細(xì)胞，如卵母細(xì)胞融合，這些細(xì)胞為全能的，可以形成有功能的新生動(dòng)物。然后將得到的卵的細(xì)胞收獲于適當(dāng)培養(yǎng)基中，并且轉(zhuǎn)移至同步的受體中，用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。替代地，可以將所選擇的基因修飾的細(xì)胞注射至發(fā)育中的胚胎，該胚胎隨后發(fā)育成嵌合動(dòng)物。[0042]類似于轉(zhuǎn)基因載體的定向插入，適于作為該方法中的受體細(xì)胞的細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞或已經(jīng)分化的體細(xì)胞。攜帶人Ig基因片段的重組載體可以通過任何可行的方法，如轉(zhuǎn)染，被導(dǎo)入這些受體細(xì)胞中。此后，可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法選擇其中通過同源重組用人Ig基因片段取代了相應(yīng)的內(nèi)源性Ig基因片段的細(xì)胞。這些基因修飾的細(xì)胞可以作為核轉(zhuǎn)移程序中的核供體細(xì)胞，用于克隆轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。替代地，可以將所選擇的基因修飾的胚胎干細(xì)胞注射至發(fā)育中的胚胎，該胚胎隨后發(fā)育成嵌合動(dòng)物。[0043]由前述任一種方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物形成了本發(fā)明的另一種實(shí)施方案。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在基因組中具有至少一個(gè)，即一個(gè)或多個(gè)人源Ig基因座，由其產(chǎn)生功能性的人源抗體所有組成成分。[0044]在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了基因組中具有一個(gè)或多個(gè)人源Ig基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠可以對(duì)人源Ig基因座進(jìn)行重排和基因轉(zhuǎn)變，并且表達(dá)功能性的人源抗體所有組成成分。[0045]來自于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞，如來自于用一種抗原免疫的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物所建立的B細(xì)胞或細(xì)胞系也是本發(fā)明的一部分?！緦＠綀D】【附圖說明】[0046]圖1:人抗體重鏈基因座的結(jié)構(gòu)，人免疫球蛋白重鏈基因座位于人14號(hào)染色體上，全長(zhǎng)1.5mb，有50個(gè)左右的可變區(qū)基因，D區(qū)和J區(qū)基因以及9種恒定區(qū)(C)區(qū)基因組成。[0047]圖2:人抗體輕鏈基因座IgK的結(jié)構(gòu)，人免疫球蛋白輕鏈基因座K位于人2號(hào)染色體上，由多個(gè)V區(qū)基因、J區(qū)基因和I個(gè)C區(qū)基因組成。[0048]圖3:脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法檢測(cè)純化的BACDNA,經(jīng)純化的BACDNA在脈沖場(chǎng)凝膠電泳場(chǎng)中分離鑒定其大約濃度和完整性。[0049]圖4:人抗體輕鏈基因座轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR檢測(cè)。[0050]圖5:人抗體重鏈基因座轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR檢測(cè)。[0051]圖6:人抗體IgM在轉(zhuǎn)基因小鼠血清中的平均濃度檢測(cè)，3只小鼠血清中人IgM的濃度分別達(dá)到36.5ug/ml,44.lug/ml和45.7ug/ml【具體實(shí)施方式】[0052]實(shí)施例1[0053]含有人抗體基因座BACDNA的純化[0054]UBAC菌種小培養(yǎng)。挑取劃線單菌落接種到15mL離心管中，培養(yǎng)體積3mL，管蓋略松。200rpm，30°C培養(yǎng)16-20h。氯霉素終濃度12.5ug/mL。[0055]2、BAC菌種大培養(yǎng)。將小培養(yǎng)的菌液按照1:500的比例接種到搖瓶中，培養(yǎng)體積400mL，200rpm,30°C培養(yǎng)16_20h。氯霉素終濃度12.5ug/mL。[0056]3、使用MN試劑盒大提BACDNA。相關(guān)步驟參照《Endoto-freePlasmidDNAPurificationUserManual—NucleobondXtraMidiEF))?BACDNA放4°C保存。[0057]4、使用Nanodrop測(cè)量提取的BACDNA濃度。PFGE分析。[0058]5、純化的BACDNA可以直接進(jìn)行顯微注射，或者線性化以后，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后用于顯微注射。例如，可以采用NotI(選用高濃度，50000U/uL)過夜酶切BACDNA,酶切體系不超過300uL，底物BACDNA應(yīng)20_30ug。每Iug底物對(duì)應(yīng)5U的酶量。[0059]BACDNA的顯微注射[0060]1、受精卵的準(zhǔn)備:[0061]將可育雌鼠注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)與人絨毛促性腺激素(HCG)后，與可育雄鼠交配從而得到超排卵。次日從輸卵管內(nèi)收集受精卵備用。[0062]2、假孕母鼠的準(zhǔn)備:[0063]同時(shí)，將可育雌鼠與輸精管結(jié)扎后絕育的雄鼠交配，刺激雌鼠發(fā)生一系列妊娠變化而得到假孕母鼠作為轉(zhuǎn)基因后受精卵的代孕母親。[0064]3、顯微注射得到轉(zhuǎn)基因受精卵:[0065]顯微注射裝置中的固定針利用負(fù)壓將受精卵固定，注射針同時(shí)將純化的BACDNA導(dǎo)入受精卵雄性原核內(nèi)，，注射濃度為0.5-lng/ml。若見雄性原核膨脹，則成功完成一次顯微注射。[0066]4、胚胎移植:[0067]將已成功轉(zhuǎn)入基因的受精卵移入假孕母鼠身體兩側(cè)的輸卵管內(nèi)(20卵/側(cè))，使胚胎在代孕母體內(nèi)發(fā)育，經(jīng)一個(gè)完整的發(fā)育周期則會(huì)產(chǎn)下小鼠。[0068]轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR檢測(cè)[0069]剪去0.5厘米大小的15-21天大的小鼠尾巴，用眼科剪充分剪碎后，加500微升含有50微克/毫升蛋白酶K的消化緩沖液，55度消化過夜。加入等體積的Tris平衡的苯酚抽提，4度10000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，取上清加入等體積的氯仿/異戊醇抽提，4度10000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，取上清加2倍體積無水乙醇，4度10000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，去上清，DNA沉淀用I毫升70%乙醇洗滌后晾干，用500微升TE溶液或水溶解，4度保存。[0070]取2微升DNA用于轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR鑒定，重鏈檢測(cè)引物為primer_F:ggactgttgaagccttcgg和PrimmerR:ggttcttggacgtgtctactg,輕鏈檢測(cè)引物為PClprimer-F:gagaagtggcaagacagtgatc和PCIprimer-R:agatgggacacttacaggtgtg。PCR反應(yīng)體系如下:[0071]DNA2ul[0072]IOXPCR緩沖液5ul[0073]IOmM的dNTPIul[0074]20uM引物混合物2ul[0075]TaqDNA聚合酶0.5ul[0076]水補(bǔ)至總體積50ul。[0077]PCR條件:94度40秒，56度40秒，72度40秒，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖電泳方法進(jìn)行鑒定。共鑒定出同時(shí)含有人重鏈和輕鏈基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠3只(圖4)。[0078]轉(zhuǎn)基因小鼠中人IgM濃度的檢測(cè)[0079]通過小鼠的眼眶用毛細(xì)管取血100微升，室溫放置1-2小時(shí)使血液凝固，2000轉(zhuǎn)/分鐘4度離心10分鐘分離血清。取上層血清并置于一個(gè)干凈的1.5毫升離心管中，4度保存?zhèn)溆?。[0080]按照人IgM檢測(cè)試劑盒說明書的要求，使用試劑盒提供的人IgM標(biāo)準(zhǔn)品建立0，1，5，10，50，100微克/毫升的標(biāo)準(zhǔn)曲線孔，取50微升小鼠血清加入已包被抗人IgM抗體的96孔板的樣品孔中，37度孵育I小時(shí)，PBS-土溫20緩沖液洗滌96孔板5_7次，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的人IgM，37度孵育I小時(shí)，PBS-土溫20緩沖液洗滌96孔板5_7次后，扣干96孔板,加入50微升顯色液,室溫避光放置15-20分鐘,加入50微升終止液,在酶標(biāo)儀上讀取數(shù)據(jù)并計(jì)算人IgM在轉(zhuǎn)基因小鼠血清中的濃度。三只轉(zhuǎn)基因小鼠的血清中人IgM的表達(dá)水平分別為36.5ug/ml，44.lug/ml和45.7ug/ml(圖5)。[0081]轉(zhuǎn)基因小鼠B細(xì)胞的分離[0082]取小鼠脾臟加PBS后研磨,過200目細(xì)胞篩,濾過細(xì)胞懸液1500轉(zhuǎn)/分鐘室溫離心5分鐘，加10毫升PBS洗滌，再次離心后，沉淀用PBS重懸，則大部分細(xì)胞為小鼠B細(xì)胞。還可以使用磁珠法和流式細(xì)胞分選法，利用B細(xì)胞表面的特異標(biāo)志分子，如CD19抗原，采用生物素標(biāo)記或熒光標(biāo)記的抗小鼠CD19抗體進(jìn)行純化。獲得的B細(xì)胞可以與骨髓瘤細(xì)胞融合制備分泌人單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株?！緳?quán)利要求】1.能產(chǎn)生人抗體的小鼠的制備方法，所述小鼠攜帶轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因已經(jīng)插入到小鼠基因組DNA中且具有未經(jīng)重排是人抗體重鏈和輕鏈基因座，該方法包括將攜帶包含人抗體重鏈基因座的部分片段的轉(zhuǎn)基因小鼠，與攜帶插入到小鼠基因組DNA中具有未經(jīng)重排的人抗體輕鏈基因座部分片段的小鼠雜交，所述人抗體重鏈和輕鏈基因座在轉(zhuǎn)基因小鼠中可以進(jìn)行基因重排和基因轉(zhuǎn)變，以產(chǎn)生各種人源免疫球蛋白。其中小鼠內(nèi)源抗體重鏈基因座、小鼠內(nèi)源抗體K輕鏈基因座和Lamda輕鏈基因座被失活。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因是含未經(jīng)重排的人抗體重鏈基因座的部分片段，被克隆到人細(xì)菌人工染色體(BAC)中，并導(dǎo)入小鼠基因組中。3.權(quán)利要求1的方法，其中具有未經(jīng)重排的人抗體輕鏈基因座的轉(zhuǎn)基因的用BAC載體導(dǎo)入小鼠基因組中。4.權(quán)利要求1的方法，其中未經(jīng)重排的人抗體輕鏈基因座片段是人抗體輕鏈K基因座片段。5.權(quán)利要求1的方法，所述小鼠來自于人抗體重鏈基因座轉(zhuǎn)基因小鼠和人抗體K輕鏈基因座轉(zhuǎn)基因小鼠的雜交，其中小鼠內(nèi)源抗體重鏈基因座和抗體K輕鏈基因座和/或Lamda輕鏈基因座(IgL)被失活。6.權(quán)利要求1的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因小鼠的制備方法，可以通過所述人抗體受精卵的顯微注射的方法獲得。7.權(quán)利要求1的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因小鼠的制備方法，可以通過對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞(ES)、誘導(dǎo)型干細(xì)胞(iPS)或體細(xì)胞(如皮膚成纖維細(xì)胞)的轉(zhuǎn)染而獲得?！疚臋n編號(hào)】A01K67/027GK103571872SQ201210281415【公開日】2014年2月12日申請(qǐng)日期:2012年8月9日優(yōu)先權(quán)日:2012年8月9日【發(fā)明者】馮東曉,戴潔,張卉,徐從倫,董創(chuàng)創(chuàng),劉紅申請(qǐng)人:山東國(guó)際生物科技園發(fā)展有限公司