專利名稱：一株解淀粉芽孢桿菌及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及食用菌栽培領域，具體涉及一種解淀粉芽孢桿菌及其用途。
背景技術：
食用菌病害分為真菌、細菌、線蟲、病毒等病原物侵染引起的侵染性病害和不良理化因子引起的生理性病害。生產(chǎn)過程中常見的真菌病害有蘑菇疣孢病害、食用菌木霉病害、青霉病害、毛霉病害、根霉病害、曲霉病害以及鏈孢霉病害等。真菌病害喜高溫、高濕、通風不良及偏酸性環(huán)境，病菌孢子靠氣流、噴水及人工操作等方式傳播。其危害極其嚴重，給菇農(nóng)和工廠化食用菌的栽培造成了巨大的經(jīng)濟損失。金針菇、杏鮑菇等多種食用菌生產(chǎn)的工廠化生產(chǎn)采用了機械化操作，對菇類生長環(huán)境進行人工控制，實現(xiàn)了周年化生產(chǎn)。但是因為其栽培環(huán)境相對封閉，為各種病蟲害的大 規(guī)模爆發(fā)提供了環(huán)境條件。金針菇軟腐病是造成金針菇大量減產(chǎn)的真菌病害之一。其病原菌為異形枝葡孢(Cladabotryan varium),以分生孢子方式進行傳播。一般先在金針燕基部發(fā)病，剛開始呈褐色水浸狀斑點，以后擴大產(chǎn)生白色絮狀氣生菌絲，金針菇組織逐漸軟腐，其上覆蓋一層白色絮狀分生孢子堆。金針菇工廠化栽培過程中，毛霉也是主要致病菌之一，常發(fā)生在菌瓶接種后的菌絲生長階段和子實體生長階段，與金針菇菌絲爭奪養(yǎng)分和水分，從而使金針菇菌絲生長受到抑制。受污染的培養(yǎng)料，初期生長出灰白色而粗壯稀疏的菌絲，其生長速度快于金針菇的菌絲。后期氣生菌絲頂端形成很多圓形的小顆粒體(孢子囊)。孢子囊初為黃白色，后變?yōu)楹谏?。一旦污染很難徹底清除，常引起大面的菌瓶報廢，經(jīng)濟損失很大。木霉是一種常見的食用菌真菌病害，它可侵染香菇、銀耳、杏鮑菇、毛木耳、靈芝、金針菇等多種食用菌，各種食用菌的菌種、菌筒、栽培料和子實體上均可發(fā)病，如香菇受害后菌柄和菌蓋背面變褐腐爛，病部產(chǎn)生綠色霉層；銀耳早期染病的子實體萎縮不長，后期感染的子實體逐漸腐爛，產(chǎn)量損失巨大；金針菇菌瓶受到污染后，培養(yǎng)料迅速被木霉菌絲覆蓋，產(chǎn)生大量的綠色孢子，導致菌瓶報廢。另外，鏈孢霉也是一種危害嚴重的真菌病害。鏈孢霉主要發(fā)生在以熟料為基質(zhì)的食用菌栽培上，以生料為基質(zhì)的栽培過程中很少發(fā)生，它的危害主要是無性繁殖的分生孢子廣泛傳播造成大面積污染。食用菌菌種感染后，橙紅色的粉狀孢子，呈團狀或球狀包住整個棉塞，也有的發(fā)生在培養(yǎng)袋底部或四周并破袋而出，形成大量的分生孢子堆，輕微的震動及空氣流動，其分生孢子便隨氣流擴散，到處飛揚傳播污染環(huán)境，如香菇菌筒一旦受到污染就直接報廢，并且在次年栽培中污染會更加嚴重；金針菇在發(fā)菌階段和子實體生長階段都會受到污染，在料面或基內(nèi)生長，抑制菌絲的生長，同時產(chǎn)生大量孢子。目前，食用菌的病害防治常采用化學藥劑，但是效果都不理想，且會污染環(huán)境和殘留于食用菌子實體上。利用生物防治病害，就能有效地避免上述缺點，因而具有廣闊的發(fā)展前途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種解淀粉芽孢桿菌。該解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株命名為B43-1,于2012年6月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號=CGMCC No. 6212。該解淀粉芽孢桿菌菌株B43-1的發(fā)酵上清液能夠抑制異形枝葡孢、毛霉、木霉、鏈孢霉等多種病原真菌引起的食用菌病害。本發(fā)明的另一目的在于提供上述解淀粉芽孢桿菌B43-1的用途能夠抑制異形枝葡孢、毛霉、木霉、鏈孢霉等多種病原真菌引起的食用菌病害。對人畜無毒，綠色環(huán)保，防治食用菌污染病害效果顯著，具有良好的生物農(nóng)藥開發(fā)前景。本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現(xiàn)一種解淀粉芽抱桿菌,保藏名稱為Bacillus amyloliquefaciens B43-1,于2012 年6月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號=CGMCCNo. 6212。其具體的鑒定如下(I)形態(tài)特征菌株在LB培養(yǎng)基上呈乳白色，半透明，表面褶皺。革蘭氏染色陽性，細胞呈桿狀，具運動性。(2)其生理生化特征見表I。(3)菌株的分子鑒定I)基于16S rDNA的序列分析以菌株B43-1 (解淀粉芽孢桿菌BaciIIusamyloliquefaciens)的總 DNA 為模板，設計通用引物8f- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG、1492r- GGTTACCTTGTTACGACTT。PCR 擴增獲得 16S rDNA，序列長度為 1511bp，在 NCBI上進行Blast序列比對，結(jié)果顯示菌株B43-1的16S rDNA與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的同源性達到99%以上。2)基于gyrA基因的序列分析以菌株B43-1的總DNA為模板，設計通用引物gyrA-F-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT, gyrA-R- CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT。PCR 擴增獲得gyrA保守基因，序列長度為1025bp。在NCBI上進行Blast序列比對，結(jié)果顯示菌株B43-1的gyrA基因與解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的gyrA基因歸為一類群。結(jié)合菌株B43-1的生理生化特征、16S rDNA及gyrA序列分析結(jié)果,證明菌株B43-1為一株解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。上述的解淀粉芽孢桿菌在抑制異形枝葡孢、毛霉、木霉和鏈孢霉中任意一種或多種病原真菌引起的食用菌病害上的應用。一種純生物菌株培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物中具有保藏號為CGMCC No. 6212的解淀粉芽孢桿菌或/和保藏號為CGMCC No. 6212的解淀粉芽孢桿菌抑制異形枝葡孢、毛霉、木霉和鏈孢霉中任意一種或多種病原真菌活性的所有鑒定特征的突變體。上述的純生物囷株培養(yǎng)物在抑制異形枝甸抱、毛霉、木霉和鏈抱霉中任意一種或多種病原真菌引起的食用菌病害上的應用。一種含有純生物菌株培養(yǎng)物的生物制劑，其在于，該純生物菌株培養(yǎng)物中具有保藏號為CGMCC No. 6212的解淀粉芽孢桿菌的菌株或/和保藏號為CGMCC No. 6212的解淀粉芽孢桿菌抑制異形枝葡孢、毛霉、木霉和鏈孢霉中任意一種或多種病原真菌活性的所有鑒定特征的突變體。一種從純生物菌株培養(yǎng)物中分離得到的代謝物，其在于，該純生物菌株培養(yǎng)物中具有保藏號為CGMCC No. 6212的解淀粉芽孢桿菌的菌株或/和具有保藏號為CGMCCNo. 6212的解淀粉芽孢桿菌抑制異形枝葡孢、毛霉、木霉和鏈孢霉中任意一種或多種病原真菌活性的所有鑒定特征的突變體。一種從純生物菌株培養(yǎng)物中分離得到的上清液，其在于，該純生物菌株培養(yǎng)物中具有保藏號為CGMCC No. 6212的解淀粉芽孢桿菌的菌株或/和具有保藏號為CGMCCNo. 6212的解淀粉芽孢桿菌抑制異形枝葡孢、毛霉、木霉或鏈孢霉中任意一種或多種病原真菌活性的所有鑒定特征的突變體。本發(fā)明的有益效果該解淀粉芽孢桿菌菌株B43-1的發(fā)酵上清液能夠抑制異形枝葡孢、毛霉、木霉、鏈 孢霉等多種病原真菌引起的食用菌病害。對人畜無毒，綠色環(huán)保，防治食用菌污染病害效果顯著，具有良好的生物農(nóng)藥開發(fā)前景。


圖I B43-1菌株的16SrDNA系統(tǒng)進化分析圖2 B43-1菌株的gyrA基因系統(tǒng)進化分析圖3 B43-1對食用菌病原菌的抑制作用A:異形枝IU抱B :毛霉C :木霉D :鏈抱霉I CK,未加任何物質(zhì)；2、4 :NB發(fā)酵上清液；3 NB培養(yǎng)基
具體實施例方式以下的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進一步的說明。但是范圍不僅限于以下的實施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明保護的范圍。一、實驗材料食用菌病原菌毛霉Mucor spp.木霉Trichodermaspp.異形枝葡抱Cladabotryanvarium鏈抱霉Neurosporaspp.以上菌株均為實驗室保存常規(guī)菌株，公眾可以獲得。實施例一、解淀粉芽孢桿菌B43-1的獲得I.采集樣品采樣全過程采取無菌操作。在攪拌室、裝瓶操作室、滅菌室、冷卻室、接種室(原種和栽培瓶)、洗菌室、培養(yǎng)室(原種和栽培瓶)、搔菌室、生育室、包裝室、挖瓶室和冷卻室等的東、南、西、北、中五個方位取點，每個點三個重復。將倒約30ml NA培養(yǎng)基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂20g，調(diào)ρΗ7· 0-7. 2，水1000ml, 121°C滅菌20min)的平板打開放置于這些采樣點30min，蓋上平板蓋，封口，置于28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天。2.分離細菌小心用接種針挑出細菌，劃線純化，于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)有形狀、大小和顏色不同的細菌菌落，則需分別挑取進一步純化，直至每個平板呈現(xiàn)形狀、大小和顏色均相同的細菌菌落；
3.篩選拮抗菌將上述4種食用菌病原菌點接于PDA培養(yǎng)基平板中心，病原菌周圍約等距離四點點接已純化的細菌，于25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1-2天觀察抑菌情況，發(fā)現(xiàn)細菌周圍出現(xiàn)抑制圈，即為目標細囷。結(jié)果從中師選出一株對上述4種食用囷病原囷均具有明顯抑菌效果的菌株，命名為B43-1。4.保存將上述獲得的細菌接到試管斜面中，劃線28°C培養(yǎng)一天后，4°C冰箱保存。5.鑒定和保藏經(jīng)鑒定，B43-1菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens),并于2012年6月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC No. 6212，其具體的鑒定如下(I)形態(tài)特征菌株在LB培養(yǎng)基上呈乳白色，半透明，表面褶皺。革蘭氏染色陽性，細胞呈桿狀，具運動性。
(2)生理生化特征其生理生化特征見表I。表I菌株B43-1的生理生化特征
權利要求
1.一種解淀粉芽抱桿菌，保藏名稱為Bacillus amyIoliquefaciens B43-1,于2012年6月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號=CGMCCNo.6212。
2.權利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌在抑制異形枝葡孢、毛霉、木霉和鏈孢霉中任意一種或多種病原真菌引起的食用菌病害上的應用。
3.—種純生物菌株培養(yǎng)物，其特征在于，該純生物菌株培養(yǎng)物中具有保藏號為CGMCCNo. 6212的解淀粉芽孢桿菌或/和保藏號為CGMCC No. 6212的解淀粉芽孢桿菌抑制異形枝葡孢、毛霉、木霉和鏈孢霉中任意一種或多種病原真菌活性的所有鑒定特征的突變體。
4.權利要求3所述的純生物菌株培養(yǎng)物在抑制異形枝葡孢、毛霉、木霉和鏈孢霉中任意一種或多種病原真菌引起的食用菌病害上的應用。
5.一種含有純生物菌株培養(yǎng)物的生物制劑，其特征在于，該純生物菌株培養(yǎng)物中具有保藏號為CGMCC No. 6212的解淀粉芽孢桿菌的菌株或/和保藏號為CGMCC No. 6212的解淀粉芽孢桿菌抑制異形枝葡孢、毛霉、木霉和鏈孢霉中任意一種或多種病原真菌活性的所有鑒定特征的突變體。
6.一種從純生物菌株培養(yǎng)物中分離得到的代謝物，其特征在于，該純生物菌株培養(yǎng)物中具有保藏號為CGMCC No. 6212的解淀粉芽孢桿菌的菌株或/和具有保藏號為CGMCCNo. 6212的解淀粉芽孢桿菌抑制異形枝葡孢、毛霉、木霉和鏈孢霉中任意一種或多種病原真菌活性的所有鑒定特征的突變體。
7.—種從純生物菌株培養(yǎng)物中分離得到的上清液，其特征在于，該純生物菌株培養(yǎng)物中具有保藏號為CGMCC No. 6212的解淀粉芽孢桿菌的菌株或/和具有保藏號為CGMCCNo. 6212的解淀粉芽孢桿菌抑制異形枝葡孢、毛霉、木霉和鏈孢霉中任意一種或多種病原真菌活性的所有鑒定特征的突變體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)B43-1，其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2012年6月8日，保藏號CGMCC No.6212。本發(fā)明公開的解淀粉芽孢桿菌B43-1的發(fā)酵上清液能夠抑制異形枝葡孢、毛霉、木霉、鏈孢霉等多種病原真菌引起的食用菌病害。解淀粉芽孢桿菌B43-1對人畜無毒，綠色環(huán)保，防治食用菌污染病害效果顯著，具有良好的生物農(nóng)藥開發(fā)前景。
文檔編號A01N63/02GK102776146SQ201210294840
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月19日 優(yōu)先權日2012年8月19日
發(fā)明者任昂, 劉青海, 吳鳳禮, 師亮, 李夢嬌, 李芮, 穆大帥, 趙明文, 邱乙偉, 韓琴 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學