專(zhuān)利名稱(chēng)：天花粉蛋白生物改性工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種天花粉蛋白生物的改性工藝。
背景技術(shù)：
天花粉蛋白是一種堿性植物 蛋白，為白色或微黃色鱗片狀結(jié)晶，相對(duì)分子量24000Da，等電點(diǎn)9. 4，為一不含糖和磷酸基團(tuán)的簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)，天花粉蛋白水溶性不大，有引濕性，對(duì)光、熱不穩(wěn)定，不易被膜蛋白酶酶解，它具有多種生物活性，如引產(chǎn)抗孕、免疫抑制，并能抑制人艾滋病病毒(HIV)的復(fù)制和繁殖，引起藥界重視。但是由于天花粉蛋白的強(qiáng)抗原性(即異體排斥反應(yīng))，對(duì)艾滋病患者的肝臟損傷很大，并引起了患者的高燒、虛弱、炎癥等一系列副作用。因此對(duì)天花粉蛋白的改性、修飾、降解的研究引起界內(nèi)的極大關(guān)注。CN200710173408. 9公開(kāi)了天花粉蛋白衍生肽及其應(yīng)用，該專(zhuān)利公開(kāi)了三種天花粉蛋白衍生肽。CN200410074324. 6公開(kāi)了天花粉蛋白突變體及其編碼基因，天花粉蛋白突變體是天花粉蛋白的自N端的第55位酪氨酸和自N端的第78位天冬氨酸的兩個(gè)氨基酸殘基中至少一個(gè)突變。CN01103102. 6公開(kāi)了一種天花粉蛋白突變體及制備方法，產(chǎn)品是從天然天花粉蛋白基因經(jīng)突變改造后，通過(guò)合適的表達(dá)系統(tǒng)制備得到的。CN200310112768.X公開(kāi)了聚乙二醇化天花粉蛋白藥物及其制備方法。本發(fā)明由聚乙二醇和天花粉蛋白的N端通過(guò)胺鍵連接，且一個(gè)TCS分子結(jié)合一個(gè)聚乙二醇分子所組成。原則上，上述幾種工藝都可以將天花粉蛋白改性，然而，更有效降低天花粉蛋白毒副作用，擴(kuò)大天花粉蛋白的用途范圍，將對(duì)天花粉的發(fā)展產(chǎn)生積極影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠既能降低天花粉毒性又能提高其藥用范圍的天花粉蛋白生物改性工藝。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的1、中藥材栝樓根莖破碎與滅菌；2、谷物麩皮與粉末混合生成天花粉蟲(chóng)卵；3、天花粉幼蟲(chóng)培殖；4、天花粉蛆蟲(chóng)培育；5、天花粉蛆蟲(chóng)分離、清洗及滅活；6、天花粉蛆蟲(chóng)干燥；7、天花粉蛆蟲(chóng)包裝。具體步驟如下
(1)栝樓根莖破碎后進(jìn)行滅菌處理，備用；
(2)生成天花粉蟲(chóng)卵取1000-2000g谷物麩皮、200-100g栝樓糊狀物、IO-IOOg蛋白胨、IO-IOOg KH2PO4混合均勻成為天花粉蟲(chóng)卵培養(yǎng)液，保持溫度25-55°C，時(shí)間48_120h，生成蟲(chóng)卵；
(3)天花粉幼蟲(chóng)培殖配制天花粉幼蟲(chóng)培養(yǎng)液，分裝于20-25個(gè)三角瓶中，每瓶分別裝入前面培殖的蟲(chóng)卵，搖床1-10次/min，培育12-48h，生成含幼蛆培養(yǎng)液；(4)天花粉蛆蟲(chóng)培育配制天花粉蛆蟲(chóng)培育液，加入含幼蛆培養(yǎng)液進(jìn)行培育，培育出的天花粉蛆蟲(chóng)由乳白色變?yōu)槿辄S色，培育過(guò)程完成，培育參數(shù)PH=5. 5-8，攪拌速度I-IOr/min，溫度 25-45°C，通氣量 O. 5_20L/min，時(shí)間 72_240h ；
(5)天花粉蛆蟲(chóng)分離、清洗及滅活將培育液及培育出的天花粉蛆蟲(chóng)一起放入分離機(jī)中蟲(chóng)液分離，用純凈水漂洗，然后用熱純凈水噴淋天花粉蛆蟲(chóng)，天花粉蛆蟲(chóng)被滅活；
(6)天花粉蛆蟲(chóng)干燥滅活的天花粉蛆蟲(chóng)干燥，得到天花粉蛆蟲(chóng)成品。本發(fā)明以栝樓為原料，經(jīng)過(guò)蛆種繁殖、幼蟲(chóng)培殖和蛆蟲(chóng)培養(yǎng),生成天花粉蛆蟲(chóng),天花粉蛆蟲(chóng)蛋白質(zhì)不僅保留了天花粉蛋白的藥用功效，而且由于相對(duì)分子量由24000Da提高到86000Da，因此降低了天花粉蛋白的毒副作用，為天花粉蛋白的應(yīng)用提供了更廣闊的空間。本工藝過(guò)程簡(jiǎn)單實(shí)用，易于控制，節(jié)省能源，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述
實(shí)施例I:
(1)IOOOg新鮮栝樓塊莖用破碎機(jī)破碎成小塊，然后用磨漿機(jī)磨成糊狀；
(2)將上述栝樓糊狀物與1000-2000g麥麩、10-50gK2HP04、10_20g蛋白胨、10_20mL氨水混合并攪拌均勻，保持溫度25-38°C，時(shí)間48-240h，繁殖出蟲(chóng)卵，用孔徑O. I-2mm篩子分篩出蟲(chóng)卵；
(3)取IOOg 栝樓干粉、2-10g 葡萄糖、O. 2-1. Og 蛋白胨、O. 2-1. Og KH2PO4,O. 01-0. 05gMgS04,加入 O. 5-1. OL 去離子水，加熱 80-100 °C，時(shí)間 10_30min，冷卻至25-30°C，分裝至20-30個(gè)三角燒瓶中，每個(gè)瓶中裝入O. 1-0. 5g前面繁殖的蟲(chóng)卵，搖床l-100r/min，培殖12_48h，生成天花粉幼蛆；
(4)取500-1000g 栝樓干粉、20-100g 葡萄糖、10_20g 蛋白胨、10_20g KH2PO4'O. 1-0. 5gNaCl、0. 1-0. 5gZnS04，加入2-5L去離子水，混合均勻，加入含天花粉幼蛆培養(yǎng)液O. 5-1. OL進(jìn)行培育，培育的天花粉蛆蟲(chóng)由乳白色變?yōu)槿辄S色，培育過(guò)程完成；
培育參數(shù)PH=5. 5-8，攪拌速度l-10r/min，溫度25-45 °C，通氣量10_20L/min，時(shí)間120-240h ；
(5)將培養(yǎng)液及培育出的天花粉蛆蟲(chóng)放入離心機(jī)以轉(zhuǎn)速550-1250r/min分離出天花粉蛆蟲(chóng)，用10-20L純凈水漂洗2-3次，用80-100°C熱純凈水噴淋天花粉蛆蟲(chóng)Ι-lOmin，天花粉蛆蟲(chóng)被滅活；
(6)滅活的天花粉蛆蟲(chóng)用真空冷凍干燥機(jī)在溫度-3(T30°C、真空度50-200kPa、時(shí)間5-24h，干燥至含水分5-8%得到天花粉蛆蟲(chóng)成品，天花粉蛆蟲(chóng)含量為90% ；
(7)干燥的天花粉蛆蟲(chóng)用鋁塑真空包裝袋包裝。實(shí)施例2:
(1)IOOOg干燥栝樓莖塊用粉碎機(jī)以250-1250r/min粉碎至O. 05-0. 5mm,并用O. 05-0. 2mm孔徑篩子分篩，收集粉末狀物料；
(2)粉末狀物料加入5-20L純凈水?dāng)嚢杈鶆虺珊隣钗铮?br> (3)糊狀物在80-120°C殺菌10-30min，然后降溫至25_30°C備用；
(4)取IOOg谷糠、20-50g糊狀物、5-10g蛋白胨、5-10gKH2PO4混合均勻，噴灑10_15mL純凈水，保持溫度25-55°C，時(shí)間48-120h，生成蟲(chóng)卵，用孔徑O. 1-2. Omm篩子篩出蟲(chóng)卵備用；
(5)取200-300g栝樓糊狀物、5-10g酵母抽提粉、2-5gNaCl、l-2mL氨水，加入O.5-1. OL純凈水混合均勻，分裝于20-25個(gè)三角瓶中，每瓶分別裝入O. 2-1. Og前面培殖的蟲(chóng)卵，搖床1-10次/min，培育12-48h，生成含幼蛆培養(yǎng)液；
(6)5-8L去離子水中加入1000-2000g栝樓莖塊粉、20_80g酵母抽提粉、2_5gK2S04、O. 01-0. 05gNaCl、20-100gNa2HP04、0· 01-0. 05gCaCl2，攪拌均勻成培養(yǎng)液，用 10000-15000 高斯磁感強(qiáng)度處理培養(yǎng)液3-5min，處理2次后加入含幼蛆培養(yǎng)液500-1OOOmL進(jìn)行培育，培育出的天花粉蛆蟲(chóng)由乳白色變?yōu)槿辄S色，培育過(guò)程完成；
培育參數(shù)PH=5. 5-8，攪拌速度l-10r/min。溫度25_35°C，通氣量O. 5_20L/min，時(shí)間72-148h ；
(7)將培育液及培育出的天花粉蛆蟲(chóng)一起放入分離機(jī)中以轉(zhuǎn)速550-1250r/min蟲(chóng)液分 離，用10-20L純凈水漂洗2-3次，用80-100°C熱純凈水噴淋天花粉蛆蟲(chóng)Ι-lOmin，天花粉蛆蟲(chóng)被滅活；
(8)滅活的天花粉蛆蟲(chóng)用真空冷凍干燥機(jī)在溫度-3(T30°C、時(shí)間12-24h、真空度10-100kPa、干燥至含水分5-8%得到天花粉蛆蟲(chóng)成品，天花粉蛆蟲(chóng)含量為91% ；
(9)天花粉蛆蟲(chóng)用鋁塑真空包裝袋真空包裝。
權(quán)利要求
1.天花粉蛋白生物改性工藝，其特征在于所述工藝包括如下步驟 (1)栝樓根莖破碎后進(jìn)行滅菌處理，備用； (2)生成天花粉蟲(chóng)卵取1000-2000g谷物麩皮、200-100g栝樓糊狀物、IO-IOOg蛋白胨、IO-IOOg KH2PO4混合均勻成為天花粉蟲(chóng)卵培養(yǎng)液，保持溫度25-55°C，時(shí)間48_120h，生成蟲(chóng)卵； (3)天花粉幼蟲(chóng)培殖配制天花粉幼蟲(chóng)培養(yǎng)液，分裝于三角瓶中，每瓶分別裝入前面培殖的蟲(chóng)卵，搖床1-10次/min，培育12-48h，生成含幼蛆培養(yǎng)液； (4)天花粉蛆蟲(chóng)培育配制天花粉蛆蟲(chóng)培育液，加入含幼蛆培養(yǎng)液進(jìn)行培育，培育出的天花粉蛆蟲(chóng)由乳白色變?yōu)槿辄S色，培育過(guò)程完成，培育參數(shù)PH=5. 5-8，攪拌速度I-IOr/min，溫度 25-45°C，通氣量 0. 5_20L/min，時(shí)間 72_240h ； (5)天花粉蛆蟲(chóng)分離、清洗及滅活將培育液及培育出的天花粉蛆蟲(chóng)一起放入分離機(jī)中 蟲(chóng)液分離，用純凈水漂洗，然后用熱純凈水噴淋天花粉蛆蟲(chóng)，天花粉蛆蟲(chóng)被滅活； (6)天花粉蛆蟲(chóng)干燥滅活的天花粉蛆蟲(chóng)干燥，得到天花粉蛆蟲(chóng)成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的天花粉蛋白生物改性工藝，其特征在于所述谷物麩皮為麥麩或谷糠。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的天花粉蛋白生物改性工藝，其特征在于所述天花粉幼蟲(chóng)培養(yǎng)液由 IOOg 括樓干粉、2-10g 葡萄糖、0. 2-1. Og 蛋白胨、0. 2-1. Og KH2P04、0. 01-0. 05gMgS04、0.5-1. OL去離子水混合而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的天花粉蛋白生物改性工藝，其特征在于所述天花粉幼蟲(chóng)培養(yǎng)液由200-300g栝樓糊狀物、5-10g酵母抽提粉、2-5gNaCl、l-2mL氨水、0. 5-1. OL純凈水混合rfu 。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的天花粉蛋白生物改性工藝，其特征在于所述天花粉蛆蟲(chóng)培育液由 500-1000g 栝樓干粉、20-100g 葡萄糖、10-20g 蛋白胨、10-20g KH2P04、0. 1-0. 5gNaCl、0.1-0. 5gZnS04、2-5L去離子水混合而成。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的天花粉蛋白生物改性工藝，其特征在于所述天花粉蛆蟲(chóng)培育液由5-8L去離子水中、1000-2000g栝樓莖塊粉、20_80g酵母抽提粉、2_5gK2S04、0.01-0. 05gNaCl、20-100gNa2HP04、0. 01-0. 05gCaCl2 混合而成。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的天花粉蛋白生物改性工藝，其特征在于所述培育參數(shù)為pH=5. 5-8，攪拌速度 l-10r/min，溫度 25_35°C，通氣量 0. 5_20L/min，時(shí)間 72_148h。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的天花粉蛋白生物改性工藝，其特征在于所述培育參數(shù)為pH=5. 5-8，攪拌速度 l-10r/min，溫度 25_45°C，通氣量 10_20L/min，時(shí)間 120_240h。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的天花粉蛋白生物改性工藝，其特征在于所述培養(yǎng)液及培育出的天花粉蛆蟲(chóng)放入離心機(jī)以轉(zhuǎn)速550-1250r/min分離出天花粉蛆蟲(chóng)，用10-20L純凈水漂洗2-3次，用80-100°C熱純凈水噴淋天花粉蛆蟲(chóng)1-lOmin，天花粉蛆蟲(chóng)被滅活。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的天花粉蛋白生物改性工藝，其特征在于所述滅活的天花粉蛆蟲(chóng)用真空冷凍干燥機(jī)在溫度-3(T30°C、時(shí)間12-24h、真空度10-100kPa、干燥至含水分5~8%得到天花粉姐蟲(chóng)成品。
全文摘要
天花粉蛋白生物改性工藝，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的目的是提供一種能夠既能降低天花粉毒性又能提高其藥用范圍的天花粉蛋白生物改性工藝，包括如下步驟(1)栝樓根莖破碎、滅菌；(2)生成天花粉蟲(chóng)卵；(3)天花粉幼蟲(chóng)培殖；(4)天花粉蛆蟲(chóng)培育；(5)天花粉蛆蟲(chóng)分離、清洗及滅活；(6)天花粉蛆蟲(chóng)干燥。本發(fā)明以栝樓為原料，經(jīng)過(guò)蛆種繁殖、幼蟲(chóng)培殖和蛆蟲(chóng)培養(yǎng)，生成天花粉蛆蟲(chóng)，天花粉蛆蟲(chóng)蛋白質(zhì)不僅保留了天花粉蛋白的藥用功效，而且降低了天花粉蛋白的毒副作用，為天花粉蛋白的應(yīng)用提供了更廣闊的空間。本工藝過(guò)程簡(jiǎn)單實(shí)用，易于控制，節(jié)省能源，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A01K67/033GK102792923SQ20121031567
公開(kāi)日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月31日
發(fā)明者徐華民, 趙榮華, 趙艷琨, 徐萌 申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)