一個(gè)高粱蠟質(zhì)合成調(diào)控基因及其在擬南芥植株中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明主要提供了一個(gè)高粱蠟質(zhì)合成調(diào)控基因，其核苷酸序列如文中SEQ?ID?NO：1所示，還涉及了該基因在擬南芥植株中的應(yīng)用。轉(zhuǎn)化所述基因的擬南芥，其葉片蠟質(zhì)更厚，葉片有光澤，具有抗旱、抗病蟲害等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一個(gè)高粱蠟質(zhì)合成調(diào)控基因及其在擬南芥植株中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一個(gè)高粱蠟質(zhì)合成調(diào)控基因，還涉及該基因在模式植物擬南芥中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]植物表皮細(xì)胞的外面有一層結(jié)構(gòu)，稱為角質(zhì)層。角質(zhì)層為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有蠟質(zhì)填充其間，這些填充在角質(zhì)層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)的蠟層被稱為內(nèi)蠟質(zhì)層；在角質(zhì)層外形成只有蠟質(zhì)成分的結(jié)構(gòu)，為外蠟質(zhì)層，外蠟質(zhì)層一般會(huì)形成自我組裝的蠟質(zhì)晶體。研究表明:被蠟質(zhì)填充的角質(zhì)層能夠降低通過植物表面的水分散失，提高植物的抗旱性。角質(zhì)層還在防止紫外線輻射傷害、抵抗病蟲害的侵入方面起重要作用，此外，角質(zhì)層的蠟質(zhì)含量與花粉育性和一些農(nóng)藝性狀表現(xiàn)有關(guān)。
[0003]為獲得能顯著提高農(nóng)作物蠟質(zhì)含量的基因，我們選用了蠟質(zhì)含量較高的高粱為材料，進(jìn)行臘質(zhì)合成相關(guān)基因的克隆。聞梁屬于禾本科，聞梁屬，I年生草本，植株表面常覆有明顯的蠟質(zhì)成分，使其具有廣泛的適應(yīng)性和較強(qiáng)的抗逆能力，是用于蠟質(zhì)相關(guān)優(yōu)良基因鑒定的理想材料。我們以擬南芥中調(diào)控臘質(zhì)合成的基因WINl的序列為參考序列，克隆了聞梁中的相應(yīng)同源基因，命名為SbWINl，并通過基因工程操作，將其轉(zhuǎn)到擬南芥中，并處于組成型超表達(dá)啟動(dòng)子35S的控制下。表型鑒定的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片的蠟質(zhì)含量明顯增加，葉 片有光澤。采用掃描電鏡對(duì)其進(jìn)行深度形態(tài)學(xué)掃描，結(jié)果表明，葉片表面的蠟質(zhì)晶體成分明顯增多，高粱SbWINl基因具有顯著提高植物表面蠟質(zhì)成分的能力，是進(jìn)行農(nóng)作物蠟質(zhì)性狀改良的一個(gè)重要候選基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一個(gè)高粱蠟質(zhì)合成調(diào)控基因，以及該基因在擬南芥蠟質(zhì)成分性狀改變中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一個(gè)高粱蠟質(zhì)合成調(diào)控基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示:
[0006]AUGGUACAGCCMAGMGUUUOGUGGAGUCOGGCAGCGCCACUGGGGUUCCUGGGUCUCOGAGAUCAGGCAUCCCC
[0007]UCCUUMGAGGAGGGUCUGGCUGGGCACCUUOGAGACOGCUGAGGAGGCAGCGAGAGCAUAUGAOGAGGCUGCOGU
[0008]GCUGAUGAGCGGCOGCMOGCCMGACCMCUUCCOGGUCCMAGGAGCAGCACAGGGGAGCCMCCCCAGCUGCG
[0009]GGMGGGAOGCUCACAGCMOGCOGGCAGCGGCUCCUCUACOGCCMCCUGUCCCAGAUUCUCAGUGCGMGCUCC
[0010]GCMAUGCUGCMGGCGCCAUOGCCCUCCCUGACCUGUCUCOGCCUUGACCCUGAGMGUCCCACAUUGGUGUUUG[0011 ] GCAGMGCGUGCAGGAGCCOGUGCUGACUCCMCUGGGUCAUGACOGUGGAGCUCMCMAGGUGCAGCAUCCACU
[0012]GAU(m^AUCACAGUO:ACAUCAa:MCMCUGCUCCACCAGCCACCCOGAUGGAUGAOGAGGAGAGGAUOGCCC
[0013]UGCMAUGAUOGMGAGUUGCUGAGCAGCAGCAGCCCAGCUUCACCCUOGCAOGGAGAUGACCMGGUOGCUUCAU
[0014]CAUCUGA
[0015]SEQ ID NO: I[0016]所述基因根據(jù)擬南芥AtWINl基因的序列，通過同源序列比對(duì)獲得高粱的SbWINl基因序列，通過擴(kuò)增、連接、植物轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)操作而獲得。具體如下:
[0017]采用生物信息學(xué)的方法，獲得SbWINl基因序列。利用PRMER5設(shè)計(jì)引物用于擴(kuò)增開放閱讀框序列。提取高粱BTX623莖桿的RNA，將I μ g的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA作為擴(kuò)增的模板備用。用設(shè)計(jì)的特異引物進(jìn)行擴(kuò)增。將擴(kuò)增的產(chǎn)物連接到克隆載體上。轉(zhuǎn)入大腸桿菌，篩選陽性的進(jìn)行測(cè)序，獲得SEQ ID NO:1所示的基因序列。
[0018]將上述克隆到的基因連接到超表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片蠟質(zhì)比普通的要厚，葉片有光澤。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1野生型擬南芥； [0020]圖2是含有本發(fā)明序列表中序列I基因的擬南芥；
[0021]圖3野生型擬南芥的掃描電鏡圖；
[0022]圖4是含有本發(fā)明序列表中序列I基因的擬南芥電鏡掃描圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面以高粱的莖桿作為試驗(yàn)材料詳細(xì)說明制備方法。
[0024]1.總RNA的提取采用TIANGEN試劑盒，操作步驟如試劑盒說明所示。得到RNA溶液后瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質(zhì)量，-80°C保存。
[0025]2.cDNA 的合成:cDNA 的合成使用 Invitrogen 的 SuperScript? III First-StrandSynthesis System for RT-PCR,步驟如下:
[0026]I)取0.5ml滅菌微量離心管，分別加入以下成分:總RNA ；01igl dT ；10mM dNTP?；靹颍p甩離心管，使溶液至底部；
[0027]2)離心管置于水浴鍋內(nèi)，65°C保溫5min ；
[0028]3)迅速取出置于冰上冷卻Imin以上，將離心管輕微離心；
[0029]4)在上述離心管中加入下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液:5XFirst-strand Buffer ；0.1M DTT ；Recombinant RNase Inhibitor ；SuperScript? III RT ；
[0030]5)輕微震蕩混勻后短暫離心；
[0031]6)50°C保溫 50min ;
[0032]7) 70 保溫 15min，-20 °C 保存。
[0033]高梁β-Actin F (GenBank accession N0.X79378)檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。PCR 擴(kuò)增程序:94°C 4min，35 個(gè)循環(huán)的程序?yàn)?95°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s，最后 72°C 5min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0034]3.SbffINl 的分離
[0035]PCR擴(kuò)增引物采用“Primer 5.0”引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，并對(duì)得到的引物序列用VectorNTI進(jìn)行分析，找出解鏈溫度，自身互補(bǔ)性，兩引物互補(bǔ)性合適的引物對(duì)。cDNA為模板，SbAGL6-F、SbAGL6-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為:反應(yīng)總體系50 μ 1，包括反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，IOXphushion HF buffer, 10mmol/T, dNTPs, IOmM 基因特異引物，phusionDNA聚合酶，DMS0，剩余用水補(bǔ)齊。PCR擴(kuò)增程序:98°C lmin，35個(gè)循環(huán)的程序?yàn)?8°C 10s，47°C 20s, 72°C 30s，最后72°C IOmin0本試驗(yàn)PCR擴(kuò)增選用的是NEB公司的PhusionDNA聚合酶。
[0036]4.PCR產(chǎn)物的加A連接
[0037]利用Phusion DNA聚合酶產(chǎn)生的克隆片段為平末端，在進(jìn)行TA克隆之前，可用另一種聚合酶Taq酶在平末端PCR產(chǎn)物末端進(jìn)行加A。加入PCR回收產(chǎn)物、5XTaq buffer、IOmM dATP、Taq酶，72°C保持15分鐘，取出2μ I加A后的PCR回收產(chǎn)物加入2 X T4連接酶緩沖液、pGEM-T easy 載體(50ng/μ I)、T4DNA 連接酶(3υ/μ I)連接到 pGEM-Teasy 載體上，pGEM-T easy載體購(gòu)自Promega公司。
[0038]5.連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
[0039]I)從_80°C冰箱中取出I管(50 μ I)感受態(tài)細(xì)胞，置冰上。
[0040]2)用預(yù)冷的無菌吸頭向管中加入2μ I連接反應(yīng)物，輕輕搖勻，置冰上30分鐘。[0041 ] 3) 42 V水浴熱激60秒，迅速置冰上5分鐘。
[0042]4)向離心管中加入SOC液體培養(yǎng)基，混勻后37°C振蕩培養(yǎng)lh。
[0043]5)室溫下8000rpm離心5分鐘，棄掉上清液，將剩余上清液重新懸浮菌體，用涂布器將其均勻涂到X-gal+IPTG+Amp的平板上，放置30分鐘。
[0044]6)倒置平板于37°C恒溫培養(yǎng)箱中過夜，待出現(xiàn)明顯單菌落時(shí)拿出。
[0045]7)放入4 V冰箱數(shù)小時(shí)，使藍(lán)白斑顏色分明。
[0046]6.重組質(zhì)粒的PCR`鑒定
[0047]本實(shí)驗(yàn)所用的pGEM-T載體的插入片段上游有T7引物，下游有SP6引物和M13引物，所以可以用這三個(gè)啟動(dòng)子序列做引物對(duì)插入片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，鑒定程序如下:PCR擴(kuò)增體系包括10 X buffer (含MgCl2), dNTP 10mmol/L, T7和SP6引物(20ng/y l)，Taq酶，模板為轉(zhuǎn)化后的白色菌斑。反應(yīng)條件為:94°C，10min ;35個(gè)循環(huán):94°C，30s ； 56 °C, 30s ；72°C,2min ;72°C延伸5min。最后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用I %瓊脂糖電泳檢測(cè)，選擇合適大小的陽性克隆測(cè)序。測(cè)序在華大基因測(cè)序部完成。
[0048]表達(dá)載體的構(gòu)建:根據(jù)SbWINl基因的ORF序列，將Gateway技術(shù)中的AttB位點(diǎn)加入原始引物序列，從陽性克隆的質(zhì)粒中擴(kuò)增出ORF片段，用于構(gòu)建表達(dá)載體。
[0049]7.帶有attB位點(diǎn)的基因序列的擴(kuò)增
[0050]以通過測(cè)序鑒定的質(zhì)粒為模板SbWINlF，SbWINIR，為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0051]PCR擴(kuò)增體系為:反應(yīng)總體系包括反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，IOXphushion HF buffer, IOmmol/LdNTPs，10mM基因特異引物，phusion DNA聚合酶，DMS0，剩余用水補(bǔ)齊。PCR擴(kuò)增程序:98°C 30s，35 個(gè)循環(huán)的程序?yàn)?98°C 10s,60°C 30s, 72°C lmin，最后 72°C 5min。50 μ I 全部點(diǎn)樣，瓊脂糖電泳后回收PCR產(chǎn)物。
[0052]8.入門載體的構(gòu)建
[0053]利用得到的Sb-WINl產(chǎn)物和pDONR(amp)進(jìn)行BP反應(yīng)，Sb-WINl基因編碼序列將pDONR(amp)載體上的ccdB位點(diǎn)置換，構(gòu)建成氨芐青霉素抗性的入門載體。將BP反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5ci后，用氨芐青霉素進(jìn)行篩選。將轉(zhuǎn)化所得的菌斑搖菌提質(zhì)粒，保存進(jìn)行菌落PCR鑒定，pDONR(amp)載體上游有T7引物和SbAGL6R引物，以轉(zhuǎn)化所得質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR鑒定。對(duì)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。BP反應(yīng)體系包括PCR產(chǎn)物、pDONR(amp) vector、BP clone II enzyme、dd H2O0[0054]9.表達(dá)載體的構(gòu)建
[0055]將鑒定正確的質(zhì)粒連接到pGWB14表達(dá)載體上，進(jìn)行轉(zhuǎn)化和酶切檢測(cè)，將鑒定正確的菌液送到華大基因公司測(cè)序。LR反應(yīng)體系包括BP質(zhì)粒、pGWB14vector、LR clone11enzyme> dd H2O0
[0056]10.重組質(zhì)粒pKIGW-SbWINl農(nóng)桿菌的電擊轉(zhuǎn)化
[0057]①取50 μ I的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞于冰上融化，加入2 μ I已構(gòu)建好的質(zhì)粒DNA，輕柔混勻，冰上放置半小時(shí)。 [0058]②將①中的混合物轉(zhuǎn)入電擊杯中，電擊杯提前預(yù)冷。
[0059]③用細(xì)胞融合儀進(jìn)行電擊。
[0060]④電擊結(jié)束后立即加入不含抗生素的SOC培養(yǎng)基中，混勻后移入2ml離心管中，28°C下震蕩培養(yǎng)2h。
[0061]⑤8000rpm，離心5min，棄上清，剩余菌液涂在含有卡那霉素、大觀霉素、慶大霉素的固體LB平板上，28 °C下倒置，培養(yǎng)2天。
[0062]11.PCR驗(yàn)證和菌種保存
[0063]挑取培養(yǎng)基上的單菌落，作菌落PCR篩選單克隆。將鑒定正確的單克隆，液氮速凍，-80°C保存以備用。
[0064]12.將活化后的囷液取Iml于200ml接種于含有卡那霉素、大觀霉素、慶大霉素的液體LB培養(yǎng)基中，280C，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600 = 0.8~0.9。
[0065]將上述菌液5000rpm離心8min,用5% (w/v)鹿糖溶液懸浮菌體,使0D_ = 0.8~
0.9。將懸浮完菌體的蔗糖溶液中加入終濃度為0.02% Silwet L-77，將擬南芥花序浸入加了 Silwet L-77的鹿糖溶液中浸泡lmin。
[0066]把擬南芥用塑料袋套好，密封培養(yǎng)16-24小時(shí)后按常規(guī)方法培育植株到結(jié)實(shí)，收獲Ttl代種子。
[0067]13.擬南芥Ttl代種子篩選
[0068](I)將干燥2周后的Ttl代種子先用75%酒精消毒I分鐘，再用無菌水沖洗三遍。最后用無菌的槍頭將消毒后的種子點(diǎn)播在1/2MS選擇培養(yǎng)板(75mg/L卡那霉素)上。
[0069](2)4°C春化兩天后置于22°C、16h光照條件下，IOd后觀察其子葉和根的發(fā)育狀況，挑選轉(zhuǎn)化體，轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)為真葉健康呈深綠色，根長(zhǎng)至培養(yǎng)基里。于與轉(zhuǎn)入外源基因的植株能在含有卡那霉素的抗性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而非轉(zhuǎn)基因植株則不能正常生長(zhǎng)。IOd后，把生長(zhǎng)正常的擬南芥幼苗移栽到土中。當(dāng)植株長(zhǎng)到8~10葉時(shí)，提取幼嫩葉片基因組DNA，進(jìn)行PCR鑒定；通過鑒定的植株分單株收獲種子。
[0070]14.轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR鑒定
[0071]用SIGMA公司的Extract-N-Amp? Plant PCR Kits試劑盒對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行鑒定，步驟如下:
[0072](I)DNA提取:取0.5-0.7cm葉片組織到2ml離心管中，加入ExtractionSolution, 95°C保持 IOmin,加入 Dilution Solution, 2°C -8°C儲(chǔ)存以備用。
[0073](2) PCR 擴(kuò)增:PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系包括 ddH20、Extract-N-Amp PCR ReadymixUOmMPrimer F> IOmM Primer R、Leafdisk extract ;PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94°C 3min,30 個(gè)循環(huán)包括 94°C lmin、6(TC lmin、72°C lmin30sec，然后 72°C IOmin0[0074]15.轉(zhuǎn)基因植物的表型鑒定
[0075]直觀觀察結(jié)果可以明顯看到，轉(zhuǎn)基因的擬南芥具有光澤葉片。
[0076]16.掃描電鏡觀察葉片的結(jié)果:通過掃描電鏡的觀察我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的葉片上的蠟質(zhì)大量的增加了。
[0077]以上對(duì)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，不能被認(rèn)為用于限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。凡依本發(fā)明申請(qǐng)范圍所作的均等變化與改進(jìn)等，均應(yīng)仍歸屬于本發(fā)明的專利`涵蓋范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一個(gè)高粱蠟質(zhì)合成調(diào)控基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.權(quán)利要求1所示的基因，其特征在于:該基因序列與擬南芥AtWINl基因有很高的同源性，對(duì)其進(jìn)行克隆測(cè)序，經(jīng)基因工程操作，使其受控于組成型的啟動(dòng)子。
3.權(quán)利要求1或2所述的基因在擬南芥中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK103667306SQ201210316402
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年8月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月31日
【發(fā)明者】謝曉東, 孫守鈞, 包曙光, 羅峰, 丁博, 傅揚(yáng), 王銳 申請(qǐng)人:天津農(nóng)學(xué)院