專利名稱：一種維管組織特異表達(dá)啟動(dòng)子vsp1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種維管組織特異表達(dá)啟動(dòng)子VSPl及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
組織或器官特異性啟動(dòng)子，即在此類啟動(dòng)子的調(diào)控下，基因的表達(dá)僅限于某些特定的部位或者器官。這種特異性通常以特定的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和化學(xué)物理信號(hào)為存在基礎(chǔ)。用組織特異性啟動(dòng)子調(diào)控基因表達(dá)時(shí)，可使外源基因產(chǎn)物更有效地發(fā)揮作用，并降低對(duì)植物的負(fù)面影響。
目前已經(jīng)分離并得到了一些能在不同組織部位或者器官中特異表達(dá)的啟動(dòng)子。比如能夠在葉肉細(xì)胞特異啟動(dòng)的水稻來源的RbcS啟動(dòng)子；還有能夠在根部特異啟動(dòng)的煙草的TobRB7基因啟動(dòng)子；能夠在胚乳特異性啟動(dòng)表達(dá)的水稻中GluB-I基因啟動(dòng)子；能夠在花藥中特異啟動(dòng)表達(dá)的煙草TA29啟動(dòng)子、水稻0sg6B啟動(dòng)子等；能夠在維管組織木質(zhì)部特異啟動(dòng)表達(dá)的法國菜豆富含甘氨酸結(jié)構(gòu)基因Grpl. 8啟動(dòng)子；能夠在維管組織韌皮部特異啟動(dòng)表達(dá)的擬南芥H+-ATP酶基因3 (Ha3)啟動(dòng)子等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種維管組織特異表達(dá)啟動(dòng)子VSPl及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的ー種DNA片段，為如下I) -3)中任一所述的DNA分子I)序列表的序列I自5’末端第7-4753位核苷酸所不的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與I)所不DNA分子雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；3)與I)中所示DNA分子具有90%以上同源性且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65° C下雜交，然后用2 X SSC, O. 1%SDS 和 I X SSC, O. 1%SDS 各洗膜一次。含有上述DNA片段的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。擴(kuò)增上述DNA片段全長或其任意片段的引物對(duì)也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述DNA片段在使目的基因在植物組織中表達(dá)中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述應(yīng)用中，所述植物組織為植物葉、莖和/或根的維管組織。在本發(fā)明的實(shí)施例中目的基因?yàn)镚US基因，其核苷酸序列為序列表中序列I自5’末端第4760-6567位核苷酸。上述應(yīng)用中，所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。上述應(yīng)用中，所述雙子葉植物為擬南芥或棉花，所述單子葉植物為水稻或者小麥。上述DNA片段在植物的遺傳育種中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；上述應(yīng)用中，所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物進(jìn)ー步具體為擬南芥或棉花，所述單子葉植物進(jìn)ー步具體為水稻。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供ー種新型的維管組織特異表達(dá)的啟動(dòng)子VSP1，將VSPl啟動(dòng)子與報(bào)告基因GUS相連，用帶有該融合基因的載體轉(zhuǎn)化擬南芥、水稻及棉花，該啟動(dòng)子能夠在擬南芥、棉花、水稻等植物根、莖、葉的維管組織中特異地啟動(dòng)基因表達(dá)，證明在轉(zhuǎn)基因植株中該啟動(dòng)子能夠特異性地在維管組織中啟動(dòng)⑶S基因表達(dá)。


圖I為pBinl9- VSPl_GUS植物表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意2為TO代轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR鑒定結(jié)果圖3為TO代轉(zhuǎn)基因水稻的PCR鑒定結(jié)果圖4為TO代轉(zhuǎn)基因棉花的PCR鑒定結(jié)果圖5為TO代轉(zhuǎn)基因擬南芥中⑶S基因的維管組織特異性表達(dá)圖6為TO代轉(zhuǎn)基因水稻中⑶S基因的維微管組織特異性表達(dá)圖7為TO代轉(zhuǎn)基因棉花中⑶S基因的維管組織特異性表達(dá)
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例I、VSPl啟動(dòng)子的克隆VSPl啟動(dòng)子來源于C3-C4中間型植物Flaveria anomala中甘氨酸脫羧酶(⑶C)P-蛋白亞基(gdcsP)基因的上游調(diào)控序列。將F. anomala基因文庫構(gòu)建于Lambda GEMlI。限制性酶切分析以及C-末端和N-端特異性探針雜交結(jié)果顯示基因庫中所得的所有克隆均具有類似的雜交圖譜，推斷F. anomala中g(shù)dcsP基因很可能僅僅含有一個(gè)拷貝。SouthernBlot以及以后的RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的確證明gdcsP基因?yàn)閱慰截?。在所有克隆中，克隆PFAG7含有全長基因，全片段(大約17kb)被直接克隆進(jìn)質(zhì)粒載體pBluescript SK_之中。通過亞克隆XhoI獲得約4. 7kb上游啟動(dòng)子片段，經(jīng)過測(cè)序，確定該片段具有序列表中序列I 自 5’末端第 7-4753 位核苷酸,該片段命名為 Vascular specific promoter-1 (VSPl) 實(shí)施例2、VSPl啟動(dòng)子的功能驗(yàn)證一、pBinl9-VSPl_GUS融合表達(dá)載體的構(gòu)建l、pBinl9-VSPl_GUS融合表達(dá)載體構(gòu)建序列I為⑶S的表達(dá)框(VSPl-GUS-CaMV)，包括啟動(dòng)子VSP1、基因⑶S和終止子CaMV (35S-ter)，其中自5，末端第l_6bp為BamHI酶切位點(diǎn)；7_4753bp為VSPl啟動(dòng)子；4754-4759bp 為 NcoI 酶切位點(diǎn)；4760_6567bp 為⑶S 基因；6568_6802bp 為 35S 終止子 ocs序列(CaMV) ；6803-6808bp 為 NcoI 酶切位點(diǎn)；6809_6814bp 為 BamHI 酶切位點(diǎn)。將序列I插入雙元載體pBinl9(購自Clontech公司；該載體的構(gòu)建方法的文章如P Bevan Μ. (1984)Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucleic
Acids Res. 12:871-18721，該載體上沒有啟動(dòng)子和終止子。)的BamHI酶切位點(diǎn)，得到重組載體，經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證正確。將該重組載體命名為pBinl9-VSPl-GUS，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖I所
/Jn ο2、pBinl9-GUS表達(dá)載體(對(duì)照重組載體)構(gòu)建將序列I自5’末端第4760-6802位核苷酸(⑶S-CaMV)插入雙元載體pBinl9的BamHI酶切位點(diǎn)，得到對(duì)照重組載體，經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證正確。將該對(duì)照重組載體命名為pBinl9-GUS0ニ、pBinl9-VSPl_GUS融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物l、pBinl9-VSPl_GUS融合表達(dá)載體對(duì)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化I)、農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備接種農(nóng)桿菌GV3101 (購自Biovector中國質(zhì)粒載體菌株基因庫，貨號(hào)為Biovector-375)單菌落于50ml YEP培養(yǎng)基中，28 °C振蕩培養(yǎng)，至OD6tltl為O. 5，冰浴30分鐘，5000rpm離心5分鐘，收集菌體，重懸于IOml O. 5M NaCl中；再次離心，菌體重懸于Iml 20mM CaCl2溶液中；取50 μ I菌液分裝到I. 5ml離心管中，_80°C保存。2)、質(zhì)粒對(duì)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化取2μ I的上述質(zhì)粒pBinl9-VSPl_GUS，加到50 μ I上述感受態(tài)菌(GV3101)中，混勻后冰浴30分鐘，在液氮中速凍5分鐘，37 °C熱激5分鐘，カロ 入ImlYEP培養(yǎng)液，28 °C培養(yǎng)4小時(shí)，將菌液涂布在含有50 μ g/ml利福霉素、50μ g/ml卡那霉素的平板上，28°C培養(yǎng)2天。待長出菌落后，取單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，引物為GUS-FTACCCGTCCGCAAGTGCACG (序列 2)、⑶S-R GCGAGGTCGCAAAATCGGCG (序列 3);擴(kuò)增出 450bp片段即為陽性，將該陽性菌命名為GV3101/pBinl9-VSPl-GUS。2、pBinl9-VSPl_GUS融合表達(dá)載體農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化植物I) pBinl9-VSPl_GUS融合表達(dá)載體農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥取200 μ I GV3101/pBinl9-VSPl-GUS加入到5mlYEP液體培養(yǎng)基(含有50 μ g/ml利福平、50 μ g/ml卡那霉素)中，28°C過夜培養(yǎng)。取過夜培養(yǎng)的菌液2ml，加入到裝有250mlYEP液體培養(yǎng)基(含有50 μ g/ml利福平、50 μ g/ml卡那霉素)的500ml三角瓶中，28°C過夜培養(yǎng)，直到菌液0D_為O. 8吋，5000r/min離心10分鐘，棄去上清液，將菌體在50ml5%蔗糖水溶液中懸起，在轉(zhuǎn)化植株之前向懸液中加入O. 05%含量(V/V)的silwet表面活性劑。將野生型擬南芥(Arabidopsis, col-O,購自The European ArabidopsisStock Centre (NASC), N1092)植株的花浸入到上述農(nóng)桿菌懸浮液中約10秒，隨后將浸花后的植株用塑料蓋子蓋上，溫室(20°C，16小時(shí)日照)培養(yǎng)24小時(shí)后取下蓋子。培養(yǎng)植物直到收集種子，得到TO代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子。將收集到的TO代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子烘干，保存于4°C條件。在無菌工作臺(tái)上進(jìn)行以下操作，取適量種子放于EP管中，加入75%こ醇，渦旋I分鐘，棄去75%こ醇，用無菌水洗一遍，加入含有10%次氯酸鈉的溶液，充分渦旋5分鐘，旋轉(zhuǎn)EP管20分鐘以便充分滅菌。靜置后棄去上清液，用無菌水洗4適。將洗過的種子在無菌水中懸起，均勻鋪在含有50 μ g/ml卡那霉素的1/2MS固體培養(yǎng)基上，在無菌工作臺(tái)中吹干表面水分，使用封ロ膜將平板封閉，放入溫室(20°C，16小時(shí)日照)培養(yǎng)。在培養(yǎng)數(shù)天后，陽性植株會(huì)逐漸長出真葉并有較發(fā)達(dá)的根系，而陰性植株會(huì)呈矮小狀態(tài)并最終死亡。這樣就可以達(dá)到初步篩選的目的，隨后，將初步篩選的苗子移栽到營養(yǎng)土中，溫室培養(yǎng)，得到抗性陽性TO代轉(zhuǎn)基因擬南芥。2)、pBinl9-VSPl_GUS融合表達(dá)載體農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化棉花(I)、挑取 GV3101/pBinl9-VSPl-GUS 單菌落，接種于 20ml 含 50mg/L 卡那霉素、50mg/L利福平和30mg/L鏈霉素的YEP培養(yǎng)基中，28。C、280rpm過夜培養(yǎng)至0D600為0. 7 0. 8。5000rpm離心,用MS液體培養(yǎng)基重新懸浮,與野生型棉花(中棉24,購自中國農(nóng)科院棉花研究所科技貿(mào)易公司)愈傷組織共侵染10分鐘。
(2)、將愈傷組織用無菌吸水紙吸干，放置于MS培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2 3天后，用無菌水將外植體洗浄，轉(zhuǎn)到含有100 μ g/ml頭孢霉素，75 μ g/ml卡那霉素的分化培養(yǎng)基中，在12小時(shí)光照，12小時(shí)黑暗的條件下，繼續(xù)培養(yǎng)至分化出小芽。(3)、待芽長到2cm后，用無菌剪刀和鑷子將分化的芽剪下，插到生根培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)4周左右，移栽到土壤中，得到TO代轉(zhuǎn)基因棉花。在TO代轉(zhuǎn)基因棉花單株幼苗長出3 4片真葉吋，對(duì)其進(jìn)行了卡那霉素葉片涂抹初篩實(shí)驗(yàn)。卡那霉素的濃度分別為1.0%(w/v)。涂抹5天后進(jìn)行觀察，淘汰顯癥(葉片涂抹點(diǎn)變黃)單株后進(jìn)行第二輪篩選，如此連續(xù)涂抹三次，選出三次不顯癥單株，進(jìn)入下ー步篩選，得到抗性陽性TO代轉(zhuǎn)基因棉花。3)、pBinl9-VSPl_GUS融合表達(dá)載體農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻
(I)挑取 GV3101/pBinl9-VSPl-GUS 單菌落，接種于 20ml 含 50mg/L 卡那霉素、50mg/L利福平和30mg/L鏈霉素的YEP培養(yǎng)基中，28。C、280rpm過夜培養(yǎng)至0D600為O. 7 O. 8。把菌液倒入I. 5ml的離心管中7，OOOrpm離心5分鐘。棄掉上清，加入N6-AS液體培養(yǎng)基重懸菌細(xì)胞。用N6-AS液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，用分光光度計(jì)測(cè)濃度，最適OD6c 值隨農(nóng)桿菌菌株和載體(有吋)變化很大，最適值是指三天內(nèi)共培養(yǎng)，農(nóng)桿菌細(xì)胞不會(huì)過多生長。(2)野生型水稻(日本睛，學(xué)名是 Oryza. Sativa L. spp. japonica, varnipponbare,記載在蔣云洪，日本睛水稻高產(chǎn)栽培技術(shù)，山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，1981年第2期中，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。)愈傷組織和細(xì)菌細(xì)胞(可在50ml的消毒錐形管中進(jìn)行)混合，用手輕搖3分鐘，愈傷組織與細(xì)菌溶液的比值不是影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素，15毫升的細(xì)菌懸浮液中可有幾克愈傷組織。(3)倒出細(xì)菌溶液，把愈傷組織轉(zhuǎn)移到無菌試紙上以去除多余的液體。把含有愈傷組織的試紙放在N6-AS半固體培養(yǎng)基上。每100x20mm的培養(yǎng)皿含20ml的N6-AS，然后用醫(yī)用膠帶封ロ。22°C暗中共培養(yǎng)愈傷組織和細(xì)菌細(xì)胞6天，在N6培養(yǎng)基(添加250ug/ml羧芐青霉素或頭孢噻肟和3ug/ml雙丙氨膦)上次繼代培養(yǎng)愈傷組織16天，抗雙丙氨膦的愈傷組織在第二次抗性選擇的后期應(yīng)該能清楚的分辨出來，非轉(zhuǎn)化的野生型愈傷組織被篩選劑殺死，如果第二次選擇分不清楚抗性愈傷組織需要進(jìn)行第三次選擇。(4)轉(zhuǎn)基因植物的再生把獨(dú)立的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到N6-R植物再生培養(yǎng)基中，每100x20mm的培養(yǎng)皿包含30ml的N6-R培養(yǎng)基，每培養(yǎng)皿10個(gè)愈傷組織，培養(yǎng)皿用醫(yī)用膠帶封ロ。在冷熒光燈下28°C培養(yǎng)愈傷組織直到看到芽和根的形成，兩周之內(nèi)應(yīng)該形成芽。把小苗轉(zhuǎn)移到含30mlMS-F培養(yǎng)基的盒子中，在冷熒光燈下28°C培養(yǎng)小苗14天。把幼苗轉(zhuǎn)移到盆里，在溫室中培養(yǎng)，得到抗性陽性TO代轉(zhuǎn)基因水稻。三、轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定I、轉(zhuǎn)基因植株總DNA提取抗性陽性TO代轉(zhuǎn)基因水稻和抗性陽性TO代轉(zhuǎn)基因擬南芥用普通CTAB法進(jìn)行總DNA提取；而抗性陽性TO代轉(zhuǎn)基因棉花的總DNA提取方法如下(I)試劑配制表I為提取緩沖液(buffer I)的配方
權(quán)利要求
1.ー種DNA片段，為如下I) -3)中任一所述的DNA分子 1)序列表的序列I自5’末端第7-4753位核苷酸所不的DNA分子； 2)在嚴(yán)格條件下與I)所示DNA分子雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子； 3)與I)中所示DNA分子具有90%以上同源性且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子。
2.含有權(quán)利要求I中所述DNA片段的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
3.擴(kuò)增權(quán)利要求I中所述DNA片段全長或其任意片段的引物對(duì)。
4.權(quán)利要求I所述DNA片段在使目的基因在植物組織中表達(dá)中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4中所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物組織為植物葉、莖和/或根的維管組織。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5中所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述雙子葉植物為擬南芥或棉花，所述單子葉植物為水稻。
8.權(quán)利要求I中所述DNA片段在植物的遺傳育種中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8中所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥或棉花，所述單子葉植物具體為水稻。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種維管組織特異表達(dá)啟動(dòng)子VSPl及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的DNA片段，為如下1)-3)中任一所述的DNA分子1)序列表的序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)所述DNA分子雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；3)與1)中所述DNA分子具有90%以上同源性且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供一種新型的維管組織特異表達(dá)的啟動(dòng)子VSPl，將VSPl啟動(dòng)子與報(bào)告基因GUS相連，用帶有該融合基因的載體轉(zhuǎn)化擬南芥，水稻及棉花，該啟動(dòng)子能夠在擬南芥、棉花、水稻等植物的維管組織中特異地啟動(dòng)基因表達(dá)。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102851294SQ20121032768
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月6日
發(fā)明者儲(chǔ)成才, 王義琴, 劉豐澤, 陳帥 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所